Summary
Здесь представлен полезный протокол для фиксации легких, который создает стабильное состояние для гистологического оценивания образцов легких по мышиной модели эмфиземы. Основным преимуществом этой модели является то, что она может исправить многие легкие с тем же постоянным давлением без коллапса легких или дефляции.
Abstract
Эмфизема является важной особенностью хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Исследования с участием эмфисематической мыши модели требуют оптимальной фиксации легких для получения надежных гистологических образцов легких. Из-за характера структурного состава легких, который состоит в основном из воздуха и ткани, существует риск того, что он разрушается или сдувается во время процесса фиксации. Существуют различные методы фиксации легких, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод фиксации легких, представленный здесь, использует постоянное давление, чтобы обеспечить оптимальную оценку тканей для исследований с использованием эмфисематичной модели легких мыши. Основным преимуществом является то, что он может исправить многие легкие с тем же условием в одно время. Образцы легких получаются у хронических мышей, подвергающихся воздействию сигарет. Фиксация легких осуществляется с использованием специализированного оборудования, которое позволяет производить постоянное давление. Это постоянное давление поддерживает легких в достаточно завышенном состоянии. Таким образом, этот метод генерирует гистологический образец легких, который подходит для оценки сигаретного дыма индуцированной мягкой эмфиземы.
Introduction
ХОБЛ является одной из ведущих мировых причин смерти1. Сигаретный дым является наиболее важной причиной ХОБЛ, но механизмы патогенеза остаются неполно определенными. ХОБЛ демонстрирует две основные характеристики, включая постепенное ограничение воздушного потока и аномальную воспалительную реакцию легких. Эмфисематизивное расстройство часто возникает в легких пациентов ХОБЛ2. Патологические находки эмфиземы характеризуются разрушением альвеолярной стены3. Несколько видов животных были использованы для создания моделей ХОБЛ in vivo (т.е. собак, морских свинок, обезьян и грызунов)4. Тем не менее, мышь стала наиболее часто используемой в строительстве моделей ХОБЛ. Это имеет много преимуществ, в том числе его низкая стоимость, способность быть генетически модифицированным, обширная доступность геномной информации, наличие антител, и способность использовать различные штаммы мыши5. В настоящее время нет мыши модели, которая может имитировать все особенности человеческого ХОБЛ; Таким образом, отдельные исследователи должны выбрать, какая модель наиболее подходит для конкретных исследований ХОБЛ6. Эмфисемативная модель мыши является одной из многих моделей мыши ХОБЛ, которые в настоящее время доступны. Дополнительные модели включают модель мыши обострения, системную модель сопутствующих болезней и модель восприимчивости ХОБЛ7.
Эмфисемативная модель мыши может быть создана несколькими типами экзогенных агентов, включая химические агенты и воздействие сигаретного дыма4. Химическое воздействие (например, эластаза) производит тяжелый тип эмфиземы, в то время как сигаретный дым приводит к легкой эмфиземы8,9. Считается, что сигаретный дым является основной причиной патогенеза ХОБЛ; поэтому выбор сигаретного дыма в качестве средства для создания модели мыши ХОБЛ является разумным10. Многие исследования использовали сигаретный дым для создания эмфиземы в мыши. Например, Nikula et al. успешно создала эмфисематизирующую модель мыши от самок мышей B6C3F1, подвергая их воздействию сигаретного дыма в течение 7 или 13 месяцев11. Мы также создали эмфисематичную модель мыши через белок senescence маркер / SMP-30 KO мышей12. Очень важно выполнить метод фиксации легких, который может правильно визуализировать эту мягкую модель эмфиземы путем воздействия сигаретного дыма.
