تنظيم البيئة الكروماتين عملية أساسية للتعبير الجيني السليم. هنا، يمكننا وصف أسلوب للتحكم بالتعبير الجيني عن طريق تعيين الكروماتين–تعديل الآلية بطريقة خاصة بالجينات وعكسها.
تنظيم الضغط الكروماتين هو عملية هامة وينظم التعبير الجيني في حقيقيات النوى أعلى. على الرغم من أن الضغط الكروماتين وتنظيم تعبير الجينات تتعطل شائعة في العديد من الأمراض، يكن هناك طريقة محددة المكان، والذاتية، وعكسها لدراسة ومراقبة هذه الآليات من العمل. لمعالجة هذه القضية، لدينا المتقدمة وتتميز جزيئات بيفونكشونال رواية تنظيم الجينات. بربط واحد مكون من جزيء بيفونكشونال رابط بروتين الحمض النووي حيث أن أنه سيتم تعيين لمكان اليل على حدة. ويشرك العنصر الآخر الذاتية الآلية الخلوية تعديل الكروماتين، توظيف هذه البروتينات لجينات للفائدة. هذه الجزيئات الصغيرة، تسمى معدلات جينية الكيميائية (CEMs)، القادرة على التحكم في التعبير الجيني والبيئة الكروماتين بطريقة تعتمد على الجرعة وعكسها. هنا، نحن التفصيل نهجاً جيم وتطبيقه على إنقاص التعبير الجيني و acetylation الذيل هستون في مراسل أخضر نيون بروتين (بروتينات فلورية خضراء) يقع في محور Oct4 في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). نحن تميز القيادة جيم (CEM23) باستخدام مجهر فلوري والتدفق الخلوي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة)، متبوعاً كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). بينما يتضح قوة هذا النظام في محور Oct4 ، نظرياً، التكنولوجيا جيم هو نمطي ويمكن تطبيقه في أنواع الخلايا الأخرى، وفي غيرها المكاني الجينوم.
الكروماتين يتكون من الحمض النووي الملتفة حول هيستون أوكتامير البروتينات التي تشكل الجسيمات نوكليوسومي الأساسية. تنظيم الضغط الكروماتين إليه أساسية للمناسبة الحمض النووي وإصلاح النسخ المتماثل، والتعبير1،2،3. إحدى الطرق التي الخلايا التحكم في مستوى الضغط عن طريق إضافة أو إزالة التعديلات ذيل هيستون بوستترانسلاشونال مختلفة. اثنان من هذه التعديلات تشمل acetylation يسين (1)، والأكثر شيوعاً المرتبطة التنشيط الجيني، ومثلايشن يسين (2)، التي يمكن أن تكون مرتبطة بتنشيط الجينات أو القمع، تبعاً للسياق من الأحماض الأمينية. إضافة علامات acetylation ومثلايشن هو تحفزها هيستون أسيتيلترانسفيراسيس (القبعات) وهيستون ميثيلترانسفيراسيس (همتس)، على التوالي، في حين يتم إزالة العلامة هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس) وهيستون ديميثيلاسيس (HDMs )، على التوالي4،5. على الرغم من وجود هذه البروتينات معروفا منذ عقود، آليات عديدة كيف الكروماتين–تعديل إليه يظل يعمل بشكل صحيح تنظيم التعبير الجيني تعريف. نظراً للعمليات التنظيمية الكروماتين dysregulated في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، رؤى ميكانيكية جديدة يمكن أن تؤدي إلى تطبيقات علاجية في المستقبل.
