Summary
여기에 제시된 폐 고정을 위한 유용한 프로토콜은 기종의 마우스 모델에서 폐 견본의 조직학적 평가를 위한 안정한 조건을 만드는. 이 모델의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 동일한 일정한 압력으로 많은 폐를 고정 할 수 있다는 것입니다.
Abstract
폐기종은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 중요한 특징입니다. 기종 마우스 모형을 관련시키는 연구 결과는 폐의 믿을 수 있는 조직학 견본을 생성하기 위하여 최적 폐 고정을 요구합니다. 주로 공기와 조직으로 구성된 폐의 구조 구성의 특성으로 인해 고정 과정에서 붕괴또는 수축 될 위험이 있습니다. 다양한 폐 고정 방법이 존재하며, 각각은 자신의 장점과 단점을 가지고 있습니다. 여기에 제시된 폐 고정 방법은 기종 마우스 폐 모델을 사용하여 연구를 위한 최적 조직 평가를 가능하게 하기 위하여 일정한 압력을 이용합니다. 주요 장점은 한 번에 동일한 조건으로 많은 폐를 고칠 수 있다는 것입니다. 폐 표본은 만성 담배 연기 노출 마우스로부터 수득된다. 폐 고정은 일정한 압력의 생산을 가능하게 하는 특수 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 일정한 압력은 합리적으로 팽창 된 상태에서 폐를 유지합니다. 따라서, 이 방법은 담배 연기 유발 경증 기종을 평가하기에 적합한 폐의 조직학적 표본을 생성한다.
Introduction
COPD는 사망의 주요 한 세계적인 원인 중 하나입니다1. 담배 연기는 COPD의 가장 중요한 원인이지만 병인의 메커니즘은 불완전하게 정의되어 있습니다. COPD는 공기 흐름의 점진적 제한 및 폐의 비정상적인 염증 반응을 포함하여 두 가지 주요 특성을 보여줍니다. 폐기장애는 COPD 환자의 폐에서 빈번하게 발생한다2. 폐기종의 병리학적 발견은 폐포 벽 파괴3을특징으로한다. 여러 동물 종은 생체 내에서 COPD 모델(즉, 개, 기니피그, 원숭이 및 설치류)을 생성하는데 사용되어 왔다.4. 그러나, 마우스는 COPD 모델의 구성에 가장 일반적으로 사용되고 있다. 이는 저렴한 비용, 유전자 변형 능력, 광범위한 게놈 정보 가용성, 항체의 가용성 및 다양한 마우스 균주를 사용하는 능력을 포함하여 많은 장점을 갖는다5. 현재, 인간 COPD의 전체 기능을 모방할 수 있는 마우스 모델은 없다; 따라서, 개별 연구원은 특정 COPD 연구에 가장 적합한 모델을 선택해야합니다6. 폐기종 마우스 모델은 현재 이용 가능한 많은 COPD 마우스 모델 중 하나입니다. 추가 모델은 악화 마우스 모델, 전신 동이환 모델 및 COPD 감수성 모델7을포함한다.
폐기종 마우스 모델은 화학약제 및 담배 연기 노출을 포함하는 여러 종류의 외인성 제제에 의해 생성될 수있다 4. 화학적 노출(예를 들어, 엘라스타제)은 심각한 유형의 기종을 생성하는 반면, 담배 연기는 경증 기종8,9를초래한다. 담배 연기는 COPD의 병인에 대한 주요 원인으로 여겨진다; 따라서, COPD 마우스 모델을 만드는 수단으로 담배 연기의 선택은 합리적인10이다. 많은 연구는 마우스에 기종을 만들기 위해 담배 연기를 사용했습니다. 예를 들어, Nikula 등은 B6C3F1 암컷 마우스로부터 7개월 또는 13개월 동안 담배 연기에 노출시킴으로써 기종 마우스 모델을 성공적으로생성하였다. 우리는 또한 노화 마커 단백질/SMP-30 KO 마우스12를통해 기종 마우스 모델을 확립했습니다. 담배 연기 노출에 의해 이 온화한 기종 모형을 제대로 구상할 수 있는 폐 고정 방법을 능력을 발휘하는 것이 중요합니다.
폐 고정을위한 다양한 방법이13설립되었습니다. 그러나, 폐기종14를평가하기 위한 폐 조직 고정의 금 표준 방법은 없다. 이 실험실에서 여러 연구는 여기에 제시 된 고정 시스템이 기종12,15, 16,17,18을평가하기위한 안정적인 조건을 생성하여 유용하다는 것을 보여 주었다. 현재 시스템의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 한 번에 동일한 조건으로 많은 폐를 해결할 수 있다는 것입니다. 현재 폐 고정 시스템은 주어진 기간 동안 적절한 일정한 압력으로 폐 표본을 팽창 할 수있는 몇 가지 특수 장비를 사용합니다. 이 특수 장비는 하부 컨테이너, 상부 컨테이너 및 펌프를 포함한 세 부분으로 구성됩니다. 폐 시편은 가압 고정제에 연결되는 하부 용기에 배치되어 상부 및 하부용기(19)사이의 제제 수준에서 25cmH2O 압력 차이를 초래한다.
