Summary
Interactions cellulaires paracrine et juxtacrine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Ici, une méthode de culture proximale est utilisée pour étudier la signalisation paracrine où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont entretenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.
Abstract
Les interactions intercellulaires jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Paracrine ou juxtacrine signalisation intervient dans ces interactions. L’utilisation d’un milieu conditionné et co-culture études sont les méthodes les plus courantes d’établir une distinction entre ces deux types d’interactions. Cependant, l’effet des concentrations élevées localisées des facteurs sécrétés dans le microenvironnement durant les interactions paracrines n’est pas précisément récapitulé par milieu conditionné et, par conséquent, peut conduire à des conclusions imprécises. Pour contourner ce problème, nous avons mis au point une méthode de culture proximal pour étudier la signalisation paracrine. Les deux types de cellules sont cultivées sur une surface d’une membrane de 10 µm d’épaisseur en polycarbonate avec 0,4 µm pores. Les pores permettent l’échange de facteurs sécrétés et, en même temps, inhibent juxtacrine signalisation. Les cellules peuvent être collectées et lysées au point de terminaison pour déterminer les effets de la signalisation paracrine. En plus de permettre des gradients de concentration localisées de facteurs sécrétés, cette méthode se prête aux expériences portant sur des périodes prolongées de la culture, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier les interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire et les cellules mésothéliales qu’ils rencontrent sur le site de la métastase, il peut être adapté à n’importe quel deux types de cellules adhérentes aux chercheurs d’étudier paracrine signalisation dans divers domaines, y compris développement, immunologie et microenvironnement tumoral.
Introduction
Le rôle des interactions réciproques productives entre cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral dans la progression tumorale a été clairement établi et est devenu un axe majeur de la recherche en biologie de cancer1. Des cas semblables de bidirectionnel de signalisation sont essentiels pendant la cicatrisation, les réponses immunitaires, angiogenèse, niches de cellules souches et développement2,3,4,5,6 , 7 , 8. un thème commun à tous ces processus biologiques, c’est que les cellules réagissent de différentes façons à des signaux extracellulaires de leur microenvironnement qui déterminent le sort de la cellule, physiologie des tissus et progression de la maladie. Par conséquent, l’accent a plus en plus tourné vers l’élaboration d’une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les communications de ces cellules. Une majorité de ces interactions impliquent paracrine ou juxtacrine de signalisation entre les cellules. Signalisation paracrine implique la sécrétion de facteurs de signalisation spécifiques par une cellule qui sont perçus par des récepteurs correspondants sur une autre cellule dans les environs, déclenchant une réaction dedans9,10, tandis que juxtacrine signalisation nécessite un contact direct entre les composants cellulaires des deux cellules impliqués11,12.
Cette signalisation est une composante essentielle dans l’homéostasie tissulaire, ainsi que dans le microenvironnement tumoral. Les cellules cancéreuses bénéficient de facteurs paracrines et juxtacrine des cellules dans le stroma tumoral, y compris les fibroblastes associés au cancer (CAFs), les cellules immunitaires et les adipocytes13,14,15,16. Le paracrine signalisation peut être médiée par des facteurs de croissance, cytokines, chimiokines, etc., tandis que la signalisation juxtacrine implique des ligands juxtaposés et récepteurs comme signalisation Notch, ou les interactions entre les intégrines et leurs respectifs protéines de la matrice extracellulaire. Nous avons démontré l’importance des interactions réciproques entre les cellules de cancer de l’ovaire et CAFs en tumeur la progression et la métastase14. De même, les interactions entre les cellules métastases de cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales portant sur le site de la métastase réglementent les microARN clés et facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses qui favorisent la colonisation métastatique17, 18.
La plupart des études sur la signalisation paracrine impliquent l’utilisation d’un milieu conditionné prélevé sur un type de cellule pour traiter le deuxième type de cellule avec. Bien que cette approche a été largement utilisée, il ne réplique pas efficacement les niveaux de haute concentration localisées du facteur sécrété dans le microenvironnement de la cellule réceptrice. Aussi, il ne parvient pas à reproduire la cinétique de l’écoulement continu du facteur sécrété produit par une cellule et reçue par la cellule voisine. Paracrine signalisation est efficace sur de courtes distances, comme les facteurs sécrétés sont aux concentrations requises uniquement dans le voisinage de la cellule source et ont tendance à diffuser et diluer à mesure que la distance augmente. Cette forte concentration localisée du facteur sécrété est indispensable pour déclencher une réponse dans la cellule réceptrice. En outre, la réponse dans les cellules réceptrices dépend aussi l’équilibre des facteurs nouvellement sécrétées et leur épuisement continu par le biais de dégradation, une liaison et internalisation dans les cellules réceptrices et la diffusion de la cellule source. Un milieu conditionné peut être concentré pour tenir compte des plus fortes concentrations localisées présentes dans le micro-environnement, mais qui ne peut pas reproduire avec précision les concentrations exactes. En outre, il ne peut pas imiter la cinétique naturelle de la production et l’épuisement du facteur impliqué. Pour mieux reproduire la signalisation paracrine et séparer de juxtacrine mécanismes de signalisation, nous avons mis au point une méthode de culture de proximal roman, ce qui implique de plus en plus les deux types de cellules sur chaque surface d’une membrane poreuse. Les pores sont suffisamment petits pour empêcher les interactions juxtacrine et encore permettre l’échange de facteurs sécrétés à des concentrations élevées localisées. De cette manière, ce système conserve la cinétique de la production et l’épuisement des facteurs paracrines.
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Protocol
Le protocole suit les directives du Conseil réglementaire institutionnel de l’Université Indiana.
1. préparation de la cellule
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Isolement et culture des cellules mésothéliales primaires humaines
- Toutes les isolat primaires mesothelial cellules humaines (HPMCs) d’épiploon humaine telle que décrite précédemment17,18 et de les cultiver en milieu [de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant du sérum de veau fœtal 10 %, 1 % de la croissance pénicilline-streptomycine, 1 % des acides aminés non essentiels et les vitamines 1 %] à 37 ° C et 5 % de CO2.
Remarque : Les HPMCs sont généralement cultivés au confluent de 100 % (Figure 1 a).
- Toutes les isolat primaires mesothelial cellules humaines (HPMCs) d’épiploon humaine telle que décrite précédemment17,18 et de les cultiver en milieu [de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant du sérum de veau fœtal 10 %, 1 % de la croissance pénicilline-streptomycine, 1 % des acides aminés non essentiels et les vitamines 1 %] à 37 ° C et 5 % de CO2.
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Conditions de croissance des cellules de cancer de l’ovaire
- La croissance de cellules de cancer de l’ovaire HeyA8 dans un milieu complet de croissance à 37 ° C et 5 % de CO2.
Remarque : Utilisation HeyA8 cellules cultivées à environ 80 % de confluence (Figure 1 b).
- La croissance de cellules de cancer de l’ovaire HeyA8 dans un milieu complet de croissance à 37 ° C et 5 % de CO2.
2. Culture cellulaire
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Set-up proximale de la culture
- Utilisation Transwell insère pour plaques 6 puits avec une membrane de 10 μm d’épaisseur tissu-culture-traitée en polycarbonate avec 0,4 μm pores (108 pores/cm2) et une zone de croissance de2 cm de 4,67. Le cas échéant, optimiser pour insertion de différentes tailles en réduisant le nombre de cellules ensemencées selon la surface de croissance. Milieu de culture complet chaud, la trypsine et solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant utilisation.
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Préparer les inserts
- Pour amorcer les cellules HeyA8 sur la surface inférieure de la membrane de l’insert, retirez l’insert de son emballage à l’aide de la pince stérile et placez-le en position inversée dans une boîte de Petri stérile de 15 cm.
- Utilisez un plat de 15 cm, car il a la profondeur pour accueillir le foyer inversé, ou remplacer par n’importe quel récipient stérile. Selon l’expérience, placer le nombre requis d’insertions dans le plat de 15 cm.
- Étiqueter les trois contrôles et trois conditions expérimentales en conséquence avec un marqueur sur le bord des inserts.
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Préparer les cellules cancéreuses
- Trypsinize les HeyA8 les cellules cultivées à confluence de 80 % dans un ballon jaugé de 25 cm2 (~ 2 x 106 cellules), ajouter 1 mL de la trypsine (0,25 %) pour 40 à 60 s et neutraliser la trypsine avec 6 mL de milieu de culture complet.
- Centrifuger les cellules à 500 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min, jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture complet. Compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.
