Summary
Presenteras här är ett användbart protokoll för lung fixering som skapar ett stabilt tillstånd för histologisk utvärdering av lungprover från en musmodell av emfysem. Den största fördelen med denna modell är att det kan fixa många lungor med samma konstanta tryck utan lung kollaps eller deflation.
Abstract
Emfysem är ett viktigt inslag i kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol). Studier med en emfysem musmodell kräver optimal lung fixering för att producera tillförlitliga histologiska prover av lungan. På grund av arten av lungans strukturella sammansättning, som består till stor del av luft och vävnad, det finns en risk att det kollapsar eller tör under Fixeringsprocessen. Olika lungfixeringsmetoder finns, som var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Den lung bindnings metod som presenteras här använder konstant tryck för att möjliggöra optimal vävnads utvärdering för studier med en emfysem mus lung modell. Den största fördelen är att det kan fixa många lungor med samma tillstånd på en gång. Lung prov erhålls från kroniska cigarettrök-exponerade möss. Lung fixering utförs med hjälp av specialiserad utrustning som möjliggör produktion av konstant tryck. Detta konstanta tryck upprätthåller lungan i ett rimligt uppblåst tillstånd. Sålunda, denna metod genererar ett histologiskt prov av lungan som är lämplig för att utvärdera cigarettrök-inducerad mild emfysem.
Introduction
KOL är en av de ledande globala dödsorsakerna1. Cigarettrök är den viktigaste orsaken till kol, men mekanismerna för patogenesen förblir ofullständigt definierade. KOL uppvisar två huvudegenskaper, inklusive progressiv begränsning av luftflödet och en onormal inflammatorisk reaktion på lungan. Emfysematös störning förekommer ofta i lungorna av KOL-patienter2. Den patologiska fynd av emfysem kännetecknas av alveolära vägg förstörelse3. Flera djurarter har använts för att generera kol-modeller in vivo (dvs. hundar, marsvin, apor och gnagare)4. Men musen har blivit den mest använda i byggandet av kol-modeller. Detta har många fördelar, inklusive dess låga kostnader, förmåga att vara genetiskt modifierade, omfattande genomisk information tillgänglighet, tillgång till antikroppar, och förmåga att använda en mängd olika mus stammar5. För närvarande finns det ingen musmodell som kan efterlikna alla funktioner i human kol; Därför måste enskilda forskare välja vilken modell som lämpar sig bäst för den specifika kol-forskningen6. Emfysematous musmodell är en av många kol musmodeller som för närvarande är tillgängliga. Ytterligare modeller inkluderar exacerbation musmodell, systemisk Co-morbidities modell, och kol känslighet modell7.
Emfysematous musmodell kan genereras av flera typer av EXOGEN agenter, inklusive kemiska agens och cigarettrök exponering4. Kemisk exponering (t. ex. till elastase) ger en allvarlig typ av emfysem, medan cigarettrök resulterar i mild emfysem8,9. Cigarettrök tros vara den främsta orsaken till patogenesen av kol; Därför är valet av cigarettrök som ett sätt att skapa en kol musmodell rimligt10. Många studier har använt cigarettrök för att skapa emfysem i musen. Till exempel skapade Nikula et al. framgångsrikt en emfysematous musmodell från B6C3F1 kvinnliga möss genom att utsätta dem för cigarettrök för 7 eller 13 månader11. Vi har också etablerat en emfysematous musmodell via åldras markör protein/SMP-30 Ko möss12. Det är viktigt att utföra en lungfixeringsmetod som korrekt kan visualisera denna milda emfysem modell av cigarettrök exponering.
Olika metoder för lungfixering har fastställts13. Emellertid, det finns ingen guldmynt standardmetod för lungvävnad fixering för att utvärdera emfysem14. Flera studier från detta laboratorium har visat att fixeringssystemet presenteras här är användbart genom att skapa en stabil förutsättning för att utvärdera emfysem12,15,16,17,18. Den största fördelen med det nuvarande systemet är att det kan fixa många lungor med samma tillstånd på en gång utan lung kollaps eller deflation. Det nuvarande lungfixeringssystemet använder viss speciell utrustning som gör att lungprover kan pumpas vid ett lämpligt konstant tryck under en given period. Denna speciella utrustning består av tre delar, inklusive en lägre behållare, övre behållare, och pump. Lungprover placeras i den nedre behållaren som är ansluten till trycksatta fixeringsmedel, vilket resulterar i en 25 cmH2O tryckskillnad i nivån av agenter mellan de övre och nedre behållarna19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande metoder har godkänts av djursjukvården och använda kommittéer av Juntendo University School of Medicine. Riktlinjerna för korrekt uppförande av djur experiment, Vetenskapsrådet av Japan, juni 1, 2006 följdes. Det finns tre huvudsakliga steg i denna metod: 1) mus dissektion, 2) lung exsanguination, och 3) fixering av lungvävnad biträdas av specialiserad utrustning. Typiskt, lung preparat bearbetas till inbäddning efter 48 h fixering12,15,16,17,18.
1. mus dissektion
- Mät kroppsvikten av musen, sedan bestämma mängden pentobarbital att administrera.
- Injicera pentobarbital intraperitonealt vid en dosering av 70 mg/kg kroppsvikt och bekräfta anestesi av avsaknaden av reaktion på tå nypa.
- Injicera nålen i en 45 ° vinkel tills den tränger in i huden och muskeln. Dra kolven och bekräfta ett luft vakuum och injicera sedan pentobarbital.
- Bekräfta anestesi av avsaknaden av reflex rörelse.
Anmärkning: med sövda mus i motsats till en euthanized mus rekommenderas för fullt lung exsanguination. - Skär musen huden och bukmuskeln vid den mediala linjen, som syftar till cefaliska området.
- Skär i sidled för att ge en bredare arbetsyta.
2. lung exsanguination
- Exponera membran skiktet och punktera den med tång.
- Öppna bröstkorg utrymme och skär sternala området, vilket gör att lungorna och hjärtat att synas tydligt.
- Skär hjärtat i vänster förmak och höger kammare.
- Sätt in en kanyl (24 G) i den högra ventrikeln området och rikta den till cefaliska området tills den når lungartären, som visas i figur 1.
- Slå på pumpen och låt 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) cirkulera (cirka 200 mL/h) tills all lungvävnad ändras till en vit färg.
3. fixering av lungvävnad
- Avlägsna luftstrupen, lungorna och hjärtat.
- Befria alla tre organ genom att skära den omgivande bindväv.
- Knyt höger huvud bronkus med en suturtråd och skär alla lober av den högra lungan.
- (Valfritt): loberna i den högra lungan består av fyra delar. Skär dessa delar från höger huvud bronkus och dela upp delarna för bearbetning som frysta vävnadsprover.
- Sätt in hjärtat och loberna i den vänstra lungan i fixerande medel, placerade inuti en 10 mL spruta.
Varning: fixerande medel är farliga. Använd lämplig skyddsutrustning (t. ex. långa gummihandskar) och arbeta i ett väl ventilerat rum. - Skapa ett vakuum tillstånd med en 10 mL spruta för att blåsa upp lungan, som visas i figur 2.
- Sätt in en kanyl (20 G) i luftstrupen och knyt en knut.
- Blåsa upp lungan med fixerande medel att kontrollera med för läckor, med hjälp av en 1 mL spruta.
- Överföring till lungfixeringstrycket, enligt illustrationen i figur 3.
- Efter fixering av perioder, ta bort lung provet binda luftstrupen bort med en knut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidigare beskrivits, kan den specialiserade utrustningen, som genererar förlängt konstant tryck, delas in i tre delar (figur 3a). Den nedre delen är den punkt där du ska sätta in lung provet (figur 4A). Lungan ansluts via en kanyl (20 G) till spetsen av formalin Flow med hjälp av en trevägs stopp PIK (figur 4B). Trycket genereras från de olika ytnivåerna av fastsättnings medel mellan de nedre och övre behållarna (figur 5). Tryckskillnaden är 25 cmH2O; med hjälp av höjd justeringsratten kan trycket dock justeras inom intervallet 25 – 30 cmH2O (figur 5). En pump förbinder de nedre och övre behållarna via rören (figur 3A), bevara en 25 cm skillnad i fastställande agent ytans höjd. Riktningen för agentens flöde beskrivs i figur 3B.