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Protocol
다음 방법은 준텐도 대학 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 2006년 6월 1일, 일본 과학위원회의 동물 실험의 적절한 수행에 대한 지침이 준수되었습니다. 이 방법에는 1) 마우스 해부, 2) 폐 퇴출 및 3) 특수 장비에 의한 폐 조직의 고정의 세 가지 주요 단계가 있습니다. 전형적으로, 폐 시편은 고정12,15,16,17,18의48 시간 후에 박베제처리된다.
1. 마우스 해부
- 마우스의 체중을 측정한 다음 투여할 펜토바르비탈의 양을 결정합니다.
- 체중의 70 mg/kg의 복용량에 펜토 바르 비탈 내부를 주입하고 발가락 핀치에 대한 반응이 없는 상태에서 마취를 확인하십시오.
- 피부와 근육에 침투 할 때까지 45 ° 각도로 바늘을 주입하십시오. 플런저를 그리고 공기 진공을 확인한 다음 펜토바르비탈을 주입합니다.
- 반사 운동이 없는 상태에서 마취를 확인하십시오.
참고 : 안락사 마우스와 반대로 마취 마우스를 사용하는 것은 완전히 폐 흥분을 위해 권장됩니다. - 내측 선에서 마우스 피부와 복부 근육을 자르고 뇌영역을 목표로합니다.
- 더 넓은 작업 공간을 제공하기 위해 측면으로 잘라냅니다.
2. 폐 분노
- 다이어프램 층을 노출하고 집게로 찔러.
- 흉부 공간을 열고 흉골 영역을 잘라 폐와 심장을 명확하게 볼 수 있습니다.
- 왼쪽 심방과 우심실에서 심장을 잘라냅니다.
- 그림 1과같이 캐뉼라 (24 G)를 우심실 부위에 삽입하고 폐 동맥에 도달 할 때까지 두개 부위로 지시하십시오.
- 펌프를 켜고 모든 폐 조직이 흰색으로 변할 때까지 1x 인산완충 식염수(PBS)가 순환(약 200 mL/h)되도록 합니다.
3. 폐 조직의 고정
- 기관, 폐 및 심장을 제거합니다.
- 주변 결합 조직을 절단하여 세 가지 장기를 모두 해방하십시오.
- 오른쪽 주 기관지와 봉합사 스레드를 묶고 오른쪽 폐의 모든 로브를 잘라냅니다.
- (선택 사항): 오른쪽 폐의 로브는 네 부분으로 구성됩니다. 오른쪽 주요 기관지에서 이러한 부분을 잘라 냉동 조직 샘플로 처리를위해 부품을 분할합니다.
- 10 mL 주사기 내부에있는 고정 제에 왼쪽 폐의 심장과 로브를 삽입하십시오.
주의: 고정제는 위험합니다. 적절한 보호 장비(예: 긴 고무 장갑)를 착용하고 통풍이 잘 되는 방에서 작업하십시오. - 그림 2와같이 10 mL 주사기를 사용하여 폐를 팽창시키는 진공 상태를 만듭니다.
- 캐뉼라(20G)를 기관에 넣고 매듭을 묶습니다.
- 1 mL 주사기를 사용하여 누출을 확인하기 위해 고정 제로 폐를 팽창시.
- 그림 3에도시된 바와 같이 폐 고정 압력 장비로의 이송.
- 기간을 고정 한 후, 매듭으로 기관을 묶는 폐 샘플을 제거합니다.
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Representative Results
앞서 설명한 바와 같이, 확장된 일정한 압력을 생성하는 특수 장비는 세 부분으로 나눌 수있다(도 3A). 하부는 폐 샘플을 삽입하는 지점입니다(도4A). 폐는 캐뉼라(20 G)를 통해 3방향 스톱 콕을 이용하여 포르말린 흐름의 끝까지 연결된다(도4B). 압력은 하부 용기와 상부 용기 사이의 고정제의 상이한 표면 수준에서 생성된다(그림5). 압력 차이는 25 cmH2O; 그러나 높이 조절 노브를 사용하여 압력은 25-30 cmH2O 범위 내에서 조정할 수 있습니다(그림 5). 펌프는 튜브를 통해 하부 및 상부 용기를 연결합니다(그림3A). 에이전트 흐름의 방향은 도 3B에설명되어 있습니다.
다음에 제시된 것은 48 시간의 고정에 이어 폐에 있는 조직학적 사실 인정의 대표적인 결과입니다. 생후 6개월 된 수컷 SMP30-KO 마우스를 8주 동안 담배 연기 또는 신선한 공기(제어)에 노출하였다. 두 조직 표본 모두 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다. 그림 6 A는 표시된 영공 확대를 나타내지 않은 공기 노출 마우스에서 조직학적 발견을 보여줍니다. 대조적으로, 그림 6B는 만성 담배 연기에 드러낸 마우스에 있는 중요한 영공 확대 및 폐포 벽 파괴를 제시합니다.
평균 선형 절편(MLI)은 Thurlbeck 외에 의해 기술된 방법에 따라결정되었다. 20은 영공 크기에 액세스합니다. 파괴지수(DI)는 Saetta etal.에 의해 기재된 방법에 따라 폐포벽의 파괴를 평가하기로 결정하였다. 21.폐 시편의 이러한 형태측정 검사는 DI 및 MLI가 공기 노출된 마우스에서보다 연기 노출 SMP30-KO 마우스에서 유의하게 더 컸다는 것을밝혔다(도 6C,D).
그림 1: 폐 흥분. 캐뉼라는 우심실 의 위치에 삽입되고 폐 동맥으로 향했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 진공 주사기 폐 인플레이션. 폐를 팽창시키는 고정제 함유 10 mL 주사기 내부의 진공 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 폐 고정 장비. (A) 아크릴 장비는 펌프 기계를 활용하여 48 시간 동안 지속적으로 폐를 팽창시키는 25cmH2O 압력 차이를 허용했습니다. (B) 고정제 흐름의 방향은 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 낮은 컨테이너. (a) 마우스 폐 시편을 하부 용기 에 고정제 내부에 위치시켰다. (B) 하부 용기 내부에는 시료 배치 상자가 있으며, 그 위에는 포르말린이 3방향 스톱콕과 캐뉼라를 통해 흐릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 상부 용기 및 높이 조절 손잡이. 상부 용기는 25 cmH2O의 압력을 발생하였다. 상부 컨테이너의 높이를 조정하는 데 사용할 수있는 높이 조정 손잡이의 두 쌍이 있습니다; 따라서 생성되는 압력은 25-30cmH2O 범위 내에서 설정할 수 있습니다.
그림 6: 마우스 폐 조직학 및 형태학적 발견. 8주 담배 연기 노출 또는 공기 노출 SMP30-KO 마우스(6개월, 남성)에서 폐 절편의 대표적인 신체학적 이미지, 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 배율 막대 = 100 μm. (A) 공기 노출 군은 유의한 확대 또는 기타 발견을 나타내지 않았다. (B) 담배 연기 노출 그룹은 표시된 영공 확대 및 폐포 벽 파괴를 보였다. (C) 평균 선형 절편(MLI)입니다. 담배 연기 노출 마우스의 폐에서, MLI는 공기 노출 마우스보다 상당히 컸다 (*p & 0.001). (D) 파괴 지수(DI). 담배 연기 노출된 마우스의 폐에서, DI는 공기 에 노출된 마우스의 폐에 비해 유의하게 증가하였다(*p&0.001). 값은 평균 ± SD(각 그룹에 대해 n = 6)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 설치류 폐에 대한 고정 절차는 소설이 아닙니다. 그러나 이 시스템에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 한 번에 동일한 조건으로 많은 폐 (최대 20)를 해결할 수 있습니다. 독성 병리학 의 사회는 중력 주입을 위한 압력이 22-25 cmH2O22에서변화한다는 것을 말합니다. 특히, 여러 연구는 25 cmH2O13, 19,23,24,25,26,27의 압력에서 폐 고정을 수행했습니다. , 현재 시스템12,15,16,17,18을사용하여 우리의 실험실에서 채택되었습니다.
둘째, 다양한 기간 동안 일정한 압력으로 폐 조직을 고정 할 수 있습니다. 우리의 실험실에서, 폐 견본은 일반적으로 48 시간 동안 고정됩니다. 많은 조사자들은 비교적 짧은 시간(예를 들어, 5-20분)을13,28,29,30,31,32,팽창된 폐를 묶고 포르말린을 원하는 대로 장시간 연장하십시오. 폐 고정을 위한 기간의 길이를 위한 금 본위제표시를 나타내는 아무 데이터 또는 연구도 없습니다. 그러나 미국 흉부 학회 (ATS)/유럽 호흡기 학회 (ERS)의 성명은 기도 인플레이션 압력이 적어도 24 시간14동안 유지되어야하는 "은 표준"을 설명합니다. 병리학의 일본 사회는 또한 일관된 면역 조직 화학 슬라이드를 생성하기 위하여 1 주일 이상의 고정 시간을 추천했습니다; 비록, 그들의 추천은 인간 표본33을사용하여 분석을 기반으로합니다. 각 샘플은 개별적으로 하부 용기에 배치되어야 하기 때문에 비교적 짧은 고정 기간은 현재 시스템에 적용되지 않을 수 있습니다. 이는 현재 시스템의 제한사항입니다. 결론적으로, 마우스 폐 고정을위한 적절한 시간 길이는 알 수없는 남아있다.