Различные методы фиксации легких были созданы13. Тем не менее, нет золотого стандарта метод фиксации легочной ткани для оценки эмфиземы14. Несколько исследований из этой лаборатории показали, что система фиксации, представленная здесь, полезна, создавая стабильное состояние для оценки эмфиземы12,15,16,17,18. Основным преимуществом нынешней системы является то, что она может исправить многие легкие с тем же условием в одно время без коллапса легких или дефляции. Нынешняя система фиксации легких использует специальное оборудование, которое позволяет образцам легких надуваться при соответствующем постоянном давлении на данный период. Это специальное оборудование состоит из трех частей, в том числе нижнего контейнера, верхнего контейнера и насоса. Образцы легких помещаются в нижний контейнер, который подключен к агентам фиксации под давлением, в результате чего разница в давлении 25 см2О в уровне агентов между верхними и нижними контейнерами19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие методы были одобрены комитетами по уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Джунтендо. Были соблюдены Руководящие принципы по надлежащему проведению экспериментов на животных, Научный совет Японии, 1 июня 2006 года. Есть три основных шага в этом методе: 1) рассечение мыши, 2) легких exsanguination, и 3) фиксация тканей легких при содействии специализированного оборудования. Как правило, образцы легких обрабатываются для встраивания после 48 ч фиксации12,15,16,17,18.
1. Рассечение мыши
- Измерьте массу тела мыши, а затем определить количество пентобарбитала для администрирования.
- Вводят пентобарбитал интраперитоневом виде в дозировке 70 мг/кг массы тела и подтверждают анестезию отсутствием реакции на щепотку ног.
- Введите иглу под углом 45 градусов, пока она не проникнет в кожу и мышцы. Нарисуйте поршень и подтвердите воздушный вакуум, затем введите пентобарбитал.
- Подтвердите анестезию отсутствием рефлекторного движения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование анестезируется мыши, в отличие от эвтаназии мыши рекомендуется для полностью легких exsanguination. - Вырезать мышь кожи и мышц ыбрю живота на медиальной линии, направленных на цефалической области.
- Отрежьте боковое, чтобы обеспечить более широкое рабочее пространство.
2. Легкие exsanguination
- Выставить слой диафрагмы и проколать его щипками.
- Откройте грудное пространство и вырежьте стерную область, что позволит хорошо увидеть легкие и сердце.
- Разрежьте сердце в левом предсердии и правом желудочке.
- Вставьте канюлу (24 G) в правую область желудочка и направьте ее в цефалическую область, пока не достигнет легочной артерии, как показано на рисунке 1.
- Включите насос и позвольте 1x фосфат-буферизированных сольников (PBS) циркулировать (примерно 200 мл / ч) до тех пор, пока все ткани легких изменения в белый цвет.
3. Фиксация легочной ткани
- Удалить трахеи, легких и сердца.
- Освободите все три органа, разрезая окружающие соединительные ткани.
- Свяжите правый основной бронх с шовной нитью и вырежьте все доли правого легкого.
- (Необязательно): доли правого легкого состоят из четырех частей. Вырежьте эти части из правого основного бронха и разделите части для обработки в виде замороженных образцов тканей.
- Вставьте сердце и доли левого легкого в фиксирующие средства, расположенные внутри шприца 10 мл.
ПРЕДЕКТО: Фиксация агентов являются опасными. Носите надлежащее защитное оборудование (например, длинные резиновые перчатки) и работайте в хорошо проветриваемом помещении. - Создайте вакуумное состояние с помощью шприца 10 мл для раздувания легких, как показано на рисунке 2.
- Вставьте канюлу (20 G) в трахею и завяжите узел.
- Надуть легкое с фиксации агентов, чтобы проверить с утечки, используя 1 мл шприц.
- Переход на оборудование для фиксации легких, как показано на рисунке 3.
- После фиксации периодов, удалить образец легких связывая трахеи с узел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как описано ранее, специализированное оборудование, которое генерирует длительное постоянное давление, можно разделить на три части(рисунок 3А). Нижняя часть является точкой, в которой вставить образец легких(Рисунок 4A). Легкое подключено через канюлю (20 G) к кончику потока формалина с помощью трехстороннего стоп-петуха(рисунок 4B). Давление генерируется из различных уровней поверхности фиксирующих агентов между нижними и верхними контейнерами(рисунок 5). Разница в давлении 25 см2О; однако, используя ручку регулировки высоты, давление можно отрегулировать в пределах диапазона 25-30 cmH2O(рисунок 5). Насос соединяет нижние и верхние контейнеры через трубки(рисунок 3A),сохраняя разницу в 25 см в фиксации высоты поверхности агента. Направление потока агента описано на рисунке 3B.
Представленный следующий является репрезентативным результатом гистологических выводов в легких, после 48 ч фиксации. Шестимесячные мыши SMP30-KO подвергались воздействию сигаретного дыма или свежего воздуха (в качестве контроля) в течение 8 недель. Оба образца ткани были окрашены гематоксилин и эозин. Рисунок 6 A показывает гистологические заключения от воздух-подвергшихся действию мышей, которые не exhibit маркированное расширение воздушного пространства. В отличие от этого, рисунок 6B показывает значительное расширение воздушного пространства и разрушение альвеолярной стены у мышей, которые подверглись воздействию хронического сигаретного дыма.
Средние линейные перехваты (MLI) были определены в соответствии с методом, описанным Thurlbeck etal. 20 для доступа к размеру воздушного пространства. Разрушительный индекс (DI) был полон решимости оценить разрушение альвеолярной стены в соответствии с методом, описанным Saetta etal. 21. Эти морфометрические исследования образца легких показали, что DI и MLI были значительно больше в дым-экспонированных SMP30-KO мышей, чем в воздух-экспонированных мышей (Рисунок 6C,D).
Рисунок 1: Высания легких. Канюля была вставлена в месте расположения правого желудочка и направлена на легочную артерию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Вакуумный шприц легких инфляции. Вакуумное состояние внутри шприца 10 мл, содержащего фиксирующие средства для раздувания легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: оборудование для фиксации легких. (A) Акриловое оборудование позволило 25 см2O разница давления, чтобы надуть легкие непрерывно в течение 48 ч, используя насос машины. (B) Направление потока фиксирующего агента указывается стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Нижний контейнер. (A) Образец легкого мыши был расположен внутри фиксирующих агентов в нижнем контейнере. (B) Внутри нижнего контейнера находится коробка для размещения образцов, в верхней части которой формалин проходит через трехсторонний стоп-конк и канюлю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Верхний контейнер и ручка регулировки высоты. Верхний контейнер генерировал давление 25 см2O. Есть две пары ручки регулировки высоты, которые могут быть использованы для регулировки высоты верхнего контейнера; в результате, давление, которое генерируется может быть установлено в диапазоне 25-30 смH2O. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Мышь легких гистологических и морфометрических выводов. Представитель гистологические изображения легких разделов из 8-недельного сигаретного дыма подвергаются или воздух-экспонированных SMP30-KO мышей (6 месяцев, мужчины), окрашенные гематоксилин-эосин. Шкала бар 100 мкм. (A) Группа, подвергаемая воздействию воздуха, не продемонстрировала значительного расширения или других выводов. b) Группа, подвергаевая воздействию сигарет, показала заметное расширение воздушного пространства и разрушение альвеолярных стен. (C) Средние линейные перехваты (MLI). В легких мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, МЛИ был значительно больше, чем мышей, подвергшихся воздействию воздуха (злт; 0,001). (D) Разрушительный индекс (DI). В легких мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, DI был значительно увеличен по сравнению с легкими мышей, подвергшихся воздействию воздуха (зрп злт; 0,001). Значения представлены как средние SD (n No 6 для каждой группы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура фиксации легких грызунов, представленная здесь, не нова; однако, эта система имеет несколько преимуществ. Во-первых, он может исправить многие легкие (максимум 20) с тем же условием в одно время. Общество токсикологической патологии утверждает, что давление для гравитации зависания варьируется от 22-25 смH2O22. Примечательно, что в нескольких исследованиях была проведена фиксация легких при давлении 25 см2O13,19,23,24,25,26,27 , которая была принята в нашей лаборатории с использованием действующей системы12,15,16,17,18.
Во-вторых, он может фиксировать ткани легких при постоянном давлении в течение различных периодов времени. В нашей лаборатории образцы легких обычно фиксируются на 48 ч. Многие исследователи используют относительно короткий период времени (например, 5-20 мин)13,28,29,30,31,32, затем связать надувные легкие и погрузиться в формалин в течение длительных периодов по желанию. Нет данных или исследований, указывающих на золотой стандарт продолжительности фиксации легких. Тем не менее, в заявлении Американского торакального общества (ATS)/Европейского респираторного общества (ERS) описывается "серебряный стандарт", в котором давление инфляции в дыхательных системах должно быть сохранено не менее 24 ч14. Японское общество патологии также рекомендовало время фиксации не более 1 недели для получения последовательных иммуногистохимических слайдов; хотя, их рекомендация основана на анализе с использованием человеческих образцов33. Относительно короткие периоды фиксации времени могут быть не применимы к действующей системе, поскольку каждый образец должен быть индивидуально помещен в нижний контейнер. Это ограничение действующей системы. В заключение, правильный промежуток времени для мыши легких фиксации остается неизвестным.
Критические шаги в этом методе связаны с риском утечки легочных формалина в процессе фиксации формилина. Легкий формалин утечки может вызвать усадку размера легких. Этот риск можно разделить на две части. Первая часть происходит во время шага жертвоприношения. При открытии грудной клетки, важно не нанести вред поверхности легких. Ключк к профилактике заключается в том, чтобы подойти к этому от диафрагмы и продолжать резать грудной клетки после того, как легкое отделяется от теменной плевры. Этот метод позволяет избежать травм легких, вызванных хирургическим оборудованием. Еще один ключевой шаг возникает при связывании правого основного бронха. Важно определить, какие именно доли мыши являются правыми. Размещение легких в таком положении, когда их можно увидеть из вида на дорс, позволяет легче определить местоположение легких.
Вторая часть в процессе фиксации легких с использованием специализированного оборудования. Критический шаг происходит при вставке образца легких в нижний порт формина контейнера. Следует подтвердить, что вставка плотно защищена, чтобы предотвратить отслоение легочных образцов от формалина порта во время постоянного процесса давления. Еще одним аспектом, который необходимо выделить, является связь труб между тремя частями специализированного оборудования (нижний контейнер, верхний контейнер и насос). Все соединения трубки должны быть плотно соединены. При утечке объем формалина в верхнем контейнере уменьшается, тем самым снижая постоянное давление.
Согласно рекомендациям Общества токсикологической патологии, внутрипеченевая загон явилась формалином имеет преимущества для модели легких грызунов, которые преобладают над его недостатками22. Они предложили использовать внутричечной метод фиксации формалина при выполнении количественных исследований альвеолярной морфометрии легких. Интрахеальная загоняние легких имеет два преимущества, в ключая сохранение дыхательных путей и альвеолярной стенки, а также визуализация пунхимы легких22. Одно исследование Braber et al. показало, что метод интрахеального формалина является превосходным с точки зрения сохранения структуры легких по сравнению с вакуумной инфляцией и методами перфузии всего тела13. Текущий метод использует внутричечное заготворение в модели мыши для оптимизации визуализации альвеолярной области.
Что касается фиксации агентов, 10% формалин, который содержит формальдегид, обычно используется. Формальдегид широко используется в качестве фиксирующего агента для иммунопатологических исследований, поскольку он не полностью разрушает иммуногенность белка. Тем не менее, atS / ERS заявление не рекомендует формалин фиксации, потому что он не адекватно стабилизировать структуру ткани14. Глутаральдегид рекомендуется для зависания дыхательных путей; однако, он подвержен уничтожению белковой иммуногенности, что приводит к неподходящим фиксирующим средством иммуногистохимии. Несколько доказательств сообщили, что фиксированные легкие могут быть предоставлены для морфометрической оценки (например, средние линейные перехваты, внутренняя площадь поверхности, и разрушительный индекс) после фиксации формалина с помощью текущей системы фиксации12 , 15 лет , 16 Год , 17 Лет , 18. Конечно, глутаральдегид может быть принят для нынешней системы; Таким образом, исследователи могут выбирать оба агента в нынешней системе в соответствии с экспериментальными потребностями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI Грант номер 26461199 (Т. Сато) и Институт по вопросам окружающей среды и гендерной медицины, Juntendo университета Высшей школы медицины, Грант номер E2920 (Т. Сато). Фандер не принимал никакого значения в разработке современных методов и в написании рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
- Spurzem, J. R., Rennard, S. I.
- Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P.
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
- Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
- Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
- Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
- Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
- Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
- Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
- Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
- Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
- Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
- Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
- Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
- Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
- Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).
- Nakanishi, Y., et al.
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).
