Summary
这里介绍的是肺固定的有用方案，为肺气肿小鼠模型肺标本的组织学评估创造了一个稳定的条件。该模型的主要优点是，它可以修复许多肺具有相同的恒定压力，没有肺崩溃或通缩。
Abstract
肺气肿是慢性阻塞性肺病（COPD）的一个重要特征。涉及肺气肿小鼠模型的研究需要最佳的肺固定，以产生可靠的肺组织学标本。由于肺的结构组成的性质，主要由空气和组织组成，在固定过程中有它崩溃或放气的风险。各种肺固定方法存在，每种方法各有其优缺点。这里介绍的肺固定方法利用恒定压力，利用肺气肿小鼠肺模型为研究提供最佳的组织评估。主要优点是，它可以修复许多肺与相同的条件在同一时间。肺标本是从慢性香烟烟雾暴露小鼠获得的。肺固定使用专用设备进行，能够产生恒定的压力。这种恒定的压力使肺保持在合理的膨胀状态。因此，该方法产生一个肺组织标本，适合评估香烟烟雾引起的轻度肺气肿。
Introduction
慢性阻塞性肺病是全球主要死亡原因之一。香烟烟雾是COPD最重要的病因，但发病机制仍不完全确定。COPD表现出两个主要特征，包括气流的逐渐限制和肺的异常炎症反应。肺气肿紊乱经常发生在慢性阻塞性肺病患者2的肺部。肺气肿的病理发现以肺泡壁破坏为特征3。一些动物物种已经被用来生成在体内的COPD模型（即狗，豚鼠，猴子和啮齿动物）4。然而，鼠标已成为在COPD模型构造中最常用的。这有许多优点，包括成本低，具有转基因能力，广泛的基因组信息可用性，抗体的可用性，以及使用各种小鼠菌株的能力5。目前，没有小鼠模型可以模仿人类COPD的全部特征;因此，个别研究人员必须选择哪种模型最适合特定的慢性阻塞性肺病研究6。肺气小鼠模型是目前可用的众多 COPD 小鼠模型之一。其他模型包括加重小鼠模型、系统性共病模型和COPD易感性模型7。
肺气鼠模型可以由几种外源性物质产生，包括化学剂和香烟烟雾暴露4。化学品接触（例如，对乳化酶）会产生一种严重的肺气肿，而香烟烟雾则导致轻度肺气肿8，9。香烟烟雾被认为是COPD发病的主要原因;因此，选择香烟烟雾作为创建COPD小鼠模型的手段是合理的10。许多研究都利用香烟烟雾在老鼠体内制造肺气肿。例如，Nikula等人成功地从B6C3F1雌性小鼠身上培育出一种肺气肿小鼠模型，将它们暴露在香烟烟雾中7个月或13个月。我们还建立了肺气肿小鼠模型，通过衰老标记蛋白/SMP-30 KO小鼠12。执行肺固定方法至关重要，该方法可以通过香烟烟雾暴露来正确可视化这种温和的肺气肿模型。
各种肺固定方法已经建立13。然而，没有金标准肺组织固定方法用于评估肺气肿14。该实验室的几项研究表明，这里介绍的固定系统是有用的，为评估肺气肿12，15，16，17，18创建一个稳定的条件。目前系统的主要优点是，它可以修复许多肺与相同的条件在同一时间没有肺崩溃或通缩。目前的肺固定系统使用一些特殊设备，允许肺标本在给定时期内以适当的恒定压力膨胀。这种特殊设备由三个部分组成，包括下部容器、上部容器和泵。肺试样被放置在与加压固定剂相连的下容器中，导致上容器和下容器之间的代理水平存在25 cmH2O的压力差异19。
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Protocol
以下方法已获得君登多大学医学院动物护理和使用委员会的批准。2006年6月1日，日本科学委员会遵循了《动物实验正确进行指南》。这种方法有三个主要步骤：1）小鼠解剖，2）肺外泄，和3）在专用设备辅助的肺组织的固定。通常，肺标本在48小时后被加工嵌入12，15，16，17，18。
1. 鼠标解剖
- 测量小鼠的体量，然后确定要施用的五巴比妥的量。
- 以70mg/kg的体重剂量注射五巴比妥内腹，并通过对脚趾捏没有反应来确认麻醉。
- 以 45° 角注射针头，直到其穿透皮肤和肌肉。绘制柱塞并确认空气真空，然后注射五巴比妥。
- 通过没有反射运动确认麻醉。
注意：建议使用麻醉小鼠而不是安乐死小鼠进行完全肺外泄。 - 在中线切割小鼠皮肤和腹部肌肉，瞄准头部区域。
- 横向切割，以提供更宽的工作空间。
2. 肺外泄
- 露出隔膜层，用钳子刺穿它。
- 打开胸腔空间，切开胸腔，让肺部和心脏清晰可见。