Presenteras nästa är ett representativt resultat av histologiska fynd i lungan, efter 48 h fixering. Sex månader gamla manliga SMP30-KO möss utsattes för cigarettrök eller frisk luft (som kontroll) för 8 veckor. Båda vävnadsprover färgas med hematoxylin och eosin. Figur 6 A visar histologiska fynd från de luftexponerade mössen, som inte uppvisade en markant utvidgning av luftrummet. Däremot avslöjar figur 6B betydande luftrums förstoring och alveolära vägg förstörelse hos möss som utsattes för kronisk cigarettrök.
De genomsnittliga linjära avlyssningar (MLI) bestämdes enligt den metod som beskrivs av Thurlbeck et al. 20 för att få tillgång till luftrummets storlek. Den destruktiva index (DI) var fast besluten att utvärdera förstörelsen av alveolära väggen enligt den metod som beskrivs av Saetta et al. 21. dessa morfometriska undersökningar av lung provet visade att di och MLI var signifikant större i de RÖKEXPONERADE SMP30-Ko-möss än hos de luftexponerade möss (figur 6C, D).
Figur 1: lung exsanguination. En kanyl sattes in på platsen för den högra ventrikeln och riktas till lungartären. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: vakuum spruta lung inflation. Vakuum tillstånd inuti 10 mL spruta som innehåller fixerande medel för att blåsa upp lungorna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utrustning för lung fixering. (A) akryl utrustningen tillät en 25 CMH2O tryckskillnad att blåsa upp lungorna kontinuerligt för 48 h, med hjälp av en pump maskin. B) riktningen för fastsättnings agens flöde indikeras med pilar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: nedre behållaren. A) mus lung provet placerades inuti fixerande ämnen i den nedre behållaren. (B) i den undre behållaren finns en prov placerings låda, där formalin rinner genom en trevägsstopcock och kanyl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: övre behållare och höjd justerings ratt. Den övre behållaren genererade ett tryck på 25 cmH2O. Det finns två par höjd justeringsrattar som kan användas för att justera höjden på den övre behållaren; som ett resultat, det tryck som genereras kan ställas in inom intervallet 25 – 30 cmH2O. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: mus lung histologisk och morphometriska fynd. Representativa histologiska bilder av lung sektioner från 8-veckors cigarett rökexponerade eller luftexponerade SMP30-KO möss (6 månader gamla, manliga), färgade med hematoxylin-eosin. Skalstapel = 100 μm. A den luftexponerade gruppen visade inte på någon betydande utvidgning eller andra fynd. B den cigarrett rök utsatta gruppen uppvisade en markant utvidgning av luftrummet och en alveolära vägg förstörelse. C) de genomsnittliga linjära avlyssningar (MLI). I lungorna hos cigarett rökutsatta möss var MLI signifikant större än luftexponerade möss (* p < 0,001). D) det destruktiva indexet (di). I lungorna av cigarettrök-exponerade möss, DI var signifikant ökade jämfört med lungorna av luftexponerade möss (* p < 0,001). Värden presenteras som medelvärde ± SD (n = 6 för varje grupp). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fixeringsproceduren för gnagare lungor presenteras här är inte roman; Detta system har dock flera fördelar. För det första, det kan fixa många lungor (max 20) med samma tillstånd på en gång. Sällskapet av Toxicologic patologi påstår att pressa för gravitation instillation varierar från 22 – 25 cmH2nolla22. I synnerhet har flera studier utfört lung fixering vid ett tryck på 25 CMH2O13,19,23,24,25,26,27 , som har antagits i vårt laboratorium med nuvarande system12,15,16,17,18.
För det andra kan det fixa lungvävnad vid ett konstant tryck under olika tidsperioder. I vårt laboratorium, är lungprover vanligtvis fasta för 48 h. Många utredare använder en relativt kort tidsperiod (t. ex. 5 – 20 min)13,28,29,30,31,32, sedan binda av den uppblåsta lungan och doppa i formalin under längre perioder efter behov. Det finns inga data eller forskning som visar en guld standard för längden på varaktigheten för lung fixering. Dock beskriver uttalandet av American Thorax Society (ATS)/European respiratoriska Society (ERS) "silver standard", där luftvägarna inflationstrycket måste upprätthållas för minst 24 h14. Den japanska Society of patologi rekommenderade också fixering gånger inte längre än 1 vecka för att producera konsekvent immunohistokemiska diabilder; även om, deras rekommendation är baserad på analys med hjälp av mänskliga exemplar33. Relativt korta fastställande tidsperioder kan inte tillämpas på det nuvarande systemet, eftersom varje prov är tänkt att vara individuellt placerad i den nedre behållaren. Detta är en begränsning av det nuvarande systemet. Sammanfattningsvis, den korrekta längden på tiden för mus lung fixering förblir okänd.
Kritiska steg i denna metod är relaterade till risken för lungformalin läckage under formalin Fixeringsprocessen. Lung formalin läckage kan orsaka lung storlek krympning. Denna risk kan delas in i två delar. Den första delen sker under offret steg. Medan du öppnar bröstkorg buren, det är viktigt att inte orsaka skada på lungan ytan. Nyckeln till förebyggande är att närma sig detta från membranet och fortsätta att skära bröstkorg bröstkorgen efter att lungan är frånkopplad från parietala pleura. Denna metod undviker lungskada orsakad av kirurgisk utrustning. En annan viktig steg uppstår när binda rätt viktigaste bronchus. Det är viktigt att identifiera vilka är musens högra lober. Placera lungorna i en position där de kan ses från en dorsala syn möjliggör enklare identifiering av platsen för lungorna.
Den andra delen är under lung bindningsprocessen med hjälp av specialiserad utrustning. Ett kritiskt steg inträffar när du sätter in lung preparatet i den nedre behållarens formalin-port. Det bör bekräftas att införingen är tätt säkrad för att förhindra att lung preparatet lossas från formalin-porten under den konstanta tryck sättnings processen. En annan aspekt att belysa är slangen anslutning mellan de tre delarna av specialiserad utrustning (lägre behållare, övre behållare, och pump). Alla rör anslutningar ska vara tätt anslutna. Om läckage uppstår, kommer formalin volymen i den övre behållaren minskar, vilket minskar konstant tryck.
Enligt rekommendationer från Society of toxikologisk patologi, intratrakeal instillation av formalin har fördelar för gnagare lung modell, som råder över dess nackdelar22. De har föreslagit användning av en intratrakeal formalin fixeringsmetod vid utförandet av kvantitativa studier av alveolära lungmorphometri. Intratracheal lung instillation har två fördelar, inklusive bevarande av luftvägarna och alveolära väggen samt visualisering av lungparenkym22. En studie av Braber et al. avslöjade att intratrakeal formalin instillation metoden är överlägsen när det gäller att bevara lung strukturen jämfört med vakuum inflationen och hela kroppen per fusions metoder13. Den nuvarande metoden utnyttjar intratrakeal instillation i en musmodell för att optimera visualisering av alveolära området.
När det gäller fixerande medel används konventionellt 10% formalin, som innehåller formaldehyd. Formaldehyd används ofta som ett fixerande medel för immunopatologiska undersökningar eftersom det inte helt förstör proteinimmunogenicitet. Emellertid, ATS/ERS uttalande rekommenderar inte formalin fixering, eftersom det inte tillräckligt stabilisera vävnad struktur14. Glutaraldehyd rekommenderas för luftvägarna instillation i stället; Det är dock föremål för att förstöra proteinimmunogenicitet, vilket resulterar i en olämplig fastställande agent för immunohistokemi. Flera bevis har rapporterat att de fasta lungorna kan tillhandahållas för morphometrisk utvärdering (t. ex. medelvärdet av linjära avlyssningar, invändig ytarea och destruktivt index) efter formalin fixering med nuvarande fixeringssystem12 , 15 , 16 , 17 , 18. visst kan glutaraldehyd antas för det nuvarande systemet. Sålunda, forskare kan välja båda agenter i det nuvarande systemet enligt experimentella behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) och Institutet för miljö-och könsspecifik medicin, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Finansiär hade ingen roll i utformningen av de nuvarande metoderna och skriftligen manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
- Spurzem, J. R., Rennard, S. I.
- Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P.
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
- Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
- Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
- Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
- Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
- Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
- Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
- Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
- Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
- Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
- Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
- Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
- Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
- Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).
- Nakanishi, Y., et al.
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).