이 방법의 중요한 단계는 포르말린 고정 과정 동안 폐 포르말린 누출의 위험과 관련이 있다. 폐 포르말린 누설은 폐 크기 수축을 일으킬 수 있습니다. 이 위험은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 부분은 희생 단계 중에 발생합니다. 흉부 케이지를 여는 동안 폐 표면에 부상을 입히지 않는 것이 중요합니다. 예방의 열쇠는 격막에서 이것에 접근하고 폐가 정수리 흉막에서 분리된 후에 흉부 늑골 케이지를 자르는 것을 계속하는 것입니다. 이 방법은 수술 장비로 인한 폐 부상을 방지합니다. 또 다른 주요 단계는 오른쪽 주요 기관지 묶을 때 발생합니다. 마우스의 오른쪽 엽이 무엇인지 확인하는 것이 중요합니다. 폐를 등쪽 에서 볼 수있는 위치에 배치하면 폐의 위치를 쉽게 식별 할 수 있습니다.
두 번째 부분은 특수 장비를 사용하여 폐 고정 공정 중에 있습니다. 폐 시편을 하부 용기의 포르말린 포트에 삽입하는 동안 중요한 단계가 발생합니다. 지속적인 가압 공정 동안 포르말린 포트에서 폐 시편분리를 방지하기 위해 삽입이 단단히 고정되어 있음을 확인해야합니다. 강조할 또 다른 측면은 특수 장비의 세 부분(하부 컨테이너, 상부 컨테이너 및 펌프) 간의 튜빙 연결입니다. 모든 튜브 연결은 단단히 연결되어야 합니다. 누설이 발생하면 상부 용기의 포르말린 부피가 감소하여 일정한 압력이 감소합니다.
독성 병리학 협회의 권고에 따르면, 포르말린의 경내 점안은 설치류 폐 모델에 대한 장점이 있으며, 이는 그 단점22를지배합니다. 그(것)들은 폐포 폐 morphometry의 양적 연구를 능력을 발휘할 때 경실 내 포르말린 고정 방법의 사용을 건의했습니다. 폐 내 주입은 기도 및 폐포 벽의 보존뿐만 아니라 폐 자렌치마(22)의시각화를 포함하여 두 가지 장점을 갖는다. Braber et al.에 의한 한 연구는 진공 팽창 및 전신 관류 방법과 비교할 때 폐 구조를 보존하는 측면에서 우수한 내막 포르말린 주입 방법이13임을밝혔다. 현재 방법은 마우스 모델의 내골 내 주입을 사용하여 폐포 영역의 시각화를 최적화합니다.
고정제에 관해서는 포름알데히드가 함유 된 10 % 포르말린이 종래 사용됩니다. 포름알데히드는 단백질 면역원성을 완전히 파괴하지 않기 때문에 면역병리학적 조사를 위한 고정제로 널리 사용된다. 그러나, ATS/ERS 문은 조직 구조를 적절히 안정화시키지 않기 때문에 포르말린 고정을 권장하지않는다(14. 글루타랄데히드는 대신 기도 주입을 권장합니다. 그러나, 그것은 면역 성 면역 관화학을 위한 부적당한 고정제 결과하는 단백질 면역원성을 파괴하기 위하여 복종됩니다. 몇몇 증거는 고정된 폐가 현재 고정시스템(12)을 사용하여 포르말린 고정 에 따른 형태 측정 평가(예를 들어, 평균 선형 차단, 내부 표면적 및 파괴 지수)를 위해 제공될 수 있다고 보고했습니다. , 15세 , 16세 , 17세 , 18. 확실히, 글루타랄데히드는 현재 시스템에 채택 될 수있다; 따라서, 연구원은 실험적인 필요에 따라 현재 시스템에서 두 에이전트를 선택할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 경쟁적인 이해관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 26461199 (T. 사토)와 환경 및 성별 특정 의학 연구소, 준텐도 대학 의학 대학원, 그랜트 번호 E2920 (T. 사토)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 파동은 현재의 방법의 설계와 원고 작성에 아무런 역할이 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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