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Ensemencer les cellules cancéreuses
- Suspendre 100 000 cellules/mL de cellules vivantes de HeyA8 dans le milieu de culture complet. Soigneusement les semences 80 000 cellules HeyA8 suspendus en 800 μL de milieu de culture complet sur le fond de l’insert (qui est maintenant vers le haut, car il est inversé).
- Les semences des cellules pour former une forme de dôme-comme si les cellules restent sur l’insert (Figure 1). Démarrez à partir du centre de la membrane et se déplacer vers l’extérieur en cercles concentriques tandis que lentement pipetage. Éviter d’aller plus de 3 mm du bord afin d’éviter toute effusion du milieu.
Remarque : Le nombre de cellules ensemencées dépendra du taux de croissance des cellules et la durée de l’expérience. Le nombre de cellules HeyA8 ensemencées pour cette culture proximale ont été optimisé et les cellules seront confluente de 80 à 90 % à la fin de la troisième journée.
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Fixation des cellules du cancer
- Couvrir le plat de 15 cm et déplacer délicatement le plat contenant les inserts à l’incubateur à CO2 . On critique ne pas de perturber la goutte de milieu et cellules sur l’insert à cette étape. Laissez les cellules à 37 ° C pendant 4 h permettre les cellules cancéreuses attacher à l’insert.
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Préparer les cellules mésothéliales
- Après environ 4 h, trypsinize les HPMCs cultivés au confluent de 100 % dans une fiole de2 75 cm (~ 4 x 106 cellules) avec 2 mL de trypsine (0,25 %) pendant 1 à 2 min et neutraliser la trypsine avec 12 mL de milieu de culture complet.
- Centrifuger les cellules à 500 x g RT pendant 3 min, resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture complet et compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.
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Ensemencement des cellules mésothéliales
- Suspendre les 300 000 cellules/mL d’HPMCs direct dans le milieu de culture complet. Ajouter 2,5 mL de milieu de culture complet frais dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Soigneusement mettre le plat de 15 cm contenant les inserts sur la hotte de la prévention des risques biotechnologiques. À l’aide d’une pince stérile, retourner l’insert et placez-le dans le puits de la plaque 6 puits afin qu’elle soit verticale, avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface inférieure, immergée dans le milieu de culture complet (Figure 1).
- HPMCs graine 450 000 suspendus dans 1,5 mL de milieu de croissance à l’intérieur des inserts avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface vers le fond du puits (Figure 1) ou à plaquettes sans les cellules HeyA8 pour les contrôles HPMC. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture sans cellules aux contrôles HeyA8.
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De plus en plus la culture proximale
- Laissez la culture proximale pousser dans l’incubateur à CO2 à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 72 h. Si nécessaire, le support peut être réapprovisionné comme suit.
- Pour l’intérieur de l’insert, retirer 750 µL et ajouter 750 µL de milieu de culture complet frais.
- Pour l’extérieur de l’insert (la plaque 6 puits), prélever 1 mL et ajouter 1 mL de milieu de culture complet frais. Le mL 1 a été choisie pour la commodité de changer le support en une seule étape. Si vous le souhaitez, 1,25 mL peut être enlevé et remplacé à la place.
- Laissez la culture proximale pousser dans l’incubateur à CO2 à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 72 h. Si nécessaire, le support peut être réapprovisionné comme suit.
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Le prélèvement de cellules
- Recueillir les cellules après 72 h de culture proximale. Faites attention à cette étape afin d’éviter la contamination croisée des cellules HeyA8 et HPMCs. Trypsinize les cellules, centrifuger eux et lyser le culot au lieu de lyser les cellules sur la membrane afin d’éviter une contamination croisée.
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Trypsinisation des cellules
- Rincer les deux côtés de l’insert avec du PBS 1 x.
- Les inserts de transfert d’un nouveau puits et ajouter la trypsine. Ajouter 0,5 mL de trypsine à l’intérieur de l’insert et ajouter 2 mL de trypsine à la plaque de 6 puits à trypsinize les cellules cancéreuses, attachés à la face inférieure de l’insert. Incuber la plaque pendant 2 min à 37 ° C.
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Neutralisation de la trypsine
- Ajouter 1 mL de milieu de culture complet à l’intérieur de l’insert pour neutraliser la trypsine, pipette de haut en bas, puis prenez les cellules et transférez-les sur un tube de prélèvement étiquetées. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet pour une neutralisation complète supplémentaire. Il faut ne pas de percer la membrane lors de pipetage pour éviter une contamination croisée des cellules.
- Afin de recueillir les cellules sur le fond de l’insert, distribuer la trypsine de 2 mL qui a été ajoutée à l’étape 12,2 sur la surface inférieure 2 – 3 x afin que les cellules entrent dans la partie inférieure de la plaque 6 puits. Neutraliser la trypsine sur le fond de la plaque avec 6 mL de milieu de croissance et transférer le contenu de la plaque dans un tube de prélèvement étiquetées.
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Collecte et lyser les cellules
- Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 3 min et aspirer les médias. Resuspendre et lyser les granules cellulaires avec 0,7 mL de réactif de lyse phénol guanidine thiocyanate-base et pour l’extraction de l’ARN. Isoler l’ARN à l’aide de n’importe quel kit adapté.
3. quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction
Remarque : Les étapes suivantes décrivent une quantitative PCR en temps réel (qPCR) pour étudier les changements d’expressions de gène à la suite de la culture proximale.
- Préparer les ADNc provenant des échantillons d’ARN pour qPCR. Utiliser n’importe quel convenable de la transcriptase inverse avec un tampon correspondant et amorces aléatoires afin d’assurer la transcription inverse de tous les ARNm (voir Table des matières).
- Évaluer les changements dans les niveaux d’expression de mRNA de la fibronectine (FN1) et de la E-cadhérine (CDH1) et transformer le facteur de croissance bêta 1 (TGFβ1) par qPCR avec glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme un contrôle interne. Il est possible d’utiliser normalisé essais d’expression de gène disponibles dans le commerce (voir Table des matières) ou de concevoir des amorces.
- Comparer les HeyA8 de cellules cultivées en proximal avec HPMCs avec les commandes HeyA8 et les HPMCs cultivés en proximal avec les contrôles HPMC.
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Representative Results
Des cellules de cancer de l’ovaire métastases rencontrent des cellules mésothéliales sur le site de métastases dans la cavité péritonéale19. Interactions paracrines et juxtacrine productives avec l’aide de cellules mésothéliales en induisant des réponses adaptatives dans les cellules de cancer de l’ovaire, qui permettent des métastases réussi17,18,20,21 . Pour tester l’efficacité de la méthode de culture proximale, nous avons testé les paracrine des interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire HeyA8 et HPMCs. Auparavant, il a été signalé qu’une co-culture de cellules HeyA8 avec HPMCs se traduit par une augmentation de l’expression de la fibronectine dans la HPMCs21. Cette induction de l’expression de la fibronectine est favorisée par une augmentation de la sécrétion de TGFβ par les cellules de HeyA821. Par conséquent, nous avons testé l’effet d’une culture proximale de cellules HeyA8 et HPMCs sur les taux d’ARNm de la fibronectine et TGFβ dans ces deux cellules. Comme prévu, la culture proximale avec des cellules HeyA8 a entraîné une augmentation de l’expression de la fibronectine dans les HPMCs par rapport aux contrôles qui ont été ensemencés sur plaquettes sans cellules de HeyA8 attachés à la face inférieure (Figure 2 a). De même, la culture proximale du HPMCs avec HeyA8 cellules a entraîné une augmentation de l’expression de TGFβ dans le premier cas (Figure 2 b). L’expression de la fibronectine et de TGFβ a également considérablement augmenté dans les cellules de la HeyA8 culture proximale avec HPMCs comparativement aux groupes témoins où HPMCs n’étaient pas amorcées dans la surface supérieure des inserts (Figure 2 et 2D).
Pour comparer l’effet de l’approche classique de moyenne conditionnée, nous avons réalisé une expérience traitant HeyA8 cellules avec un milieu conditionné HPMC. Il y avait une diminution de l’expression de la fibronectine et un changement significatif de TGFβ HeyA8 cellules traitées avec le milieu conditionné HPMC. (Figures 3 a et 3 b). Nous avons aussi testé la possibilité de bloquer le TGFβ sécrétée avec un anticorps neutralisant dans la culture proximale. Traitement avec l’anticorps neutralisant de TGFβ a entraîné une diminution significative dans l’induction de TGFβ HeyA8 cellules en culture proximale avec HPMCs (Figure 3). Toutefois, les anticorps neutralisants de TGFβ a légèrement augmenté l’expression de TGFβ dans les cellules de contrôle HeyA8, probablement comme une réaction compensatoire (Figure 3).
En outre, nous avons également testé l’effet de la culture proximale sur les niveaux d’expression du marqueur épithélial E-cadhérine. Alors que la culture proximale avec des cellules HeyA8 a légèrement augmenté l’expression de la E-cadhérine dans les HPMCs (Figure 2E), une diminution marquée de la E-cadhérine a été observée chez les HeyA8 cellules cultivées à proximité de HPMCs comparativement aux groupes témoins (Figure 2F). Globalement, ces résultats démontrent l’efficacité du système de culture proximale dans l’étude de la paracrine signaux entre les cellules de cancer de l’ovaire et les cellules normales sur le site de la métastase qui influent sur l’expression des gènes dans les deux types de cellules au cours de la processus de colonisation métastatique.
Figure 1 : montage du système de culture proximale. (A), ce panneau montre homme cellules mésothéliales primaires (HPMCs). (B), ce panneau montre des cellules de cancer de l’ovaire HeyA8. Barreaux de l’échelle = 200 µm (A-B). (C) HeyA8, les cellules ont été ensemencés sur la surface inférieure d’un transwell insérer avec 0,4 µm pores. Une fois que les cellules étaient attachés, l’insert a été placé dans un puits d’une plaque de 6 puits contenant le milieu de croissance. Cellules mésothéliales ont été ensuite ensemencées dans l’encart afin qu’elle attache à la surface supérieure et ont été séparés des HeyA8 des cellules de la membrane. 0,4 µm pores dans la membrane a permis l’échange de sécrétée facteurs mais inhibent tout contact direct entre les cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : effet de la culture proximale sur l’expression de l’ARNm. Le deux premiers panneaux montrent le qPCR pour la fibronectine (A) et (B) TGFβ1 expression dans les cellules mésotheliales humaines primaires (HPMCs) cultivée dans la partie proximale aux cellules HeyA8, par rapport au contrôle HPMCs. Le spectacle de deux panneaux le qPCR pour la fibronectine (C) et (D) TGFβ1 expression dans les cellules HeyA8 cultivée dans la partie proximale à HPMCs, par rapport au contrôle Heya8 des cellules. Les deux derniers panneaux montrent la qPCR pour l’expression de la E-cadhérine dans HPMCs (E), cultivés dans la partie proximale de cellules HeyA8 et HeyA8 (F) cultivées dans la partie proximale de HPMCs. N = 3, * p < 0,01. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des trois séquences répétées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : effet de cellules mésothéliales primaires humaines (HPMC)-conditionné traitement moyen sur l’expression de l’ARNm de cellules HeyA8. Les panneaux de deux albums montrent la qPCR pour la fibronectine (A) et (B) TGFβ1 expression dans les cellules HeyA8. (C), ce dernier panneau montre l’effet d’inhibition TGFβ1 sécrétée avec un anticorps neutralisant (TGFβ1 Ab) sur l’expression HeyA8 TGFβ1 sur une culture proximale avec HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des trois séquences répétées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Comprendre le mécanisme de paracrine et juxtacrine de signalisation entre les cellules est essentielle pour développer une meilleure connaissance du tissu normal homéostasie et maladie conditions7,8. Plupart paracrine signalisation études sont menées en recueillant conditionné milieu à partir d’un type de cellule et l’utiliser pour traiter l’autre type de cellule. Cette méthode a un avantage dans sa simplicité inhérente. Cependant, ce ne pas exactement récapituler les concentrations localisées des facteurs sécrétés dans le microenvironnement cellulaire ou la cinétique de la production et l’épuisement des facteurs impliqués. Alors que l’ancien peut être comblée dans une certaine mesure, bien que pas avec précision, en concentrant le milieu conditionné, il est très difficile de recréer la cinétique. L’utilisation d’inserts transwell à la croissance de cellules dans la notice et dans le fond du puits peut, dans une certaine mesure, reprendre les effets de la cinétique de la production et l’épuisement. Cependant, les cellules sont séparées par la distance entre le foyer et le fond du puits et, par conséquent, ne peut pas recréer les concentrations localisées des facteurs paracrines. Nous avons signalé l’élaboration d’une méthode de culture proximale simple pour étudier la signalisation paracrine réciproque, qui a conservé les fortes concentrations localisées des facteurs sécrétés, ainsi que la dynamique de la cadence de production et l’épuisement des facteurs.
Dans une étude de démonstration des principes, nous avons démontré l’efficacité de la méthode de culture proximale en reproduisant les effets rapportés des interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire et HPMCs. En outre, nous avons également montré les effets opposés des interactions réciproques paracrine sur l’expression du marqueur épithélial E-cadhérine dans les cellules HeyA8 et HPMCs. Tandis que notre expérience a consisté à cultiver les cellules sur une période de 3 jours, il peut être adapté à la plus courte ou plus longues points dans le temps en ajustant le nombre initial de cellules ensemencées. Cela permet aux chercheurs d’étudier les effets à court terme comme à long terme de la signalisation paracrine ou pour effectuer des études. Cette méthode simple peut potentiellement être appliquée à toute recherche sur paracrine signalisation entre deux types de cellules adhérentes, notamment l’immunologie, l’angiogenèse, le développement de cellules et la cicatrisation, en plus des études sur le microenvironnement tumoral.
Les étapes critiques de cette méthode sont les cellules sur la surface inférieure de la membrane de l’ensemencement et récolte les cellules des deux surfaces au point de terminaison. Nous avons atteint un ensemencement sur la surface inférieure en premier renversant l’insert et puis ensemencement les cellules comme une grosse goutte de milieu. La cellule plus adhérente des deux étudiés devrait être semée sur l’intrados. Soins doit veiller à ne pas déranger l’insert tout en incubation pour éviter cette goutte de milieu soit perturbé. Gel de silicone peut être appliqué pour les bords de l’insert pour éviter la casse et l’effusion de la bulle de liquide. À la fin de l’expérience de proximal de la culture, les cellules des deux côtés de la membrane sont dans l’ordre trypsinisées au lieu de lysées directement, parce que leur lyse sur la membrane risques la contamination croisée des lysats à travers les pores. Par trypsinisation eux dans leurs compartiments individuels et en prenant soin que le volume moyen et la trypsine ne dépasse jamais le montant stipulé du protocole, éviter toute contamination croisée. Chaque type de cellule est recueilli dans une éprouvette, centrifugée, et le culot cellulaire est ensuite lysé.
Bien que cette technique permet l’étude efficace d’interactions paracrines tout en évitant les interactions directes manifestes, nous ne pouvons exclure les interactions par tunnel naturel (TNTs). Certains de ces TNTs peuvent être assez étroit pour passer à travers les pores µm 0,4 et assez long pour couvrir le 10 µm d’épaisseur de la membrane. Alors que nos tentatives de vérifier leur présence dans les pores par microscopie confocale ont été peu concluantes (données non présentées), microscopie électronique pourrait potentiellement être employée pour confirmer leur présence. Par conséquent, cette méthode n’exclut pas la communication de cellule-cellule potentiels par le biais de TNTs si les cellules de candidats sont capables de former eux et interagissant à travers eux. De même, nous ne pouvons exclure autocrine accrue de signalisation à la suite du blocage potentiel des pores par les cellules des deux côtés de la membrane, empêchant la Croix-diffusion.
Croissance des cellules sur chaque surface d’une membrane avec 0,4 µm pores permet également l’échange possible d’exosomes. Exosomes étaient traditionnellement considérés comme des sacs à ordures des cellules, mais des recherches récentes ont indiqué que ces vésicules avec leur cargaison de protéines, microARN et même ARNm et l’ADN servent de médiateurs importants de paracrine communications cellulaires22 , 23 , 24. par conséquent, la méthode de culture proximale efficacement utilisable pour étudier les communications cellulaires à travers des exosomes. En outre, cette méthode se prête à un traitement par des inhibiteurs spécifiques des signalisation ou neutralisants des anticorps contre le ligand sécrétée ou récepteur correspondant. En résumé, nous avons signalé l’élaboration d’une méthode de culture proximale simple et polyvalent, qui peut reproduire avec exactitude paracrine signalisation tout en empêchant les interactions directes entre les cellules. La simplicité de cette méthode permet son application généralisée dans divers domaines comme la biologie du cancer, le développement et immunologie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes redevables aux patients pour leur participation à la collection de tissus pour ces expériences. Un DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award (W81XWH-15-0253) et un prix pilote de la Fondation de Colleen rêve d’un Anirban K. Mitra prise en charge de cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
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