- 在左心房和右心室切心脏。
- 将导管（24 G）插入右心室区域，并将其直接插入头室区域，直到到达肺动脉，如图1所示。
- 打开泵，让 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 循环（约 200 mL/h），直到所有肺组织变为白色。
3. 肺组织固定
- 取出气管、肺和心脏。
- 通过切割周围的结缔组织释放所有三个器官。
- 用缝合线绑住右主支气管，并切下右肺的所有叶。
- （可选）：右肺的叶由四部分组成。从右侧主支气管中切割这些部分，并将零件分割为冷冻组织样本进行加工。
- 将心脏和左肺叶插入固定剂中，位于 10 mL 注射器内。
注意：固定剂是危险的。穿戴适当的防护设备（如长橡胶手套），并在通风良好的房间工作。 - 使用10 mL注射器制造真空条件，使肺部膨胀，如图2所示。
- 将套管 （20 G） 插入气管并打结。
- 使用1 mL注射器用固定剂充气肺部以检查有无泄漏。
- 转移到肺固定压力设备，如图3所示。
- 固定期后，取出用结绑气管的肺样本。
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Representative Results
如前所述，产生扩展恒定压力的专用设备可分为三部分（图3A）。下部是插入肺样本的点（图4A）。肺通过导管（20 G）连接到形式素流动的尖端使用三向停止公鸡（图4B）。压力由下部和上容器之间的固定剂的不同表面水平产生（图5）。压力差为25 cmH2O;但是，使用高度调节旋钮，压力可以在 25-30 cmH2O 的范围内调节（图 5）。泵通过管子连接下部和上部容器（图3A），在固定剂表面高度上保持25厘米的差异。代理流的方向如图3B所示。
接下来是肺组织学发现的代表性结果，在48小时的固定后。六个月大的雄性SMP30-KO小鼠暴露在香烟烟雾或新鲜空气（作为对照）8周。两个组织标本都沾有血氧素和欧辛。图 6A显示了空气暴露小鼠的组织学发现，这些小鼠没有显示出明显的空域扩大。相比之下，图6B揭示了暴露于慢性香烟烟雾的小鼠的空域扩大和白杨壁破坏。
均线性截距（MLI）是根据瑟尔贝克等人描述的方法确定的。20进入空域大小。根据Saetta等人描述的方法，确定破坏性指数（DI）对白道壁的破坏程度进行评估。21.这些肺标本的形态检查表明，在冒烟的SMP30-KO小鼠中，DI和MLI明显大于在空气暴露小鼠中（图6C，D）。
图1：肺外泄。在右心室的位置插入一根导管，并定向到肺动脉。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：真空注射器肺膨胀。含有固定剂的10 mL注射器内的真空状况，以膨胀肺部。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：肺固定设备。（A）丙烯酸设备允许25 cmH2O压力差，利用泵机连续膨胀肺48小时。（B）固定剂流的方向用箭头指示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：下部容器。（A）小鼠肺标本位于下容器的固定剂内。（B）在下部容器内，有一个样品放置箱，顶部有一个形式素流经三向止流器和管状。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：上部容器和高度调节旋钮。上部容器产生25 cmH2O的压力。有两对高度调节旋钮，可用于调节上容器的高度;因此，产生的压力可以设定在25~30 cmH2O的范围内。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：小鼠肺和形态学发现。8周香烟烟雾暴露或空气暴露的SMP30-KO小鼠（6个月大，雄性）的肺部分代表性组织学图像，沾染了血氧林-欧素。刻度条 = 100 μm。（A）空气暴露组没有显着扩大或其他发现。（B）香烟烟雾暴露组出现明显的空域扩大和白杨壁破坏。（C）平均线性截距 （MLI）。在香烟烟雾暴露小鼠的肺部，MLI明显大于空气暴露小鼠（[p < 0.001]）。