الكروماتين في فيفو المقايسة (السي أي أية) هو تقنية وصف مؤخرا يستخدم محفز كيميائية القرب (CIP) للتحكم في الكروماتين–تعديل إليه التوظيف إلى موضع محدد6. قد استخدمت هذه التكنولوجيا لدراسة قائمة توسيع ديناميات الكروماتين، بما في ذلك البروتينات هستون تعديل, remodelers الكروماتين، والنسخ العوامل6،7،،من89. الكروماتين على أساس CIP الربط من البروتينات مناشئ أعرب أيضا قد مدد في الماضي وكالة المخابرات المركزية الأمريكية تعدل غير التعديل الجيني المكاني الاستخدام مع بروتين المرتبط بتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر كريسبر المعطلة (dCas9) 10 , 11-في نظام السي أي أية، وتم تعديل ميسكس للتعبير عن جين مراسل بروتينات فلورية خضراء في محور Oct4 ، منطقة الغاية المعلنة والتنظيم الصارم لجينوم مسك. سابقا، وقد طبق هذا النظام لوصف توظيف إنزيم التي تربط بين H3K9me3 وتنتشر علامات القمعية (مثلاً، H3K9me3) هيتيروتشروماتين أعرب عن مناشئ البروتين 1 (HP1)، تعتمد على الجرعة وعكسها والحمض النووي مثلايشن6. لإنجاز هذا النوع من استراتيجية التوظيف، مصابون ميسكس بلازميد يعبر عن FK506 ملزمة بروتين (فكبب) مرتبطة Gal4، وهو نقطة ربط الحمض النووي-بروتين الذي يربط بين مجموعة Gal4-ملزمة المنبع للمراسل بروتينات فلورية خضراء. الخلايا مصابون أيضا مجال فكبب-ربمسن-ملزمة (FRB) متصلاً HP1. عندما ميسكس يتعرضون لتركيزات منخفضة نانومولار المركز الدولي للبطاطا، ربمسن، FRB وفكبب، هي جمعت في المكان المستهدف. في غضون أيام علاج ربمسن، تقمع التعبير عن الجين المستهدف، كما يتضح من الأسفار مجهرية والتدفق الخلوي، وانخفض acetylation هستون، سيظهر برقاقة وتسلسل بيكبريتيت. بينما التنمية والتحقق من صحة هذا النهج تم تحقيق تقدم كبير في مجال البحوث الكروماتين والتنظيم، عيب واحد هو تعبير الخارجية المطلوبة لتعديل الكروماتين إليه.
لجعل التكنولوجيا القائمة على التوظيف فقط الإنزيمات ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية الذاتية وجعل نظام المرن أكثر، مصممة، وتتميز جزيئات بيفونكشونال الرواية، ووصف يتبع (الشكل 1)12. يتضمن مكون واحد من يتبع FK506 الذي يماثل ربمسن، يربط محكم وعلى وجه التحديد إلى فكبب. وهكذا، سيتم تعيين يتبع لا يزال لمحور Oct4 في ميسكس السي أي أية. العناصر الأخرى من يتبع هو النصف الذي يربط إليه تعديل الكروماتين الذاتية. في دراسة تجريبية، اختبرنا CEMs التي تحتوي على مثبطات هداك. بينما مفهوم استخدام المانع تجنيد هداكس يبدو غير بديهية، المانع غير قادرة على توظيف النشاط هداك للجينات للفائدة. يتم ذلك عن طريق (1) إعادة توجيه في هداك إلى موضع، الإفراج عن الإنزيم، وزيادة كثافة هداكس تحول دون الأمم المتحدة في المنطقة، وتثبيط هداك (2) الحفاظ على في موضع، ولكن توظيف مجمعات القمعية التي تربط هداكس تحول دون، أو (3) مزيج من كليهما. في دراسة سابقة، نحن بينت أن يتبع قادرة على قمع بنجاح المراسل بروتينات فلورية خضراء بطريقة تعتمد على جرعة ووقت، وكذلك في طريقة سرعة عكسها (أيفي غضون 24 ساعة)12. نحن تتميز قدرة التكنولوجيا جيم المقدمة هنا للتعبير الجيني التحكم باستخدام مجهر الأسفار، والتدفق الخلوي، والقدرة للتحكم في بيئة الكروماتين باستخدام رقاقة قبكر6. هنا، يمكننا وصف طريقة لاستخدام وتميز CEMs، مما سيسهل التكيف مع هذا النظام للإجابة على الأسئلة الإضافية ذات الصلة بعلم الأحياء الكروماتين.
هنا، يمكننا وصف النظام جيم وضعت مؤخرا يجري تطبيقها على تنظيم التعبير الجيني والبيئة الكروماتين في جين معين بطريقة تعتمد على الجرعة. نحن نقدم طريقة دقيقة لدراسة ديناميات المشاركة في تنظيم التعبير الجيني من خلال التوظيف الانتقائي من البروتينات التنظيمية المحددة الكروماتين الذاتية. هذا هو…
The authors have nothing to disclose.
المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات هاثاوي وجين للمناقشات المفيدة. كما يشكر المؤلفون كرونا دان وإيان ماكدونالد للقراءة الحرجة من المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا R01GM118653 منحة من “معاهد الصحة الوطنية الأمريكية” (إلى N.A.H.)؛ وقبل منح R01GM122749، R01CA218600، و R01HD088626 من المستوى الوطني الأمريكي معاهد الصحة (ج. ج.). كما أيد هذا العمل مستوى 3 وطالب بمنحه من معهد اشيلمان UNC للابتكار (N.A.H و A.M.C، على التوالي). تمويل إضافي من GM007092 T-32 (A.M.C) تدعم هذا العمل. تم الحصول على بيانات التدفق الخلوي في UNC التدفق الخلوي الأساسية مرفق تموله P30 CA016086 السرطان مركز الأساسية دعم منحة لمركز السرطان الشامل لينبرجر UNC.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |