Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Abstract

Düzenleme, kromatin sıkıştırma daha yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonu yöneten önemli bir süreçtir. Kromatin sıkıştırma ve gen ifade düzenlemesi yaygın birçok hastalıklarda kesintiye rağmen çalışma ve mekanizmaların eylem kontrol odağı özgü, endojen ve tersinir bir yöntem eksik edilmiştir. Bu sorunu gidermek için biz geliştirdik ve gen düzenleyen yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. Böylece bir formda özel locus alınacaktır bifonksiyonel molekülünün bir bileşeni bir DNA-protein çapa bağlar. Başka bir bileşen bu proteinler bir gen ilgi için işe endojen hücresel kromatin değiştirme, iş makineleri yürütmektedir. Bu küçük moleküllerin kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEMs) denilen, gen ekspresyonu ve kromatin çevre doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde kontrol yeteneğine sahiptirler. Burada, CEM yaklaşım ve gen ekspresyonu ve histon kuyruk asetilasyon Oct4 locus fare embriyonik kök hücreler (mESCs) içinde yer alan yeşil flüoresan Protein (GFP) gazeteci, azaltmak için uygulama ayrıntılı. Biz kurşun karakterize floresan mikroskopisi, akış sitometresi ve kromatin immunoprecipitation (ChIP), CEM (CEM23) takip nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından. Bu sistemin gücü Oct4 odağı kavramsal olarak gösterilmiştir, CEM teknoloji modüler ve diğer hücre tipleri ve diğer genomik loci uygulanabilir.

Introduction

Kromatin DNA buna sarılarak çekirdek nucleosome parçacık histon octamer proteinleri oluşur. Kromatin sıkıştırma düzenlenmesi için uygun DNA tamir, çoğaltma ve ifade1,2,3temel bir mekanizmadır. Hücreleri sıkıştırma düzeyini kontrol bir ek veya çeşitli post-translational histon kuyruk değişiklikler kaldırılması yoludur. İki tür değişiklikler en çok gen harekete geçirmek ile ilişkilidir, (1) lizin asetilasyon ve gen harekete geçirmek ya da baskı, amino asit bağlama ile ilişkili olabilir (2) lizin metilasyonu içerir. Kaldırma işareti histon uyku (HDACs) ve histon demethylases (HDMs yapılır ise asetilasyon ve metilasyonu işaretleri ilavesi histon acetyltransferases (şapka) ve histon methyltransferases (HMTs), sırasıyla, katalizlenir ), sırasıyla4,5. Bu proteinler varlığını nasıl kromatin değiştirme makine işleri düzgün Gen ifadesinin düzenlenmesi için tanımlanması gereken kalır yıllardır, çeşitli mekanizmalar bilinmektedir rağmen. Kromatin düzenleyici işlemler dysregulated birçok insan hastalıkları içinde olduğundan, yeni mekanik anlayışlar gelecekteki tedavi uygulamaları için neden olabilir.

Kromatin vivo içinde tahlil (CIA) yakınlık (CIP) kimyasal bir uyarıcı kromatin değiştirme makine işe alım denetlemek için belirli locus6kullanan son zamanlarda açıklanan bir tekniktir. Bu teknoloji kromatin dinamikleri histon-modifiye proteinleri, kromatin remodelers ve transkripsiyon faktörleri6,7,8,9dahil olmak üzere, genişleyen bir listesini incelemek için kullanılmaktadır. CIP tabanlı kromatin exogenously ifade proteinlerin hayvan zinciri de CIA sigara değiştiren genetik loci modüle tarafından devre dışı bırakılmış kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yinelenen denetim CRISPR ilişkili protein (dCas9) ile kullanmak uzatıldı 10 , 11. CIA sisteminde mESCs GFP muhabir gen Oct4 odağı, son derece ifade ve kesinlikle düzenlenmiş alan mESC genom kopyası, hızlı şekilde değiştirilmiştir. Daha önce bu sistem exogenously ifade heterochromatin protein 1 (HP1), H3K9me3 bağlar ve baskıcı işaretleri (Örneğin, H3K9me3) yayar bir enzim doz bağımlı ve tersinir alımı açıklamak için uygulanan ve DNA metilasyon6. İşe alım stratejisi bu tür yapmak için mESCs bir Gal4 bağlama dizi GFP muhabir için akıntıya karşı bağlar bir DNA-protein çapa bir Gal4 bağlı bir FK506-bağlayıcı protein (FKBP) ifade eder bir plazmid ile bulaşmış. Hücreleri de HP1 için bağlı bir FKBP-rapamycin-bağlayıcı etki (FRB) ile bulaşmış. MESCs CIP konsantrasyonları düşük nanomolar maruz kaldığında, rapamycin, FRB ve FKBP, bir araya getirdi hedef odağı. Gün rapamycin tedavisi içinde ifade hedef Gen tarafından floresans mikroskobu ve akış sitometresi kanıtladığı gibi bastırılmış ve çip ve bisülfit sıralamanın tarafından gösterilen histon asetilasyon azalır. Geliştirme ve doğrulama Bu yaklaşımın kromatin araştırma ve düzenleme alanında önemli gelişmeler olmuştur iken, bir dezavantajı gerekli eksojen kromatin değiştirme ifadesidir makine.

Sadece endojen fizyolojik ilgili enzimler işe üzerinde esaslı teknoloji yapmak ve bir daha modüler sistem yapmak için tasarlanmış ve CEMs (Şekil 1)12olarak adlandırdığı yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. CEMs bir bileşeni içerir hangi, rapamycin için benzer sıkı ve özellikle bağlar FK506 FKBP için. Böylece, CEMs hala CIA mESCs Oct4 odağı için alınacaktır. Diğer CEMs endojen kromatin değiştirme makine bağlar bir yan bileşenidir. Bir pilot çalışmada, HDAC inhibitörleri içeren CEMs test ettik. HDACs işe almak için bir inhibitörü kullanarak kavramı karşı sezgisel görünüyor olsa da, engelleyici yine de HDAC etkinliği ilgi gen için recruit yapabiliyor. Bu (1) HDAC odağı, enzim, serbest ve alan ve (2) bakımı HDAC inhibisyon odağı, un Inhibe HDACs yoğunluğu artan ama Inhibe HDACs bağlamak baskıcı kompleksleri işe yönlendirme tarafından gerçekleştirilir, veya (3) her ikisinin bir birleşimi. Bir önceki çalışmada, biz CEMs başarıyla GFP muhabir bir doz ve zaman bağımlı şekilde, hem de hızla geri dönüşümlü bir şekilde bastırmak mümkün olduğunu gösterdi (yani, 24 saat içinde)12. Biz burada ChIP-qPCR6kullanarak kromatin ortamını denetlemek için floresans mikroskobu, akış sitometresi ve yetenek kullanarak denetim gen ekspresyonu için sunulan CEM teknoloji yeteneği ile karakterizedir. Burada, biz kullanarak ve kromatin Biyoloji ile ilgili ek sorularınız cevaplamak için bu sistem adaptasyonu kolaylaştıracaktır CEMs karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) Lentivirus üretimi için hücre satırı kültürü

  1. Taze, düşük-geçiş (geçit 30 daha az) büyümek 293T insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinde yüksek glikoz Dulbecco kartal modifiye'nın orta (DMEM) temel medya % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 10 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), kalem takıma'nın / Strep, 2-mercaptoenthanol 37 ° C kuluçka %5 CO2. Her 3-5 d hücreleri bölme ve > %95 birleşmesi önce olurlar.
  2. Geçit 293T HEK hücreleri ile 18 x 10 cm 15 cm tabak (bir 15 cm tabak için üretilen her virüs)6 .
    1. 15 cm biçimi için eski medya Aspire edin, 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 mL ekleyin, PBS Aspire edin ve 3 mL % 0.05 tripsin ekleyin. Tripsin için 8 dk. 37 ° C'de sallanan ve hücreleri kuluçka yarım dokunarak, hücrelerde kuluçkaya.
      Not: Bu adımın amacı hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmektir.
  3. Hücreleri % 60-%80 confluency ertesi gün ulaştınız, 13,5 µg ile bir polyethylenimine (PEI) transfection psPAX2 plazmid, pMD2.G plazmid 4,5 µg, uyumlu lentiviral teslim vektör 18 µg gen ilgi ile gerçekleştirin (yani , FKBP-Gal4), 108 µL PEI ve transfection medya 1,8 mL.
    1. Yavaşça DNA, PEI ve transfection medya 15 mL konik tüp içinde karıştırın, örnek 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve dropwise 15 cm plakasına eklemek.
      Not: lütfen kullanın uygun güvenlik önlemleri ve tüm kurumsal izleyin ve laboratuvar güvenlik prosedürleri Bu adım sonra tüm reaktifler olarak canlı bir virüs içerir.
  4. 16 h transfection ve % 5 CO237 ° C Kuluçka kuluçka sonra medya Aspire edin ve yavaşça 15 cm tabak taze 293 HEK medya (37 ° C su banyosunda prewarmed) ekleyin. Medya değiştirdikten sonra bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi %5 CO2 ile 48 h için hücrelerde kuluçkaya. Virüs o zaman hasat hazırdır.

2) enfeksiyon, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) ile Lentivirus

  1. Düşük-geçiş (geçit 35 daha az) büyümek, besleyici-Alerjik adapte CIA mESCs yüksek glikoz DMEM temel medya ESC-grade FBS, 10 mM HEPES % 20 ile desteklenmiş, 37 ° C kuluçka % 5 ile 1 x NEAA, kalem/Strep, 2-mercaptoenthanol ve 1:500 lösemi engelleyici faktör (LIF) CO2.
    Not: LIF süpernatant toplu iş iş işlemde toplanan ve-80 ° C'de dondurulmuş COS LIF üreten hücrelerin elde edilir
    1. 1-3 h 1 x PBS içinde % 0,1 jelatin ile preincubated, ve daha sonra 1 x PBS ile yıkanmış plakaları hücrelerin büyümesine. Hücreleri günlük yem ve onları kendi yoğunluğu bağlı olarak her 2-3 d bölünmüş.
      Not: Morfolojik, embriyonik kök hücre (ES) kolonileri küçük, yuvarlak ve birbirinden farklı olmalıdır.
  2. MESC 12-şey plaka biçime (100.000 hücreler/de) 1 d enfeksiyon önce geçiş.
    1. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak. 10 cm biçiminde yetiştirilen hücrelerin, eski medya Aspire edin, 5 mL 1 x PBS ekleyin, PBS Aspire edin ve % 0.25 tripsin 1 mL ekleyin. Tripsin için 8 dk. 37 ° C'de sallanan ve hücreleri kuluçka yarım dokunarak, hücrelerde kuluçkaya. Bu adımın amacı hücreleri tek hücre süspansiyon elde etmektir.
  3. 293T15-cm viral medya değiştirdikten sonra 48 h ve süpernatant 50 mL konik tüp transfer çıkarın adım 1.4, hücrelerden ambalaj.
  4. 300 x g hücre artıkları cips 5 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.
  5. Süpernatant 0.45 µm membran aracılığıyla filtre.
    Not: bazı diğer malzemeler virüs muhafaza ve verimleri önemli ölçüde azaltmak gibi selüloz asetat (SFCA) yüzey aktif-Alerjik membranlar, kullandığınızdan emin olun.
  6. Bir SW32 rotor, bir santrifüj kullanarak ultrasantrifüj, virüsle konsantre ve 20.000 rpm (~ 72,000 x g) 4 ° C'de 2,5 h için spin
  7. Virüs ultrasantrifüj altında yoğunlaşmaktadır iken, CIA mESCs 12-şey plaka 5 µg/mL polybrene de içeren taze ES medya ile tedavi.
  8. Virüs konsantrasyon tamamlandığında, dikkatle süpernatant Aspire edin ve virüs pelet 1 x PBS 100 µL içinde askıya alma (aşırı kabarcıklar önlemek).
  9. Virüs ve 1 x PBS 1.5 mL microfuge tüp ekleyin. Girdap/sallamak vasıl 300 g x (veya en düşük ayarda) tüp tam olarak virüs askıya almak için. Spin aşağı kabarcıklar kaldırmak 5-10 s için bir mini masa üstü santrifüj tüpü.
  10. Virüsün 30 µL 12-şey plaka her şey için ekleyin. Girdap plaka ve plaka 1000 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi.
    Not: Eklendi virüs miktarı ters teslim yapı boyutu için ilgili viral titresi bağlı olarak farklı olabilir.
    1. Alternatif olarak, flash virüs sıvı azot ile dondurma ve-80 ° C'de depolayın Ancak, virüs buz gibi viral titresi düşürecektir.
  11. 12-şey plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun ve medya (2.1 adımda anlatıldığı gibi) ertesi sabah (~ 16 h) daha sonra taze ES medya ile değiştirin.
  12. Enfeksiyon 48 saat sonra uygun antibiyotik (yani, 1,5 µg/mL puromisindir, 10 µg/mL blasticidin, vb) ekleyerek viral plazmid entegre hücreleri seçin. Medya günlük değiştirmek ve yüzer/ölü hücreleri çoğu Eğer 1 x PBS hücrelerle yıkayın. 72-96 h için hücreleri seçimi medyada 37 ° C kuluçka %5 CO2ile devam et.

3) kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEM) s hazırlık ve tedavi

  1. Toz CEM dimetil sülfoksit (DMSO) 1 mM hisse senedi bir konsantrasyon ve 100 µM bir çalışma konsantrasyonu için askıya alma.
  2. Sonra hücre seçimi için 72-96 h, 100.000 hücreler/iyi bir 12-şey biçimiyle mESCs bölünmüş uğramıştır. Daha sonra bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi %5 CO2 24 h için hücrelerde kuluçkaya, 100 medya çözeltisi hazırlamak nM CEM ile ES kitle iletişim araçları. Bu ortamı kullanmak için CIA mESC 1 mL ile besleme/iyi. Bir denetimi hizmet için herhangi bir ek CEMs olmayan hücreler bir kuyu saklayın.
    1. Medya eski medya alıyorum ve 1 mL ekleyerek/de medyanın taze hazırlanmış CEM içeren veya ES CEM ücretsiz bir deneme süresi için her 24 h değiştirin.

4) ifade tarafından mikroskobu ve Akış Sitometresi Analizi

  1. CEM tedavisi olmayan hücreler ve 100 ile tedavi hücreleri CEM tedavi 48 saat sonra görüntü nM floresan mikroskop kullanarak CEM. MESC morfoloji 20 X büyütme, kaydetmek için faz veya aydınlık alan kullanarak temsilcisi görüntüleri almak; hücreleri bir kaç farklılaşmış hücreler yuvarlak koloniler oluşturdular. FITC floresans kanal altında hücre koşulların her ikisi de görüntü.
  2. Denetim ve CEM tedavi hücreler için akış sitometresi medya aspirating, 1 mL 1 x PBS hücrelerle yıkama, PBS aspirating ve % 0.25 tripsin EDTA ile 8-10 min için 0.25 mL ekleyerek izole etmek.
  3. Hücreleri artık büyük kümeleri içinde mikroskop bakarak olduğundan emin olun. 20 X büyütme kullanın. Hücreleri tek hücre süspansiyon içinde olmak gibi görünüyorsa, yavaşça yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ile tam hücreleri trypsinize pipet.
  4. Tripsin 1 mL taze medya ile gidermek ve serolojik pipet ile yüksek hızda hücre resuspend (ya da bir P1000 pipet ve ipucu kullanarak) kadar bir tek hücre süspansiyon hücrelerdir.
  5. Spin aşağı vasıl 300 x g 5 dk. aspiratı süpernatant hücreleri. 1 x PBS ile yıkama ve hücreleri recentrifuge. PBS süpernatant Aspire edin.
  6. Hücre Pelet FACS arabellek (1 mM ethylenediaminetetraacetic asit [EDTA], 1 x PBS ve % 0,2 sığır serum albümin [BSA]) 200 mL resuspend.
    1. FACS arabellek hacmi kaç hücre mevcut, bağlı olacaktır ama konsantrasyon 1000-3000 hücreleri olmalıdır / µL. hücre 3 örnekleri sayısı sayısı ve hücre konsantrasyon ortalama. Daha fazla FACS arabellek gerekirse ekleyin.
  7. Akış Sitometresi > 50.000 hücreleri değil çözümlenmekte zaman buz üzerinde hücreleri tutarak askıya alınan hücrelerle gerçekleştirin. (FITC, AF488, GFP, vb) 530/40 filtre ifadesinde değişiklikleri kaydetmek için kullanın. Tedavi edilmeyen denetim hücre örneği kullanarak uygun floresan gerilim belirlemek ve kaydedilen yoğunluğu yelpazenin ortasında olmak floresan zirve için gerilim küme. Örnekleri kılıf yaklaşık 5000 hücre/s hızında çalışır.
  8. Verileri verme ve ilk geçişi ileri dağılım vs yan dağılım canlı hücreler için ve daha sonra ileri dağılım yüksekliği vs. alan gömlek için bir akış sitometresi program (Örneğin, FlowJo) üzerinde FCS dosyaları çözümle. O zaman, GFP kanal veri göreli GFP ifadede hedef belirlemek ve denetlemek için bir çubuk grafik üzerinde görselleştirmek nüfus.

5) kromatin kromatin Immunoprecipitation (ChIP) takip qPCR Analizi

  1. MESCs bir 10 cm tabak 3 milyon hücrelerle ve ES medya 10 mL bölme (her biri için bir 10 cm tabak deneysel veya kontrol durumu). Ertesi gün, CEM içeren ya da CEM-özgür medya 10 mL ekleyin. CEM tedavi 48 saat sonra eski medya Aspire edin. Yıkama ve 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri Aspire edin. Ardından, % 0.25 tripsin hücrelerle ayırmak ve tripsin ES medya 10 mL ile gidermek. Saymak ve koşul başına 10 milyon hücre örneği yalıtır.
  2. Spin aşağı her 300 x g 5 min için de 10 milyon hücre örnekleri.
  3. Her Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend ve 300 x g 5 min için de hücreleri recentrifuge.
  4. Her Pelet CIA düzeltme arabellek 10 mL resuspend (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM etilen glikol-bis [ß-aminoethyl eter]-N, N, N', N'-tetraacetic asit [EGTA] pH 8 ve 100 mM sodyum klorür [NaCl]). 1 mL % 11 Formaldehit Çözeltisi ekleyin ve hemen x - 10 x 5 örnekleri tersine çevirin. Örnek 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. 2.5 M glisin 0.5 mL ekleyin. Örnekleri hemen ters çevir ve örnek 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
  6. 1200 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin.
  7. Pelet CIA durulama 1 10 mL resuspend (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, % 10 gliserol, %0,5 Nonidet P-40 [NP40] ve % 0.25 Triton X100). 10 dk santrifüj kapasitesi için o vasıl 1200 x g 4 ° C'de 5 min için örnek buz üzerinde kuluçkaya
  8. Pelet CIA durulama 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 ve 200 mM NaCl) 10 mL resuspend. 1200 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi
  9. Yavaşça 5 mL tuz Pelet aksatmadan yıkamak için arabellek (% 0,1 SDS, 1 mM EDTA ve 10 mM Tris pH 8) konik tüp kenarlarında yamultma CIA de ekleyin. Örnek vasıl 1200 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi Yıkama adımı yineleyin.
  10. Pelet 90 µL CIA kesme arabellek ve taze proteaz inhibitörleri (leupeptin, chymostatin ve pepstatin A karışımı birlikte 10 mg/mL her bir 1.000 x 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon yapma hisse senedi çözüm yapmak DMSO çözünmüş. kullanım) resuspend. Her şey buz13,14tarihinde tutarken sonication arttırıcı nanodroplets 10 µL ekleyin.
  11. Bir cam tüp 100 µL çözümün transfer ve tüp kap.
  12. Örnekleri 3,5 dk için solüsyon içeren temizleyicide (belirlenen hücre satır ve hücre sayısı dayalı). Örnekleri ısınmayı önlemek için toplam sonication saat 2 dk. aşarsa örnekleri 2-min-maksimum çevrim süreleri içinde işlemek.
    Not: Odaklı ultrasonicator burada yüksek frekansta (500 kHz) işlevleri kullanılan. 55 W. akustik bir gücü makine çalıştırmak Sonication süresi her bireysel lab tarafından önceden belirlenmiş.
  13. Her sonicated kromatin örnek için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Tüpler 8.000 x g 4 ° C'de 2 min için de spin
  14. Kesme verimliliği çözümlemek ve kromatin göreli miktarını ölçmek için çip seti üreticisinin Protokolü izleyin.
    Not: spectrophotometrically DNA konsantrasyonu belirlemek (DNA nanodrop enstrüman kullanarakÖrneğin,), ve koşmak ~ 200 kromatin boyutu kabaca basepairs (bp) 200-500 için sonicated doğrulamak için % 1'özel jel üzerinde DNA'ın ng.
  15. İmmunoprecipitation gerçekleştirmek ve kromatin yalıtmak için çip seti üreticisinin Protokolü izleyin.
    Not: İmmunoprecipitation daha yüksek DNA konsantrasyonları ile örnekleri için 37 ° C'de elüsyon arabellek sıcak ve örnekleri 2 elute x 30 µL elüsyon arabelleği (dönmesi 1 dk. için her zaman) ile.
  16. QPCR gerçekleştirmek için bir 384-şey plaka reaktifleri yükleyin. Eklemek 2 x asimetrik siyanür boya ana karışımı 5 µL, her biri 2.5 µM astar, su ve 0.1 - 10 her reaksiyon için DNA'ın ng.
    1. 50-100 bp amplicons ve CT değerlerini yükseltmek için tasarım astar bir ev tutma gen intracisternal A tipi parçacıklar (IAP) normalleştirilmiş.
      Not: daha fazla qPCR için kit üreticinin iletişim kuralı bkz. Oct4 odağı hedef için kullanılan astar kuruldu: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Hedef IAP için kullanılan Ayarla denetim astar oldu: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Astar ve 60 ° C bir tavlama sıcaklığı 40 çevrimleri için 1 dk ile qPCR çalıştırmak istediğiniz ürün dayalı.
      Not: Elde edilen veri örnekleri, IAP üzerinde normalize CiA:Oct4 ile arasındaki delta delta Ct karşılaştırmaları kullanarak quantitated. Son tahlilde sonuçları onaylatılacak deneysel örneklerinin ortalama standart sapma ortalamasını temsil hata ile görüntülenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz son zamanlarda CEMs geliştirdi ve bu teknoloji gen ekspresyonu ve kromatin çevrenin bir muhabir odağı, doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde düzenlemek için uygulanabilir olduğunu gösterdi. Şekil 1' de, CEM, CEM23, manken müşteri adayının gösterilir. HDAC makine muhabir odağı olan, bu durumda, Oct4 odağı eklenen GFP muhabir HDAC inhibitörü tarafından oluşturulmuştur.

CIA mESCs Oct4 locus de CEM sistemi karakterize istedi. Hücreleri GFP ifade çünkü hızlı bir şekilde görselleştirmek muhabir floresans mikroskobu ile ifade mümkündü. Hücreleri tedavi 100 ile 48 saat sonra yansıma CEM23, nM tedavi edilmezse hücreleri ile birlikte. Faz görüntüler sağlıklı mESCs, sağlıksız ya da farklı mESCs bir non-spesifik GFP baskı gösteriyor çünkü önemli olduğu göstermektedir. Floresans görüntüleri kontrol hücreleri bir parlak GFP ifadesinde ve azaltılmış GFP ifade CEM23 ile tedavi mESCs gösterir. Temsil edici resimler Şekil 2' de görüntülenir.

GFP ifade değişiklikleri ölçmek için akış sitometresi kullanıldı. Yine, CIA mESCs 100 ile tedavi edildi CEM23 nM 48 saattir. Deneysel hücreleri CEM23 ve denetim hücrelerle tedavi akış sitometresi, örnek başına > 100.000 hücreleri kullanarak için hazırlanmıştır. Sürekli olarak, GFP ifade hücreler arasında CEMs ile tedavi azalma % > 30 görülmektedir. Temsil edici bir çubuk grafik Şekil 3' te gösterilmiştir.

Bir kez CEM kaynaklı GFP gen ifade azalma kanıtı gösterildi, ChIP kullanarak kromatin ortamındaki değişiklikler için test ettik. Küçük parça için örnek hazırlanması için önemli bir faktör kromatin sonication ölçüde olduğu. Tutarlı ve düzgün yamultulmuş örnekleri için 10 milyon hücre 3,5 dakika kromatin arasında 200 ve 500 bp boyutu (Şekil 4) elde etmek sonicated. Baskıcı CEMs bağlama ve HDAC protein ve baskıcı kompleksleri muhabir için işe alma onaylanmadığına karar çünkü histon kuyruk asetilasyon değişimler için test ettik. Histon 3 lizin 27 asetilasyon (H3K27ac) yaygın transkripsiyon başlangıç sitenin genler (TDH) bulunur. Çip ile bir antikor H3K27ac için gerçekleştirilen ve sonra bir qPCR astar setleri akış yukarı ve aşağı TSS ile gerçekleştirilir. Sonuçları gösteriyor ki bir 48 saat tedavi ile 100 nM CEM23 azalma H3K27ac kontrol hücreleri CEMs ile tedavi değil karşılaştırıldığında hedef odağı, düzeyini (p < 0,01, iki kuyruklu öğrenci t-testi ile üç biyolojik çoğaltır, Şekil 5).

Figure 1
Resim 1 : CEMs bağlamak için CiA:Oct4 FKBP ve urgan endojen epigenetik makine işe alım yoluyla locus. CEM sistemi modeli Gal4-FKBP protein-DNA çapa olarak gösterir. CEM FK506 bölümünü FKBP için bağlar ve HDAC inhibitörü GFP bastırmak için endojen HDAC proteinler acemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 2
Resim 2 : Fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) ile floresan görüntüleri bir CiA:Oct4 - GFP gazeteci. Floresans mikroskobu görüntüler GFP ifade CEM tedavi üzerine bir düşüş göstermektedir. Üst panel faz ve işlenmemiş medyasıyla yetiştirilen mESCs floresan görüntüleri gösterir. Alt paneli faz ve 100 ile tedavi mESCs floresan gösterir CEM23 nM 48 saattir. ACS sentetik biyoloji12izinle uyarlanmış görüntüleri. Telif hakkı (2018) Amerikan Kimya Birliği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 3
Şekil 3 : Akış Sitometresi Analizi mESCs CEM23 tedavi üzerine GFP azalmış bir ifade quantitates. mESCs CEM23 (mavi) olmadan 100 ile tedavi mESCs ile ile karşılaştırıldığında CEM23 nM 48 saat (kırmızı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 4
Şekil 4 : Kromatin sonication üniformalı ve bir smear 200 ve 500 bp. arasında görülebilir ChIP-qPCR gerçekleştirmek için mESCs gelen kromatin sonicated. Her örnek yaklaşık 3.5 dakika için 200 ve 500 bp uzunluğu arasında benzer şekilde sheared Kromatinde örnek oluşturmayı sonicated 10 milyon hücre oluşuyordu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 5
Şekil 5 : CEM23 tedavi H3K27ac CIA locus adlı bir düşüş neden olur. ChIP-qPCR kromatin ortamındaki değişiklikler için test etmek için gerçekleştirildi. 100 ile 48 saatlik tedaviden sonra CEM23 nM, H3K27ac azalma CiA:Oct4 gözlenen (**p < 0,01, iki kuyruklu öğrenci t-testi ile üç biyolojik çoğaltır. Hata çubuklarını temsil standart sapma). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, biz gen ekspresyonu ve kromatin çevre belirli bir gen, bir doz bağımlı şekilde düzenleyen uygulanan son zamanlarda geliştirilen CEM sistem nitelendirdi. Biz dinamikleri dahil belirli endojen kromatin düzenleyici proteinler seçici alımı yoluyla Gen ifadesinin düzenlenmesine çalışmak için bir yöntem sağlar. Bu uygulanabilir son derece modüler bir teknolojidir ne kadar farklı protein - ve kromatin-modifiye araştırmak için düzgün dysregulated, bu işlemler ile nasıl gidiyor çalışma olarak kromatin çevre düzenlenmesi için konser kompleksleri çalışır. gen özgüllük ulaşma parası.

Burada, üç yolu ile yeni teknoloji kromatin yapısı ve gen ifade değişimler görselleştirmek için gösterdi. CEMs ile belirli hedeflenen loci pertürbasyon sonra gerçek zamanlı değişiklikler gen ekspresyonu floresans mikroskobu tarafından çözümlenmesi. Sonra değişiklikleri gen ifade düzeylerinde daha kantitatif tanımlı bitiş noktaları, akış sitometresi ile ölçülen. Son olarak, epigenetik izleri ardından: kromatin değişikliklere çip tarafından incelenmiş; Özellikle, bu durumda da, H3K27ac. Biz HDAC işe ChIP-qPCR ile tek bir odağı konserinde hareket HDACs çeşitliliği nedeniyle did değil sınav. HDAC enzim hànzú nüfusu işe alındı ve bunun bu nedenle, onları çip tarafından test etmek teknik olarak zor olacağını evim gibi. Daha önce yayımlanan bir çalışma, HDAC3 doğrudan işe alım GAL4 Fusion gen ifade ve kromatin değişikliği üzerinde çip12ile benzer aktivite neden göstermiştir. Floresan muhabir modülasyonlu Eğer gen ekspresyonu değişimler de (1) bir RNA ifade analizi ile ters transkriptaz qPCR veya Batı kurutma ile (2) protein ifade veya görüntüleme ve iletken akış sitometresi ile ölçülebilir ikincil floresan antikor.

CIA sistem12gibi CIP tabanlı güncel teknikler ile ilgili olarak bu CEM teknoloji endojen epigenetik modülatörler hedef gen için işe alma avantajı vardır. Hücrenin kendi makine yönlendirme ifade oransal daha fizyolojik ilgili bir araç oluşturur. Exogenously ifade ana enzimler, şapka ve transkripsiyon faktörleri, gibi yan etkileri artan onların ifadeden, özellikle süre aktif gen locus işe ediliyor değil neden olabilir.

