Summary
Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.
Abstract
El enfisema es una característica significativa de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los estudios que involucran un modelo de ratón enfisematoso requieren una fijación pulmonar óptima para producir muestras histológicas confiables del pulmón. Debido a la naturaleza de la composición estructural del pulmón, que consiste en gran parte de aire y tejido, existe el riesgo de que colapse o se desinflen durante el proceso de fijación. Existen varios métodos de fijación pulmonar, cada uno de los cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. El método de fijación pulmonar presentado aquí utiliza presión constante para permitir una evaluación óptima del tejido para estudios utilizando un modelo de pulmón de ratón enfisematoso. La principal ventaja es que puede arreglar muchos pulmones con la misma condición a la vez. Los especímenes pulmonares se obtienen de ratones crónicos expuestos al humo del cigarrillo. La fijación pulmonar se realiza utilizando equipos especializados que permiten la producción de presión constante. Esta presión constante mantiene el pulmón en un estado razonablemente inflado. Por lo tanto, este método genera un espécimen histológico del pulmón que es adecuado para evaluar el enfisema leve inducido por humo de cigarrillo.
Introduction
La EPOC es una de las principales causas mundiales de muerte1. El humo del cigarrillo es la causa más importante de la EPOC, pero los mecanismos de la patogénesis siguen estando incompletamente definidos. La EPOC demuestra dos características principales, incluyendo la limitación progresiva del flujo de aire y una respuesta inflamatoria anormal del pulmón. El trastorno hemofusostoso ocurre con frecuencia en los pulmones de los pacientes con EPOC2. Los hallazgos patológicos del enfisema se caracterizan por la destrucción de la pared alveolar3. Se han utilizado varias especies animales para generar modelos de EPOC in vivo (es decir, perros, conejillos de indias, monos y roedores)4. Sin embargo, el ratón se ha convertido en el más utilizado en la construcción de modelos de EPOC. Esto tiene muchas ventajas, incluyendo su bajo costo, capacidad para ser modificado genéticamente, amplia disponibilidad de información genómica, disponibilidad de anticuerpos, y la capacidad de utilizar una variedad de cepas de ratón5. En la actualidad, no hay ningún modelo de ratón que pueda imitar todas las características de la EPOC humana; por lo tanto, los investigadores individuales deben elegir qué modelo es el más adecuado para la investigación específica de la EPOC6. El modelo de ratón enfisematoso es uno de los muchos modelos de ratón EPOC que están disponibles actualmente. Los modelos adicionales incluyen el modelo de ratón de exacerbación, el modelo de comorbilidades sistémicas y el modelo de susceptibilidad a la EPOC7.
El modelo de ratón enfisematoso puede ser generado por varios tipos de agentes exógenos, incluyendo agentes químicos y exposición al humo del cigarrillo4. La exposición química (p. ej., a la elestasa) produce un tipo grave de enfisema, mientras que el humo del cigarrillo produce un enfisema leve8,9. Se cree que el humo del cigarrillo es la principal causa de la patogénesis de la EPOC; por lo tanto, la elección del humo del cigarrillo como medio para crear un modelo de ratón COPD es razonable10. Muchos estudios han utilizado humo de cigarrillo para crear enfisema en el ratón. Por ejemplo, Nikula y otros crearon con éxito un modelo de ratón enfisematoso de ratones hembra B6C3F1 exponiéndolos al humo del cigarrillo durante 7 o 13 meses11. También hemos establecido un modelo de ratón enfisematoso a través de la proteína marcador de senescencia/SMP-30 KO ratones12. Es crucial realizar un método de fijación pulmonar que pueda visualizar adecuadamente este modelo de enfisema leve por exposición al humo del cigarrillo.
Se han establecido varios métodos para la fijación pulmonar13. Sin embargo, no existe un método estándar de oro de fijación de tejido pulmonar para evaluar el enfisema14. Varios estudios de este laboratorio han demostrado que el sistema de fijación presentado aquí es útil mediante la creación de una condición estable para la evaluación del enfisema12,15,16,17,18. La principal ventaja del sistema actual es que puede fijar muchos pulmones con la misma condición a la vez sin colapso pulmonar o deflación. El sistema de fijación pulmonar actual utiliza algunos equipos especiales que permiten inflar muestras pulmonares a una presión constante adecuada durante un período determinado. Este equipo especial consta de tres partes, incluyendo un contenedor inferior, contenedor superior y bomba. Las muestras pulmonares se colocan en el contenedor inferior que está conectado a los agentes de fijación presurizados, lo que resulta en una diferencia de presión de 25 cmH2O en el nivel de agentes entre los contenedores superior e inferior19.
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Protocol
Los siguientes métodos han sido aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela universitaria de Medicina de Juntendo. Se siguieron las Directrices para la correcta realización de experimentos con animales, Consejo Científico del Japón, 1 de junio de 2006. Hay tres pasos principales en este método: 1) disección del ratón, 2) exsanguinación pulmonar y 3) fijación de tejidos pulmonares asistidos por equipos especializados. Típicamente, los especímenes pulmonares se procesan para su incrustación después de 48 h de fijación12,15,16,17,18.
1. Disección del ratón
- Mida el peso corporal del ratón y, a continuación, determine la cantidad de pentobarbital que se debe administrar.
- Inyectar pentobarbital por vía intraperitoneal a una dosis de 70 mg/kg de peso corporal y confirmar la anestesia por la ausencia de reacción al pellizco del dedo del dedo del día.
- Inyectar la aguja en un ángulo de 45o hasta que penetre en la piel y el músculo. Dibuje el émbolo y confirme un vacío de aire, luego inyecte el pentobarbital.
- Confirmar la anestesia por ausencia de movimiento reflejo.
NOTA: Se recomienda usar un ratón anestesiado en lugar de un ratón eutanasiado para una exsanguinación pulmonar completa. - Cortar la piel del ratón y el músculo abdominal en la línea medial, apuntando a la zona cefálica.
- Corte lateralmente para proporcionar un espacio de trabajo más amplio.
2. Exsanguinación pulmonar
- Exponga la capa de diafragma y perforela con fórceps.
- Abra el espacio torácico y corte el área esternal, permitiendo que los pulmones y el corazón sean vistos claramente.
- Cortar el corazón en la aurícula izquierda y el ventrículo derecho.
- Inserte una cánula (24 G) en el área del ventrículo derecho y dirijala a la zona cefálica hasta que llegue a la arteria pulmonar, como se muestra en la Figura 1.
- Encienda la bomba y permita que la solución salina 1x con fosfato (PBS) circule (aproximadamente 200 ml/h) hasta que todo el tejido pulmonar cambie a un color blanco.
3. Fijación del tejido pulmonar
- Retire la tráquea, los pulmones y el corazón.
- Libere los tres órganos cortando los tejidos conectivos circundantes.
- Ate el bronquio principal derecho con un hilo de sutura y corte todos los lóbulos del pulmón derecho.
- (Opcional): los lóbulos del pulmón derecho constan de cuatro partes. Corte estas partes del bronquio principal derecho y divida las partes para su procesamiento como muestras de tejido congelado.
- Inserte el corazón y los lóbulos del pulmón izquierdo en agentes de fijación, ubicados dentro de una jeringa de 10 ml.
ADVERTENCIA: Los agentes de fijación son peligrosos. Use un equipo de protección adecuado (por ejemplo, guantes de goma largos) y trabaje en una habitación bien ventilada. - Cree una condición de vacío utilizando una jeringa de 10 ml para inflar el pulmón, como se muestra en la Figura 2.
- Inserte una cánula (20 G) en la tráquea y ate un nudo.
- Infle el pulmón con agentes de fijación para comprobar si hay fugas, utilizando una jeringa de 1 ml.
- Transferencia a equipos de presión de fijación pulmonar, como se ilustra en la Figura 3.
- Después de los períodos de fijación, retire la muestra pulmonar que ate la tráquea con un nudo.
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Representative Results
Como se describió anteriormente, el equipo especializado, que genera una presión constante extendida, se puede dividir en tres partes(Figura 3A). La parte inferior es el punto en el que insertar la muestra pulmonar(Figura 4A). El pulmón está conectado a través de una cánula (20 G) a la punta del flujo de formalina utilizando una polla de parada de tres vías(Figura 4B). La presión se genera a partir de los diferentes niveles superficiales de los agentes de fijación entre los contenedores inferior y superior (Figura 5). La diferencia de presión es de 25 cmH2O; sin embargo, utilizando la perilla de ajuste de altura, la presión se puede ajustar dentro del rango de 25-30 cmH2O(Figura 5). Una bomba conecta los contenedores inferior y superior a través de tubos(Figura 3A),preservando una diferencia de 25 cm en la fijación de la altura de la superficie del agente. La dirección del flujo de agente se describe en la Figura 3B.
A continuación se presenta un resultado representativo de los hallazgos histológicos en el pulmón, después de 48 horas de fijación. Los ratones SMP30-KO macho de seis meses de edad estuvieron expuestos al humo del cigarrillo o al aire fresco (según el control) durante 8 semanas. Ambos especímenes de tejido fueron teñidos con hematoxilina y eosina. Figura 6 A muestra los hallazgos histológicos de los ratones expuestos al aire, que no mostraron una marcada ampliación del espacio aéreo. Por el contrario, la Figura 6B revela una agrandamiento significativa del espacio aéreo y la destrucción de la pared alveolar en ratones expuestos al humo crónico del cigarrillo.
Las interceptaciones lineales medias (MLI) se determinaron de acuerdo con el método descrito por Thurlbeck et al. 20 para acceder al tamaño del espacio aéreo. El índice destructivo (DI) se determinó para evaluar la destrucción de la pared alveolar de acuerdo con el método descrito por Saetta et al. 21. Estos exámenes morfométricos de la muestra pulmonar revelaron que la DI y la MLI fueron significativamente mayores en los ratones SMP30-KO expuestos al humo que en los ratones expuestos al aire(Figura 6C,D).
Figura 1: Exsanguinación pulmonar. Se insertó una cánula en la ubicación del ventrículo derecho y se dirigió a la arteria pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inflación pulmonar de jeringa de vacío. Condición de vacío dentro de la jeringa de 10 ml que contiene agentes de fijación para inflar los pulmones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Equipo de fijación pulmonar. (A) El equipo acrílico permitió una diferencia de presión de 25 cmH2O para inflar los pulmones continuamente durante 48 horas, utilizando una máquina de bomba. (B) La dirección del flujo del agente de fijación se indica mediante flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Contenedor inferior. (A) La muestra de pulmón del ratón se colocó dentro de los agentes de fijación en el recipiente inferior. (B) Dentro del contenedor inferior, hay una caja de colocación de muestra, en la parte superior de la cual la formalina fluye a través de un tapón de tres vías y la cánula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Contenedor superior y perilla de ajuste de altura. El contenedor superior generó una presión de 25 cmH2O. Hay dos pares de perillas de ajuste de altura que se pueden utilizar para ajustar la altura del contenedor superior; como resultado, la presión que se genera se puede establecer dentro del rango de 25–30 cmH2O. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Hallazgos histológicos y morfométricos del pulmón del ratón. Imágenes histológicas representativas de secciones pulmonares de ratones SMP30-KO expuestos al humo de cigarrillos de 8 semanas (6 meses de edad, machos), manchados con hematoxilina-eosina. Barra de escala a 100 m. (A) El grupo expuesto al aire no mostró una ampliación significativa ni otros hallazgos. (B) El grupo expuesto al humo del cigarrillo mostró una marcada ampliación del espacio aéreo y la destrucción de la pared alveolar. (C) Las interceptaciones lineales medias (MLI). En los pulmones de los ratones expuestos al humo de cigarrillos, mlI fue significativamente mayor que los ratones expuestos al aire (*p < 0.001). (D) El índice destructivo (DI). En los pulmones de los ratones expuestos al humo del cigarrillo, la DI se incrementó significativamente en comparación con los pulmones de ratones expuestos al aire (*p < 0,001). Los valores se presentan como medias de SD (n a 6 para cada grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El procedimiento de fijación para los pulmones de roedores que se presenta aquí no es novedoso; sin embargo, este sistema tiene varias ventajas. En primer lugar, puede fijar muchos pulmones (máximo de 20) con la misma condición a la vez. La Sociedad de Patología Toxicológica afirma que la presión por la insclasificación de gravedad varía de 22–25 cmH2O22. En particular, varios estudios han realizado fijación pulmonar a una presión de 25 cmH2O13,19,23,24,25,26,27 , que ha sido adoptado en nuestro laboratorio utilizando el sistema actual12,15,16,17,18.
En segundo lugar, puede fijar los tejidos pulmonares a una presión constante durante varios períodos de tiempo. En nuestro laboratorio, las muestras pulmonares generalmente se fijan durante 48 h. Muchos investigadores utilizan un período de tiempo relativamente corto (por ejemplo, 5-20 min)13,28,29,30,31,32, luego atar el pulmón inflado y sumergir se sumergió en formal para períodos prolongados como se desee. No hay datos o investigaciones que indiquen un estándar de oro para la duración de la fijación pulmonar. Sin embargo, la declaración de la American Thoracic Society (ATS)/European Respiratory Society (ERS) describe el "estándar de plata", en el que se debe mantener la presión de inflado de las vías respiratorias durante al menos 24 h14. La Sociedad Japonesa de Patología también recomendó tiempos de fijación de no más de 1 semana para producir diapositivas inmunohistoquímicas consistentes; aunque, su recomendación se basa en el análisis utilizando especímenes humanos33. Los períodos de tiempo de fijación relativamente cortos pueden no ser aplicables al sistema actual, ya que se supone que cada muestra se coloca individualmente en el contenedor inferior. Esta es una limitación del sistema actual. En conclusión, se desconoce el tiempo adecuado para la fijación pulmonar del ratón.
Los pasos críticos en este método están relacionados con el riesgo de fuga de formalina pulmonar durante el proceso de fijación de la formalina. La fuga de formalina pulmonar puede causar contracción del tamaño del pulmón. Este riesgo se puede dividir en dos partes. La primera parte ocurre durante el paso de sacrificio. Al abrir la jaula torácica, es importante no causar lesiones en la superficie pulmonar. La clave para la prevención es abordar esto desde el diafragma y continuar cortando la caja torácica después de que el pulmón se separa de la pleura parietal. Este método evita lesiones pulmonares causadas por equipos quirúrgicos. Otro paso clave ocurre al atear el bronquio principal derecho. Es importante identificar cuáles son los lóbulos correctos del ratón. Colocar los pulmones en una posición donde se pueden ver desde una vista dorsal permite una identificación más fácil de la ubicación de los pulmones.
La segunda parte es durante el proceso de fijación pulmonar utilizando equipos especializados. Se produce un paso crítico al insertar la muestra pulmonar en el puerto de formalina del recipiente inferior. Debe confirmarse que la inserción está estrechamente asegurada para evitar la desprendimiento de la muestra pulmonar del puerto de formalina durante el proceso de presurización constante. Otro aspecto a destacar es la conexión de tubos entre las tres partes del equipo especializado (contenedor inferior, contenedor superior y bomba). Todas las conexiones del tubo deben estar estrechamente conectadas. Si se produce una fuga, el volumen de la formalina en el contenedor superior disminuirá, reduciendo así la presión constante.
Según las recomendaciones de la Sociedad de Patología Toxicológica, la instilación intratraal de la formalina tiene ventajas para el modelo de pulmón de roedores, que prevalecen sobre sus desventajas22. Han sugerido el uso de un método de fijación de formalina intratracicatrizal al realizar estudios cuantitativos de la morfometría pulmonar alveolar. La inscripción pulmonar intratraal tiene dos ventajas, incluyendo la preservación de las vías respiratorias y la pared alveolar, así como la visualización del parénquima pulmonar22. Un estudio de Braber et al. reveló que el método de insinfección de formalina intratraqueal es superior en términos de preservación de la estructura pulmonar en comparación con los métodos de inflación al vacío y perfusión de todo el cuerpo13. El método actual utiliza la inscriplación intratraal en un modelo de ratón para optimizar la visualización del área alveolar.
En cuanto a los agentes de fijación, se utiliza convencionalmente el 10% de formalina, que contiene formaldehído. El formaldehído es ampliamente utilizado como un agente de fijación para las investigaciones inmunopatológicas porque no destruye completamente la inmunogenicidad de proteínas. Sin embargo, la declaración ATS/ERS no recomienda la fijación de formalina, ya que no estabiliza adecuadamente la estructura tisular14. Glutaraldehído se recomienda para la insinsatación de las vías respiratorias en su lugar; sin embargo, está sujeto a destruir la inmunogenicidad proteica, lo que resulta en un agente de fijación inadecuado para la inmunohistoquímica. Varias pruebas han informado de que los pulmones fijos pueden proporcionarse para la evaluación morfométrica (por ejemplo, interceptaciones lineales medias, superficie interna e índice destructivo) después de la fijación de la formalina utilizando el sistema de fijación actual12 , 15 , 16 , 17 , 18. Ciertamente, el glutaraldehído puede ser adoptado para el sistema actual; por lo tanto, los investigadores pueden elegir ambos agentes en el sistema actual de acuerdo con las necesidades experimentales.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses en competencia que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) y el Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño de los métodos actuales y en la escritura del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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