Summary
Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.
Abstract
L'enfisema è una caratteristica significativa della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Gli studi che coinvolgono un modello murino enfisematoso richiedono una fissazione polmonare ottimale per produrre campioni istologici affidabili del polmone. A causa della natura della composizione strutturale del polmone, che consiste in gran parte di aria e tessuto, c'è il rischio che collassi o si sgonfi durante il processo di fissazione. Esistono vari metodi di fissaggio polmonare, ognuno dei quali ha i propri vantaggi e svantaggi. Il metodo di fissazione polmonare qui presentato utilizza una pressione costante per consentire una valutazione ottimale dei tessuti per gli studi che utilizzano un modello polmonare di topo infisematoso. Il vantaggio principale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta. Gli esemplari polmonari sono ottenuti da topi cronici esposti al fumo di sigaretta. La fissazione polmonare viene eseguita utilizzando apparecchiature specializzate che consentono la produzione di pressione costante. Questa pressione costante mantiene il polmone in uno stato ragionevolmente gonfiato. Così, questo metodo genera un esemplare istologico del polmone che è adatto per valutare il fumo di sigaretta indotta enfisema lieve.
Introduction
La BPCO è una delle principali cause di morte a livello mondiale1. Il fumo di sigaretta è la causa più importante della BPCO, ma i meccanismi di patogenesi rimangono incompleti. La BPCO dimostra due caratteristiche principali, tra cui la progressiva limitazione del flusso d'aria e una risposta infiammatoria anormale del polmone. Il disturbo dell'insensato si verifica frequentemente nei polmoni dei pazienti affetti da BPCO2. I risultati patologici dell'enfisema sono caratterizzati dalla distruzione della parete alveolare3. Diverse specie animali sono state utilizzate per generare modelli di BPCO in vivo (ad esempio cani, porcellini d'India, scimmie e roditori)4. Tuttavia, il mouse è diventato il più comunemente utilizzato nella costruzione di modelli di BPCO. Questo ha molti vantaggi, tra cui il suo basso costo, la capacità di essere geneticamente modificato, ampia disponibilità di informazioni genomiche, disponibilità di anticorpi, e la capacità di utilizzare una varietà di ceppi di topo5. Attualmente, non esiste un modello di mouse in grado di imitare tutte le caratteristiche della BPCO umana; pertanto, i singoli ricercatori devono scegliere quale modello è più adatto per la ricerca specifica sulla BPCO6. Il modello murino enfisematoso è uno dei molti modelli di topo BPCO attualmente disponibili. Altri modelli includono il modello del mouse di esacerbazione, il modello di co-morbidità sistemiche e il modello di suscettibilità della BPCO7.
Il modello murino enfisematoso può essere generato da diversi tipi di agenti esogeni, tra cui agenti chimici e esposizione al fumo di sigaretta4. L'esposizione chimica (ad esempio, per elastasi) produce un grave tipo di enfisema, mentre il fumo di sigaretta provoca un lieve enfisema8,9. Si ritiene che il fumo di sigaretta sia la causa principale della patogenesi della BPCO; pertanto, la scelta del fumo di sigaretta come mezzo per creare un modello di topo BPCO è ragionevole10. Molti studi hanno usato il fumo di sigaretta per creare enfisema nel mouse. Ad esempio, Nikula ealtri hanno creato con successo un modello di topo enfisematoso da topi femminili B6C3F1 esponendoli al fumo di sigaretta per 7 o 13 mesi11. Abbiamo anche stabilito un modello di topo enfisematoso tramite proteina marcatore di senescenza/topi SMP-30 KO12. È fondamentale eseguire un metodo di fissazione polmonare in grado di visualizzare correttamente questo modello di enfisema lieve dall'esposizione al fumo di sigaretta.
Sono stati stabiliti vari metodi per la fissazionepolmonare 13. Tuttavia, non esiste un metodo gold standard di fissazione del tessuto polmonare per la valutazione dell'enfisema14. Diversi studi di questo laboratorio hanno dimostrato che il sistema di fissazione qui presentato è utile creando una condizione stabile per la valutazione dell'enfisema12,15,16,17,18. Il vantaggio principale del sistema attuale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta senza collasso polmonare o deflazione. L'attuale sistema di fissazione polmonare utilizza alcune attrezzature speciali che consentono ai campioni polmonari di essere gonfiati ad una pressione costante appropriata per un determinato periodo. Questa attrezzatura speciale è composta da tre parti, tra cui un contenitore inferiore, contenitore superiore e pompa. I campioni polmonari vengono collocati nel contenitore inferiore collegato agli agenti di fissaggio pressurizzati, determinando una differenza di pressione di 25 cmH2O nel livello degli agenti tra i contenitori superiore e inferiore19.
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Protocol
I seguenti metodi sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine. Sono state seguite le Linee guida per la corretta condotta degli esperimenti sugli animali, Science Council of Japan, 1 giugno 2006. Ci sono tre passaggi principali in questo metodo: 1) dissezione del topo, 2) essanguinazione polmonare, e 3) fissazione dei tessuti polmonari assistiti da attrezzature specializzate. Tipicamente, i campioni polmonari vengono elaborati all'incorporamento dopo 48 h di fissazione12,15,16,17,18.
1. Dissezione del mouse
- Misurare il peso corporeo del mouse, quindi determinare la quantità di pentobarbital da amministrare.
- Iniettare pentobarbital intraperitonealmente ad un dosaggio di 70 mg/kg di peso corporeo e confermare l'anestesia per l'assenza di reazione al pizzico dei dei dei dei dei dei dei dei pipi'.
- Iniettare l'ago con un angolo di 45 gradi fino a penetrare nella pelle e nel muscolo. Disegnare lo stantuffo e confermare un vuoto d'aria, quindi iniettare il pentobarbital.
- Confermare l'anestesia per assenza di movimento riflesso.
NOTA: L'uso di un topo anestetizzato al contrario di un topo eutanasia è raccomandato per una essanguinazione completamente polmonare. - Tagliare la pelle del topo e il muscolo addominale alla linea mediale, puntando all'area cefalica.
- Tagliare lateralmente per fornire uno spazio di lavoro più ampio.
2. Essanguinazione polmonare
- Esporre lo strato diaframma e forarlo con pinze.
- Aprire lo spazio toracico e tagliare l'area sternale, permettendo ai polmoni e al cuore di essere visti chiaramente.
- Tagliare il cuore nell'atrio sinistro e nel ventricolo destro.
- Inserire una cannula (24 G) nell'area ventricale destra e dirigerla verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare, come mostrato nella Figura 1.
- Accendere la pompa e lasciare che la salina 1x tampone fosfato (PBS) circoli (circa 200 mL/h) fino a quando tutto il tessuto polmonare cambia in un colore bianco.
3. Fissazione del tessuto polmonare
- Rimuovere la trachea, i polmoni e il cuore.
- Liberare tutti e tre gli organi tagliando i tessuti connettivi circostanti.
- Legare il giusto bronco principale con un filo di sutura e tagliare tutti i lobi del polmone destro.
- (Facoltativo): i lobi del polmone destro sono costituiti da quattro parti. Tagliare queste parti dal bronco principale destro e dividere le parti per la lavorazione come campioni di tessuto congelato.
- Inserire il cuore e i lobi del polmone sinistro negli agenti di fissaggio, situati all'interno di una siringa da 10 mL.
AVVISO: gli agenti di fissaggio sono pericolosi. Indossare attrezzature protettive adeguate (ad esempio, guanti di gomma lunghi) e lavorare in una stanza ben ventilata. - Creare una condizione di vuoto utilizzando una siringa da 10 mL per gonfiare il polmone, come illustrato nella Figura 2.
- Inserire una cannula (20 G) nella trachea e legare un nodo.
- Gonfiare il polmone con agenti di fissaggio per verificare con eventuali perdite, utilizzando una siringa da 1 mL.
- Trasferimento alle apparecchiature di pressione per la fissazione polmonare, come illustrato nella figura 3.
- Dopo i periodi di fissaggio, rimuovere il campione polmonare legando la trachea con un nodo.
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Representative Results
Come descritto in precedenza, l'apparecchiatura specializzata, che genera una pressione costante estesa, può essere suddivisa in tre parti (Figura 3A). La parte inferiore è il punto in cui inserire il campione polmonare (Figura 4A). Il polmone è collegato tramite una cannula (20 G) alla punta del flusso di formalina utilizzando un cazzo di arresto a tre vie (Figura 4B). La pressione è generata dai diversi livelli superficiali degli agenti di fissaggio tra i contenitori inferiore e superiore (Figura 5). La differenza di pressione è di 25 cmH2O; tuttavia, utilizzando la manopola di regolazione dell'altezza, la pressione può essere regolata entro l'intervallo di 25-30 cmH2O (Figura 5). Una pompa collega i contenitori inferiore e superiore tramite tubi (Figura 3A), preservando una differenza di 25 cm nell'altezza della superficie dell'agente di fissaggio. La direzione del flusso dell'agente è descritta nella Figura 3B.
Presentato successivamente è un risultato rappresentativo di risultati istologici nel polmone, dopo 48 h di fissazione. I topi Maschi SMP30-KO di sei mesi sono stati esposti al fumo di sigaretta o all'aria fresca (sotto controllo) per 8 settimane. Entrambi gli esemplari di tessuto sono stati macchiati con ematossialina ed eosina. Figura 6 A mostra i risultati istologici dei topi esposti all'aria, che non hanno mostrato un marcato allargamento dello spazio aereo. Al contrario, la figura 6B rivela un significativo allargamento dello spazio aereo e la distruzione delle pareti alveolare nei topi esposti al fumo di sigaretta cronico.
Le intercettazioni lineari medi (MLI) sono state determinate in base al metodo descritto da Thurlbeck et al. 20 per accedere alle dimensioni dello spazio aereo. L'indice distruttivo (DI) è stato determinato a valutare la distruzione della parete alveolare secondo il metodo descritto da Saetta et al. 21.Questi esami morfometrici del campione polmonare hanno rivelato che di e MLI erano significativamente maggiori nei topi SMP30-KO esposti al fumo rispetto ai topi esposti all'aria (Figura 6C,D).
Figura 1: essanguinazione polmonare. Una cannula è stata inserita nella posizione del ventricolo destro e diretta all'arteria polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Inflazione polmonare della siringa a vuoto. Condizione del vuoto all'interno della siringa da 10 mL contenente agenti di fissaggio per gonfiare i polmoni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Attrezzature di fissaggio polmonari. (A) L'apparecchiatura acrilica ha permesso una differenza di pressione di 25 cmH2O per gonfiare continuamente i polmoni per 48 h, utilizzando una macchina pompa. (B) La direzione del flusso dell'agente di fissaggio è indicata da frecce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Contenitore inferiore. (A) Il campione polmonare del topo è stato posizionato all'interno di agenti di fissaggio nel contenitore inferiore. (B) All'interno del contenitore inferiore, c'è una scatola di posizionamento campione, nella parte superiore della quale formalina scorre attraverso un stopcock a tre vie e la cannula. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Contenitore superiore e manopola di regolazione dell'altezza. Il contenitore superiore ha generato una pressione di 25 cmH2O. Ci sono due coppie di manopole di regolazione dell'altezza che possono essere utilizzate per regolare l'altezza del contenitore superiore; di conseguenza, la pressione che viene generata può essere impostata all'interno dell'intervallo di 25-30 cmH2O. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati istologici e morfometrici polmonari del topo. Rappresentante immagini istologiche di sezioni polmonari da 8 settimane di fumo di sigaretta esposti o topi SMP30-KO esposti all'aria (6 mesi, maschi), macchiati con ematossicina-eosina. Barra della scala: 100 m. (A) Il gruppo esposto all'aria non ha mostrato un allargamento significativo o altri risultati. (B) Il gruppo esposto al fumo di sigaretta ha mostrato un marcato allargamento dello spazio aereo e la distruzione delle pareti alveolar. (C) Le intercettazioni lineari mediche (MLI). Nei polmoni dei topi esposti al fumo di sigaretta, l'MLI era significativamente maggiore rispetto ai topi esposti all'aria (p < 0,001). (D) L'indice distruttivo (DI). Nei polmoni dei topi esposti al fumo di sigaretta, la DI è stata significativamente aumentata rispetto ai polmoni dei topi esposti all'aria (p < 0,001). I valori sono presentati come media : SD (n - 6 per ogni gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La procedura di fissazione per i polmoni dei roditori qui presentata non è una novità; tuttavia, questo sistema ha diversi vantaggi. In primo luogo, può fissare molti polmoni (massimo 20) con la stessa condizione in una sola volta. La Società di Patologia Tossicologica afferma che la pressione per l'instillazione gravitazionale varia da 22 a 25 cmH2O22. In particolare, diversi studi hanno eseguito fissazione polmonare ad una pressione di 25 cmH2O13,19,23,24,25,26,27 , che è stato adottato nel nostro laboratorio utilizzando l'attuale sistema12,15,16,17,18.
In secondo luogo, può fissare i tessuti polmonari a una pressione costante per vari periodi di tempo. Nel nostro laboratorio, i campioni polmonari sono di solito fissati per 48 h. Molti ricercatori utilizzano un periodo di tempo relativamente breve (ad esempio, 5-20 min)13,28,29,30,31,32, quindi legare il polmone gonfiato e immergersi in formalina per periodi prolungati come desiderato. Non ci sono dati o ricerche che indicano un gold standard per la durata della fissazione polmonare. Tuttavia, la dichiarazione dell'American Thoracic Society (ATS)/European Respiratory Society (ERS) descrive lo "standard d'argento", in cui la pressione inflazionistica delle vie aeree deve essere mantenuta per almeno 24 h14. La Società Giapponese di Patologia raccomandava anche tempi di fissazione di non più di 1 settimana per produrre diapositive immunoistochimiche coerenti; anche se, la loro raccomandazione si basa sull'analisi utilizzando campioni umani33. I periodi di fissaggio relativamente brevi potrebbero non essere applicabili al sistema corrente, perché ogni campione dovrebbe essere collocato individualmente nel contenitore inferiore. Si tratta di una limitazione del sistema corrente. In conclusione, il periodo di tempo corretto per la fissazione polmonare del topo rimane sconosciuto.
I passaggi critici di questo metodo sono correlati al rischio di perdita di formalina polmonare durante il processo di fissazione della formalina. La perdita di formalina polmonare può causare un restringimento delle dimensioni polmonari. Questo rischio può essere diviso in due parti. La prima parte si verifica durante la fase di sacrificio. Durante l'apertura della gabbia toracica, è importante non causare lesioni alla superficie polmonare. La chiave per la prevenzione è avvicinarsi a questo dal diaframma e continuare a tagliare la gabbia toracica dopo che il polmone è stato staccato dalla pleura parietale. Questo metodo evita lesioni polmonari causate da apparecchiature chirurgiche. Un altro passo chiave si verifica quando si lega il bronco principale destro. È importante identificare quali sono i lobi destro del mouse. Posizionare i polmoni in una posizione in cui possono essere visti da una vista dorsale consente una più facile identificazione della posizione dei polmoni.
La seconda parte è durante il processo di fissazione polmonare utilizzando attrezzature specializzate. Un passo critico si verifica durante l'inserimento del campione polmonare nella porta di formalina del contenitore inferiore. Deve essere confermato che l'inserimento è ben fissato per evitare il distacco del campione polmonare dalla porta di formalina durante il processo di pressurizzazione costante. Un altro aspetto da evidenziare è la connessione tubo tra le tre parti di attrezzature specializzate (contenitore inferiore, contenitore superiore, e pompa). Tutti i collegamenti tubori devono essere strettamente collegati. Se si verifica una perdita, il volume di formalina nel contenitore superiore diminuirà, riducendo così la pressione costante.
Secondo le raccomandazioni della Society of Toxicologic Pathology, l'instillazione intratracheale della formalina ha vantaggi per il modello polmonare del roditore, che prevalgono sui suoi svantaggi22. Hanno suggerito l'uso di un metodo di fissazione formale intratracheale quando si eseguono studi quantitativi di morfometria polmonare alveolare. L'instillazione polmonare intratracheale presenta due vantaggi, tra cui la conservazione delle vie aeree e della parete alveolar, nonché la visualizzazione del parenchyma polmonare22. Uno studio di Braber et al. ha rivelato che il metodo di instillazione della formalina intratracheale è superiore in termini di conservazione della struttura polmonare rispetto all'inflazione sottovuoto e ai metodi di perfusione per tutto il corpo13. Il metodo attuale utilizza l'instillazione intratracheale in un modello murino per ottimizzare la visualizzazione dell'area alveolare.
Per quanto riguarda gli agenti di fissaggio, 10% formalina, che contiene formaldeide, è convenzionalmente utilizzato. La formaldeide è ampiamente utilizzata come agente di fissaggio per le indagini immunopatologiche perché non distrugge completamente l'immunogenicità delle proteine. Tuttavia, l'istruzione ATS/ERS non raccomanda la fissazione della formalina, perché non stabilizza adeguatamente la struttura del tessuto14. La glutaraldeide è raccomandata per l'instillazione delle vie aeree invece; tuttavia, è soggetto a distruggere l'immunogenicità proteica, che si traduce in un agente di fissaggio inadatto per l'immunohistochimica. Diversi elementi di prova hanno riferito che i polmoni fissi possono essere forniti per la valutazione morfometrica (ad esempio, intercettazioni lineari medi, superficie interna e indice distruttivo) a seguito della fissazione della formalina utilizzando l'attuale sistema di fissazione12 , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17 mi lato , 18. Certamente, la glutaraldeide può essere adottata per il sistema attuale; così, i ricercatori possono scegliere entrambi gli agenti nel sistema attuale in base alle esigenze sperimentali.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi contradditori da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte da JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e dall'Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Il fingeto non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dei metodi attuali e nella scrittura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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