（D）破坏性指数。在香烟烟雾暴露小鼠的肺部，与空气暴露小鼠的肺部相比，DI显著增加（#p < 0.001）。值以平均值 = SD（n = 6 表示）。每个组。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里介绍的啮齿动物肺的固定程序并不新颖;然而，该系统有几个优点。首先，它可以修复许多肺（最多20个）与相同的条件在同一时间。毒理学病理学学会指出，重力灌输的压力从22-25 cmH2O22不等。值得注意的是，一些研究在25 cmH2O13，19，23，24，25，26，27的压力下进行了肺固定，我们的实验室已采用现行系统12、15、16、17、18。
其次，它可以在不同时期以恒定的压力固定肺组织。在我们的实验室中，肺样本通常固定为48小时。许多调查人员使用相对较短的时间（例如，5~20分钟）13，28，29，30，31，32，然后绑住膨胀的肺，浸入正式长时间，如需要。没有数据或研究表明肺固定持续时间的黄金标准。然而，美国胸腔学会（ATS）/欧洲呼吸学会（ERS）的声明描述了"银标准"，即气道通胀压力必须至少维持24小时14小时。日本病理学会还建议固定时间不超过1周，以产生一致的免疫组织化学幻灯片;虽然，他们的建议是基于分析使用人类标本33。相对较短的固定时间段可能不适用于当前系统，因为每个样本应单独放置在较低的容器中。这是当前系统的限制。总之，小鼠肺固定的适当时间长度仍不得而知。
该方法的关键步骤与在正式固定过程中肺形式内渗漏的风险有关。肺形式泄漏可导致肺径收缩。这种风险可以分为两部分。第一部分发生在牺牲步骤中。打开胸腔时，重要的是不要对肺表面造成伤害。预防的关键是从隔膜接近这一点，并在肺从胸膜分离后继续切割胸肋笼。这种方法避免了手术设备造成的肺部损伤。绑住正确的主支气管时，会出现另一个关键步骤。识别哪些是小鼠的右叶非常重要。将肺置于从背观中可以看到的位置上，可以更容易地识别肺部的位置。
第二部分是在肺固定过程中使用专用设备。将肺试样插入下部集装箱的正口时，会出现关键步骤。应确认插入紧密牢固，以防止肺标本在持续加压过程中脱离正式端口。需要强调的另一个方面是专用设备（下部容器、上部容器和泵）三个部分之间的管道连接。所有管连接都应紧密连接。如果发生泄漏，上容器中的形式体积将减少，从而降低恒定压力。
根据毒理学病理学协会的建议，在宫内灌输正式宁具有优势的啮齿动物肺模型，这战胜了其缺点22。他们建议在进行肺泡肺活量定量研究时，使用耳内形式固定方法。内切肺灌输有两个优点，包括保护气道和肺泡壁，以及肺腹肌22的可视化。Braber等人的一项研究表明，与真空膨胀法和全身灌注法相比，在保持肺结构方面，内切内形式授液方法优于13。目前的方法利用小鼠模型中的气管内灌输来优化海底区域的可视化。
关于固定剂，10%甲醛，含有甲醛，是常规使用。甲醛被广泛用作免疫病理学调查的固定剂，因为它不能完全破坏蛋白质的免疫原性。然而，ATS/ERS声明不建议正式固定，因为它不能充分稳定组织结构14。建议用于气道内气的灌输;然而，它受到蛋白质免疫原性的破坏，导致免疫细胞化学的固定剂不合适。若干证据表明，固定肺可用于使用当前固定系统进行正式固定后进行形态测量（例如，平均线性截取、内部表面积和破坏性指数）,15,16,17,18.当然，谷醛可用于目前的系统;因此，研究人员可以根据实验需要选择当前系统中的两种制剂。
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Disclosures
作者没有相互竞争的利益可申报。
Acknowledgments
这项工作部分得到了JSPS KAKENHI赠款号26461199（佐藤）和Juntendo大学医学院环境与性别特定医学研究所的支持，助学金编号为E2920（佐藤）。在设计现有方法和撰写手稿方面，受发人没有作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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