Bu makale HDAC inhibitörleri oluşan CEMs ile roman bu sistemin işlevselliğini gösterirken, diğer birkaç inhibitörleri ya da protein işverenler HDAC inhibitörü yerine sentez. Gen harekete geçirmek elde etmek için şapka inhibitörü - veya HDMT inhibitörü tabanlı CEMs sentez. Bastırmak ve daha sonra aynı gen overexpress için baskıcı bir CEM hücrelerle tedavi, normal medya ile yıka ve aktive bir CEM eklemek mümkündür. Bu baskıcı ve aktive kompleksleri aynı genomik bölgesine işe dinamiklerini incelemek temiz bir sistem için izin verecek. Gelecekteki CEMs tasarlarken, çeşitli özellikleri hücre geçirgenliği, inhibitör etki gücü, yapısı ve inhibitör kinetik de dahil olmak üzere dikkate alınması gerekir. FK506 ve işveren yan arasındaki bağlayıcı uzunluğu CEMs geçirgenliği, hem de alınan protein konumunu etkileyecektir. Sadece bağlayıcı uzunluğu farklı iki CEMs karşılaştırırken, CEM kısa bağlayıcı ile daha etkili12yaşındaydım. Bu doğrudan burada test edilmemiştir iken, daha yüksek etkinliği büyük hücre geçirgenliği bir sonucudur. Kimyasal yapıları değişiklik mükellef işlemcimiz aktif hedef bağlar bölümü aksatmadan seçimi de önemlidir. Kudret ve özgüllük de yüksek kudret ve proteinlerin belirli bir sınıf için özgüllük ile inhibitörleri seçerek kabul edildi. İnhibisyon kinetik CEMs etkinliğini etkileyebilir. CEMs inhibitörleri açma-kapama yavaş oranları ile oluşan daha az etkili olma eğilimindedirler.

Bir kısıtlama olarak yeni CEM teknoloji hedef gen locus adlı bir Gal4 bağlama dizi gereksinimdir. CEMs Oct4 CiA locus dışında başka bir bölge için işe almak için herhangi bir mühendislik Gal4 ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS) bilimsel topluluk için kullanılabilir hatları yüzlerce kullanılabilir. Sistem daha modüler yapılacaktır yollarından biri devre dışı bırakılmış bir Cas9 dahil ederek (dCas9) ile kimyasal epigenetik enzim işe alım10,11,15. Bu nükleaz ölü protein CRISPR-Cas9 sistemi hala bir Kılavuzu RNA (gRNA) tasarlanmış genom herhangi bir bölgesine alınacaktır ama DNA kesecek değil. DCas9-FKBP füzyon kullanarak, FKBP bileşen CEMs nerede dCas9 işe, işe büyük ölçüde kolaylık ve esneklik potansiyel hedef genlerin artan. Hastalık ilgili genlerin bir potansiyel terapötik veya geri döndürülebilir ve geçici hastalık mekanizmaları kromatin düzeyinde eğitim kullanılacak bir araç olarak hedeflemek için bu teknolojiyi kullanarak düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Hathaway ve Jin laboratuarlar için onların yararlı tartışmalar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar da Dan Crona ve Ian MacDonald el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür. Bu eser kısmen Grant R01GM118653 üzerinden ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (için N.A.H.); tarafından desteklenen ve R01CA218600 ve R01HD088626 gelen ABD Ulusal hibe R01GM122749 tarafından Enstitüleri sağlık (JJ için). Bu eser de bir katmanı tarafından desteklenen 3 ve bir öğrenci vermek yenilik için UNC Eshelman Enstitüsünden (N.A.H ve A.M.C, sırasıyla). Ek T-32 GM007092 (A.M.C) finansman bu çalışmaları destekledi. Akış Sitometresi veri UNC akış sitometresi çekirdek bir P30 CA016086 Kanser Merkezi çekirdek destek hibe için UNC Lineberger kapsamlı Kanser Merkezi tarafından finanse edilen tesisinde elde edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Biyomühendislik sayı: 139 Kimya Biyoloji bifonksiyonel molekülleri kimyasal indüklenen yakınlık kromatin yönetmelik gen baskı histon deacetylase epigenetik kimyasal epigenetik değiştiriciler CEMs
Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter