Summary
Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.
Abstract
Regulamento de compactação da cromatina é um processo importante que regula a expressão gênica em eucariontes superiores. Embora a compactação da cromatina e regulação da expressão gênica são comumente interrompidos em muitas doenças, tem faltado um locus específico, endógeno e reversível método para estudar e controlar esses mecanismos de ação. Para resolver este problema, desenvolvemos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais gene-regulação. Um componente da molécula bifuncional vincula uma âncora de ADN-proteína assim será recrutado para um locus alelo-específico. O outro componente envolve endógena cromatina-modificando maquinaria celular, recrutamento destas proteínas para um gene de interesse. Estas pequenas moléculas, chamadas químicas epigenéticas modificadores (CEMs), são capazes de controlar a expressão do gene e o ambiente de cromatina de forma dose-dependente e reversível. Aqui, detalhamos uma abordagem CEM e sua aplicação para diminuir a expressão dos genes e acetilação de cauda em um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) localizado no locus de Oct4 em células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Podemos caracterizar o chumbo CEM (CEM23) usando microscopia fluorescente, citometria de fluxo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), seguido de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Enquanto o poder deste sistema é demonstrado no locus a Oct4 , conceitualmente, a tecnologia CEM é modular e pode ser aplicada em outros tipos de células e em outros loci genômicos.
Introduction
Cromatina consiste de DNA enrolado ao redor de proteínas octamer de histona que formam a partícula nucleosome do núcleo. Regulamento de compactação da cromatina é um mecanismo essencial para a adequada DNA expressão, replicação e reparo1,2,3. Uma maneira em que as células controlam o nível de compactação é através da adição ou remoção de várias modificações de cauda de histona borne-translational. Dois tais modificações incluem acetilação de lisina (1), que é mais comumente associada com a ativação do gene, e metilação de lisina (2), que pode ser associada com ativação do gene ou repressão, dependendo do contexto de aminoácido. A adição das marcas de acetilação e metilação é catalisada por histona acetiltransferases (chapéus) e histona metiltransferases (HMTs), respectivamente, Considerando que a remoção da marca é feita por histona deacetilases (HDACs) e demethylases de histona (HDMs ), respectivamente,4,5. Embora a existência destas proteínas tem sido conhecida há décadas, muitos mecanismos de máquinas como cromatina-modificando obras devidamente regular expressão do gene continuam a ser definido. Uma vez que processos regulatórios de cromatina são prejudicado em muitas doenças humanas, novos insights mecanicistas podem levar a futuras aplicações terapêuticas.
O cromatina na vivo ensaio (CiA) é uma técnica recentemente descrita que usa um indutor químico de proximidade (CIP) para controlar a cromatina-modificando o recrutamento de maquinaria para um locus específico6. Esta tecnologia tem sido costumava estudar uma lista em expansão da dinâmica de cromatina, incluindo proteínas histonas-modificando, empresas de reestruturação da cromatina e transcrição fatores6,7,8,9. CIP-baseado da cromatina tethering de proteínas expressas exogenamente também foi estendido passado CiA para modular loci genéticos não modificado pela utilização com uma proteína associada agrupados regularmente intercaladas curta palíndromo repete CRISPR desativada (dCas9) 10 , 11. no sistema da CiA, mESCs foram modificados para expressar um gene repórter GFP no locus de Oct4 , uma área estritamente regulamentado e altamente expressa do genoma mESC. Anteriormente, este sistema tem sido aplicado para descrever o recrutamento dose-dependente e reversível da proteína de heterocromatina exogenamente expressa 1 (HP1), uma enzima que vincula o H3K9me3 e propaga marcas repressivas (por exemplo, H3K9me3) e DNA metilação de6. Para realizar este tipo de estratégia de recrutamento, os mESCs estão infectados com um plasmídeo que expressa uma proteína de ligação FK506 (FKBP) ligada a um Gal4, que é uma âncora de ADN-proteína que se liga a uma matriz de ligação Gal4 montante do repórter GFP. As células são infectadas também com um domínio de ligação-FKBP-rapamicina (FRB) conectado ao HP1. Quando os mESCs são expostos a concentrações baixas nanomolar do PIC, rapamicina, ambos FRB e FKBP, estão reunidos no locus de alvo. Dentro de dias de tratamento de rapamicina, expressão do gene do alvo é reprimido, como evidenciado por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência e acetilação da histona é diminuída, mostrado pelo ChIP e sequenciamento de bissulfito. Enquanto o desenvolvimento e a validação desta abordagem foram significativos avanços no campo da pesquisa de cromatina e regulação, uma desvantagem é a necessária expressão exógena de cromatina-modificando máquinas.
Para tornar a tecnologia baseada no recrutamento de enzimas fisiologicamente relevantes apenas endógenas e fazer um sistema mais modular, projetamos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais, denominadas CEMs (Figura 1)12. Um componente das CEMs inclui FK506 que, semelhante a rapamicina, liga-se firmemente e especificamente para FKBP. Assim, os CEMs ainda serão recrutados para o locus de Oct4 em mESCs da CiA. O outro componente das CEMs é um agrupamento que vincula a maquinaria de cromatina-modificando endógena. Em um estudo piloto, testamos CEMs que contêm inibidores HDAC. Enquanto o conceito de usando um inibidor para recrutar HDACs parece contra-intuitivo, o inibidor, no entanto, é capaz de recrutar atividade HDAC para o gene de interesse. Isso é realizado por (1) redirecionando o HDAC para o locus, liberando a enzima e aumento da densidade das HDACs un-inibidas na área e inibição de HDAC (2) manutenção no locus, mas recrutar complexos repressivos que ligam para as HDACs inibidas, ou (3) uma combinação de ambos. No estudo anterior, mostramos que o CEMs foram capazes de reprimir com sucesso a repórter GFP de forma dose - e tempo-dependente, bem como de uma maneira que era rapidamente reversível (ou seja, dentro de 24 horas)12. Nós caracteriza a capacidade da tecnologia CEM apresentada aqui a expressão de gene de controle usando microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e a capacidade para controlar o ambiente de cromatina usando ChIP-qPCR6. Aqui, descrevemos um método para usar e caracterizando os CEMs, que facilitarão a adaptação deste sistema para responder perguntas adicionais relacionadas à biologia da cromatina.
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Protocol
1) cultura de linha celular para a produção de Lentivirus
- Crescer fresco, passagem baixa (inferior a passagem 30) células de rim humano embrionário (HEK) 293T em alta-glicose Dulbecco modificada do águia é a mídia de base médio (DMEM) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 10 mM HEPES, 1 x não aminoácidos essenciais (timina), caneta / Estreptococo, 2-mercaptoenthanol em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Dividir as células a cada 3-5 d... e antes que se tornem > 95% de Confluencia.
- Células HEK de passagem 293T com 18 x 106 por placa de 15 cm (uma placa de 15 cm para cada vírus produzido).
- Para um formato de 15 cm, aspirar a velha mídia, adicionar 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x, Aspire a PBS e adicionar 3 mL de tripsina 0,05%. Incube as celulas em tripsina durante 8 min a 37 ° C, balançando e batendo no meio da incubação das células.
Nota: O objetivo desta etapa é conseguir as células em uma suspensão de célula única.
- Para um formato de 15 cm, aspirar a velha mídia, adicionar 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x, Aspire a PBS e adicionar 3 mL de tripsina 0,05%. Incube as celulas em tripsina durante 8 min a 37 ° C, balançando e batendo no meio da incubação das células.
- Quando as células tiverem chegado a confluência de 60-80% no dia seguinte, realizar uma transfecção o polyethylenimine (PEI) com 13,5 µ g do plasmídeo psPAX2, 4,5 µ g do plasmídeo pMD2.G, 18 µ g do vetor de Lentivirus compatível com entrega com o gene de interesse (ou seja, , FKBP-Gal4), 108 µ l de PEI e 1,8 mL de mídia do transfection.
- Delicadamente misturar o DNA, PEI e transfecção de mídia em um tubo cônico de 15 mL, incubar a amostra em temperatura ambiente por 15 min e adicioná-lo gota a gota para a placa de 15 cm.
Nota: Por favor, uso apropriado de segurança mede e siga todos os institucional e os procedimentos de segurança de laboratório após este passo, como todos os reagentes irão conter um vírus vivo.
- Delicadamente misturar o DNA, PEI e transfecção de mídia em um tubo cônico de 15 mL, incubar a amostra em temperatura ambiente por 15 min e adicioná-lo gota a gota para a placa de 15 cm.
- Após 16 h de transfecção e incubação numa incubadora 37 ° C com 5% de CO2, aspirar a mídia e adicione delicadamente fresca mídia HEK 293 (pré-aquecido em banho maria a 37 ° C) para as placas de 15 cm. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h após muda a mídia. O vírus está pronto para ser colhido.
2) infecção do Mouse as células estaminais embrionárias (mESC) com Lentivirus
- Crescer passagem baixa (menos de passagem, 35), livre de alimentador adaptado CiA mESCs base midiático DMEM alta-glicose suplementado com 20% ESC-série FBS, 10 mM HEPES, inibidor de leucemia x NEAA, caneta/Strep, mercaptoenthanol-2 e 1: 500 1 fator (LIF) em uma incubadora de 37 ° C com 5% CO2.
Nota: O LIF é obtido a partir do sobrenadante de células produtoras de LIF COS, que são coletados em lote e congelado a-80 ° C.- Desenvolvem-se células em placas que foram pré-incubada para 1-3 h com gelatina de 0,1% em 1X PBS e posteriormente lavadas com PBS 1x. Alimentar as células diariamente e dividi-los a cada 2-3 d, dependendo de sua densidade.
Nota: Morfologicamente, colônias de células-tronco embrionárias (ES) devem ser pequeno, redondo e distintos uns dos outros.
- Desenvolvem-se células em placas que foram pré-incubada para 1-3 h com gelatina de 0,1% em 1X PBS e posteriormente lavadas com PBS 1x. Alimentar as células diariamente e dividi-los a cada 2-3 d, dependendo de sua densidade.
- Passagem mESC em um formato de placa 12 (100.000 células/poço) 1D antes da infecção.
- Conte as células com um hemocytometer. Para as células cultivadas em um formato de 10 cm, aspirar a velha mídia, adicionar 5 mL de 1X PBS, Aspire a PBS e adicione 1 mL de tripsina 0,25%. Incube as celulas em tripsina durante 8 min a 37 ° C, balançando e batendo no meio da incubação das células. O objetivo desta etapa é conseguir as células em uma suspensão de célula única.
- 48 h após mudar a mídia de 293T15-cm viral embalagem células da etapa 1.4, remover e transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugue o sobrenadante a 300 x g por 5 min para detritos de célula de Pelotas.
- Filtre o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 µm.
Nota: Certifique-se de utilizar membranas de surfactante livre de acetato de celulose (SFCA), como alguns outros materiais podem reter vírus e reduzem significativamente a produtividade. - Concentrar o vírus com ultracentrifugação, utilizando uma centrífuga com um rotor de SW32 e girá-lo a 20.000 rpm (~ 72.000 x g) para 2,5 h a 4 ° C.
- Enquanto o vírus concentra-se sob ultracentrifugação, trate os mESCs CiA na placa de 12 com media de ES fresco contendo 5 µ g/mL de polybrene.
- Quando a concentração de vírus tiver terminado, cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento do vírus em 100 µ l de PBS 1x (evitar bolhas em excesso).
- Adicione o vírus e 1X PBS para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vórtice/agitar o tubo a 300 x g (ou na posição mais baixa) para suspender totalmente o vírus. Girar o tubo em uma centrífuga mini mesa para 5-10 s para remover as bolhas.
- Adicione 30 µ l do vírus a cada poço de uma placa de 12. A placa do redemoinho e centrifugar a placa a 1.000 x g por 20 min.
Nota: A quantidade de vírus adicionado pode ser variada dependendo do título viral, que é inversamente relacionado ao tamanho de construção de entrega.- Alternativamente, flash congelar o vírus com nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C. No entanto, congelar o vírus irá diminuir o título viral.
- Coloque a placa de 12 em incubadora a 37 ° C e mudar os meios de comunicação na manhã seguinte (~ 16 h) mais tarde com mídia de ES fresca (conforme descrito no passo 2.1).
- Após 48 h de infecção, selecione para células que integrado o plasmídeo viral adicionando o antibiótico apropriado (ou seja, 1,5 µ g/mL de puromicina, 10 µ g/mL de blasticidin, etc.). Mudar a mídia diariamente e lavar as células com PBS 1x, se a maioria das células são flutuantes/mortos. Manter os meios de seleção sobre as células para 72-96 h em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
3) tratamento e preparação de s de modificadores epigenéticas química (CEM)
- Suspenda o CEM em pó em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração das ações de 1 mM e uma concentração de trabalho de 100 µM.
- Depois que as células foram submetidas a seleção para 72-96 h, dividir os mESCs em um formato de 12-poços com 100.000 células/poço. Incubar as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por 24 h. posteriormente, preparar uma solução de mídia de 100 nM CEM com mídia do ES. Use esta mídia para alimentar a CiA mESC com 1ml/bem. Para servir como um controle, manter um poço de células sem qualquer CEMs adicionados.
- Mude a mídia por aspiração mídias antigas e adicionando 1ml/bem de mídia contendo CEM ou livre de CEM ES preparadas cada 24 h para a duração de um experimento.
4) a análise da expressão por microscopia e citometria de fluxo
- Após 48 horas de tratamento CEM, imagem das células sem tratamento CEM e as células tratadas com 100 nM CEM usando um microscópio de fluorescência. Levar imagens representativas, usando fase ou brightfield registro a morfologia mESC na ampliação de 20 X; as células devem ter se formado colônias redondas, com algumas células diferenciadas. Sob o canal de fluorescência FITC, imagem tanto condições de célula.
- Isole o controle e tratados com CEM células por citometria de fluxo por aspiração a mídia, lavar as células com 1 mL de 1X PBS, aspirando a PBS e adição de 0,25 mL de tripsina 0,25% com EDTA para 8-10 min.
- Confirme que as células não estão mais em grandes aglomerações, olhando no microscópio. Use uma ampliação de 20 X. Se as células não parecem estar em uma suspensão de célula única, pipete delicadamente acima e para baixo com uma pipeta P1000 para trypsinize totalmente as células.
- Saciar a tripsina com 1 mL de mídia fresca e ressuspender as células em alta velocidade com uma pipeta sorológica (ou usando uma pipeta P1000 e ponta) até que as células estão em uma suspensão de célula única.
- Gire para baixo as células em 300 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante. Lavagem com PBS 1x e Recentrifugue as células. Aspire o sobrenadante de PBS.
- Ressuspender as células em 200 mL de tampão de FACS (ácido etilenodiaminotetracético de 1 mM [EDTA], 1X PBS e 0,2% albumina de soro bovino [BSA]).
- O volume total do buffer de FACS será dependente de quantas células estão presentes, mas a concentração deve ser 1.000-3.000 células / µ l. contar o número de células em 3 amostras e média da concentração de células. Adicione mais buffer de FACS, se necessário.
- Execute a citometria de fluxo em > 50.000 células com as células suspensas, mantendo as células no gelo, quando eles não estão sendo analisados. Use um filtro de 530/40 (FITC, AF488, as boas práticas agrícolas, etc.) para gravar as alterações na expressão. Determinar a tensão fluorescente apropriada usando uma amostra de células controle não tratados e definir a tensão de ter o pico fluorescente estar no meio do espectro de intensidade gravada. Execute as amostras a uma velocidade de bainha de cerca de 5.000 células/s.
- Exportar os dados e analisar os arquivos do FCS em um programa de citometria de fluxo (isto é, FlowJo) pelo gating primeiro na dispersão direta vs lado dispersão de células vivas e, em seguida avançar dispersão altura vs área para camisolas. Em seguida, Visualizar os dados de canal GFP em um histograma para determinar a expressão relativa de GFP no alvo e controlar as populações.
5) a análise da cromatina por cromatina imunoprecipitação (ChIP) seguido por qPCR
- Dividir os mESCs em uma placa de 10 cm, com 3 milhões de células e 10 mL de mídia do ES (uma placa de 10 cm para cada experimental ou controlar a doença). No dia seguinte, adicione 10 mL de mídia contendo CEM ou CEM-livre. Após 48 horas de tratamento CEM, Aspire a velha mídia. Lavar e aspirar as células com 5 mL de 1X PBS. Em seguida, dissociar as células com tripsina 0,25% e saciar a tripsina com 10 mL de mídia do ES. Conte e isolar uma amostra de 10 milhões de células por condição.
- Spin para baixo de cada uma das amostras de 10 milhões de células a 300 x g por 5 min.
- Ressuspender em 10 mL de 1X PBS a cada e Recentrifugue as células a 300 x g por 5 min.
- Cada Ressuspender em 10 mL de tampão de correção de CiA (pH 50mm 8, pH de 1 mM EDTA 8, 0.5 mM glicol de etileno-bis [ß-aminoetilo éter]-N, N, N', N'-tetraacetic acid [EGTA] pH 8 e 100 mM de cloreto de sódio [NaCl]). Adicione 1 mL de solução de formaldeído de 11% e inverter imediatamente as amostras de 5 - 10 x. Incube a amostra em temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 0,5 mL de glicina de 2,5 M. Inverter as amostras imediatamente e incubar a amostra no gelo por 5 min.
- Centrifugar a amostra a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de CiA enxágue 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM de NaCl, pH de 1 mM EDTA 8, 10% de glicerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] e 0,25% Triton X100). Incubar a amostra no gelo por 10 min.-centrifugar a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de CiA enxaguar 2 (10 mM tris [hidroximetil] aminometano [Tris] pH 8, pH de 1 mM EDTA 8, 0.5 mM EGTA pH 8 e 200 mM NaCl). Centrifugar a amostra a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C.
- Delicadamente, adicione 5 mL de CiA tosquia tampão (0,1% SDS, EDTA 1 mM e 10 mM Tris pH 8) ao longo dos lados do tubo cónico de lavar qualquer sal sem interromper a pelota. Centrifugar a amostra a 1.200 x g durante 3 min a 4 ° C. Repita a etapa de lavagem.
- Resuspenda o pellet em 90 µ l de tampão corte CiA e inibidores de protease fresco (uso uma mistura de leupeptin, pepstatin A e chymostatin juntos dissolvida em 10mg/mL cada em DMSO tornar um 1.000 x solução-mãe, fazendo uma concentração final de 10 µ g/mL). Adicione 10 µ l de nanodroplets reforço sonication mantendo tudo no gelo13,14.
- Transferir 100 µ l da solução para um tubo de vidro e a tampa do tubo.
- Proceda à sonicação amostras para 3,5 min (determinado com base na linha celular e no número de células). Para evitar o superaquecimento das amostras, processa as amostras em tempos de ciclo 2-min-máximo se o tempo total sonication excede 2 min.
Nota: O ultrasonicator concentrado aqui funções usadas em alta-frequência (500 kHz). Executar a máquina em uma potência acústica de 55 w. A duração do sonication deve ser predeterminada por cada laboratório individual. - Transferi cada amostra de cromatina lisados para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Girar os tubos a 8.000 x g por 2 min a 4 ° C.
- Para analisar a eficiência de corte e de quantificar a quantidade relativa de cromatina, segui o protocolo do fabricante do ChIP.
Nota: Determinar a concentração de DNA espectrofotometricamente (por exemplo, usando um instrumento de nanodrop DNA), e executar ~ 200 ng de DNA em um gel de agarose 1% para verificar que a cromatina é lisada para cerca de 200-500 basepairs (bp) em tamanho. - Para realizar a imunoprecipitação e isolar a cromatina, seguir o protocolo do fabricante do ChIP.
Nota: Para a imunoprecipitação de amostras com concentrações mais elevadas de DNA, aquecer o tampão de eluição, a 37 ° C e eluir as amostras 2 x com 30 µ l de tampão de eluição (fiação para 1 min cada vez). - Para executar o qPCR, carrega os reagentes em uma placa de 384. Adicionar 5 µ l de mistura mestre de tintura de cianina assimétrico de 2x, 2.5 µ m de cada primer, água e 0.1 - 10 ng de DNA para cada reação.
- Projeto primers para amplificar amplicons bp 50-100 e os valores de CT são normalizados para um gene de manutenção da casa, as partículas de um tipo de intracisternal (IAP).
Nota: Para mais qPCR métodos, consulte protocolo do fabricante kit. Conjunto de primer usado para direcionar o locus de Oct4 foi: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. A cartilha de controle conjunto usada para IAP alvo foi: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC. - Baseado nos primers e o produto desejado, execute o qPCR com 40 ciclos de uma temperatura do recozimento de 60 ° C por 1 min.
Nota: Os dados resultantes foi quantificados usando as delta-delta Ct comparações entre as amostras, com CiA:Oct4 normalizado ao longo do IAP. Os resultados da análise final são exibidos como médias de amostras experimentais triplicadas, com o erro representado como o desvio padrão da média.
- Projeto primers para amplificar amplicons bp 50-100 e os valores de CT são normalizados para um gene de manutenção da casa, as partículas de um tipo de intracisternal (IAP).
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Representative Results
Recentemente desenvolvemos CEMs e demonstrou que esta tecnologia pode ser aplicada para regular a expressão dos genes e o ambiente de cromatina em um locus de repórter de forma dose-dependente e reversível. Na Figura 1, é mostrado um modelo de liderança, CEM, CEM23. Máquinas HDAC é recrutada para o locus de repórter por que, neste caso, é o repórter GFP inserido no locus de Oct4 inibidor HDAC.
Procuramos caracterizar o sistema de CEM o locus de Oct4 em mESCs CiA. Porque as células expressam GFP, foi possível visualizar rapidamente a expressão do repórter com microscopia de fluorescência. As células foram fotografadas após 48 horas de tratamento com 100 nM de CEM23, juntamente com células não tratadas. As imagens de fase mostram mESCs saudável, que é importante porque mESCs insalubres ou diferenciadas indicaria uma repressão de GFP não-específica. As imagens de fluorescência mostram uma brilhante expressão de GFP nas células de controle e uma reduzida GFP em mESCs tratados com CEM23. Imagens representativas são exibidas na Figura 2.
Para quantificar as alterações na expressão de GFP, citometria de fluxo foi usada. Novamente, os mESCs CiA foram tratados com 100 nM de CEM23 por 48 horas. Células experimentais tratadas com células CEM23 e controle foram preparadas por citometria de fluxo, usando > 100.000 células por amostra. Consistentemente, observamos um > 30% diminuição de células GFP-expressando entre aqueles tratados com CEMs. Um histograma representativo é mostrado na Figura 3.
Uma vez que foi mostrada a evidência da diminuição de expressão de gene GFP induzida por CEM, testamos para mudanças no ambiente de cromatina usando o ChIP. Um fator importante para a preparação de amostras para o ChIP é a extensão do sonication da cromatina. Para que as amostras como consistente e adequadamente cortado como possível, 10 milhões de células foram lisados por 3,5 minutos para obter a cromatina entre 200 e 500 bp em tamanho (Figura 4). Porque formulamos a hipótese que o CEMs repressivas eram vinculando a e recrutamento HDAC proteínas e complexos repressivos para o repórter, testamos para mudanças na acetilação da histona cauda. Acetilação 3 27 de lisina (H3K27ac) é comumente encontrada junto o site iniciar transcriptional (TSS) de genes. Realizamos o ChIP com um anticorpo para H3K27ac e então executada uma qPCR com primeira demão de moda a montante e a jusante do TSS. Os resultados mostram que um tratamento de 48 horas com 100 nM de CEM23 diminuiu o nível de H3K27ac no locus de alvo quando comparado ao controle células não tratadas com CEMs (p < 0,01, do Student bicaudal t-teste com três biológicos Replica, Figura 5).
Figura 1 : CEMs bind para o CiA:Oct4 locus através de recrutamento para a maquinaria epigenética endógena FKBP e baraço. O modelo do sistema CEM mostra Gal4-FKBP como a ADN-proteína-a âncora. Vincula a parte de FK506 a CEM FKBP e o inibidor HDAC recrutas endógenas proteínas HDAC para reprimir a GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens de fluorescência das células-tronco embrionárias rato (mESCs) com um CiA:Oct4 Repórter - GFP. Imagens de microscopia de fluorescência mostram uma diminuição na expressão de GFP tratamento de CEM. O painel superior mostra a fase e imagens fluorescentes de mESCs crescido com a mídia não tratada. O painel inferior mostra a fase e fluorescentes dos mESCs tratados com 100 nM de CEM23 por 48 horas. As imagens adaptadas com permissão da biologia sintética ACS12. Direitos autorais (2018) sociedade química americana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de citometria de fluxo dosa uma diminuição da expressão de GFP em mESCs tratamento de CEM23. mESCs sem CEM23 (azul) foram comparados com mESCs tratados com 100 nM de CEM23 por 48 horas (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Sonication da cromatina é uniforme, e um esfregaço é visível entre 200 e 500 BP Para executar o ChIP-qPCR, a cromatina de mESCs foi lisada. Cada amostra consistiu de cerca 10 milhões de células, que foram lisados por 3,5 minutos, para produzir amostras de cromatina cortado da mesma forma entre 200 e 500 bp em comprimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : CEM23 tratamento causa uma diminuição em H3K27ac no locus CiA. ChIP-qPCR foi realizada para testar as alterações no ambiente de cromatina. Após um tratamento de 48 horas com 100 nM de CEM23, foi observada uma diminuição em H3K27ac em CiA:Oct4 (* *p < 0,01, do Student bicaudal t-teste com três repetições biológicas. As barras de erro representam o desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos o recentemente desenvolvido sistema CEM sendo aplicado para regular a expressão de gene e ambiente de cromatina em um gene específico de forma dose-dependente. Nós fornecemos um método preciso para estudar a dinâmica envolvida na regulação da expressão gênica através do recrutamento seletivo das proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta é uma tecnologia altamente modular que pode ser aplicada para investigar como diferente proteínas e cromatina-modificação de complexos trabalham em conjunto para regular corretamente o ambiente de cromatina, bem como para estudar como esses processos são a desregulação, com a benefício de alcançar a especificidade do gene.
Aqui, três maneiras foram demonstradas para visualizar as alterações na expressão de gene e estrutura de cromatina com nova tecnologia. Depois da perturbação dos loci alvo específico com CEMs, alterações em tempo real a expressão de gene poderiam ser analisadas por microscopia de fluorescência. Em seguida, alterações nos níveis de expressão de gene poderiam ser medidas quantitativamente mais com citometria de fluxo nas extremidades definidas. Finalmente, as alterações posttranslational marcas epigenéticas na cromatina foram examinadas por ChIP; especificamente, no caso, H3K27ac. Não testámos o recrutamento de HDAC com ChIP-qPCR devido à diversidade das HDACs que atuam em conjunto em um único locus. É provável que uma população heterogênea de enzimas HDAC foi recrutada e, portanto, seria tecnicamente difícil para testá-los todos por ChIP. Em um trabalho publicado anteriormente, temos demonstrado que a contratação direta de HDAC3 por uma fusão de GAL4 causado atividade semelhante na modificação genética de expressão e cromatina por ChIP12. Se um repórter não-fluorescente é ser modulada, alterações na expressão gênica também podem ser medidas por (1) uma análise de expressão de RNA com transcriptase reversa qPCR ou expressão de proteína (2) com mancha ocidental, ou de imagens e realização de citometria de fluxo com anticorpos secundários fluorescentes.
Em relação às técnicas atuais baseados em pic como a CiA sistema12, esta tecnologia CEM tem a vantagem de recrutar endógenos moduladores epigenéticas ao gene alvo. Redirecionando a maquinaria da célula cria um meio mais fisiologicamente relevante de modulação de expressão. Exogenamente expressar mestre enzimas, como chapéus e fatores de transcrição, pode resultar em efeitos colaterais de sua expressão aumentada, especialmente enquanto não ativamente sendo recrutado para o locus do gene.
Enquanto este artigo mostra a funcionalidade deste sistema romance com CEMs compostos de inibidores HDAC, vários outros inibidores ou recrutadores de proteína podem ser sintetizados no lugar do inibidor HDAC. Para conseguir a ativação do gene, inibidor de chapéu - ou CEMs inibidor-baseado de HDMT podem ser sintetizados. Para reprimir e então overexpress o mesmo gene, é possível tratar as células com um CEM repressiva, lave-os com meios de comunicação regulares, e em seguida, adicione uma activação CEM. Isto permitiria um sistema limpo estudar a dinâmica dos complexos repressivos e activação para a mesma região genômica de recrutamento. Ao projetar o futuros CEMs, várias características devem ser considerados, incluindo a permeabilidade celular, potência de inibidor, estrutura e cinética de inibição. O comprimento de vinculador entre FK506 e a fracção de recrutador influenciará a permeabilidade dos CEMs, bem como a posição da proteína recrutada. Ao comparar dois CEMs que diferiam apenas em comprimento do vinculador, a CEM com o vinculador mais curto foi mais eficaz12. Enquanto ele não foi testado diretamente aqui, a maior eficácia é o resultado da maior permeabilidade da célula. Também é importante escolher inibidores com estruturas químicas passíveis de modificação sem interromper a parte que se liga ao sítio ativo do alvo. A potência e a especificidade foram também considerados selecionando inibidores com uma alta potência e a especificidade para uma determinada classe de proteínas. A cinética de inibição pode influenciar a eficácia dos CEMs. CEMs compostas de inibidores com taxas lentas de ligar-desligar tendem a ser menos eficaz.
Uma restrição da tecnologia atual de CEM é a exigência de uma matriz de Gal4-ligação para o locus do gene alvo. Para recrutar CEMs para uma região diferente o locus de Oct4 CiA , qualquer uma das centenas de engenharia Gal4 montante ativação sequência (UAS) linhas disponíveis para a comunidade científica pode ser usado. Uma maneira que o sistema será feito mais modular está incorporando um Cas9 desativado (dCas9) com a enzima epigenéticas química recrutamento10,11,15. Esta proteína de nuclease-mortos do sistema CRISPR-Cas9 ainda será recrutada para qualquer região do genoma, ao qual é projetado um RNA guia (gRNA), mas não cortará o DNA. Usando uma fusão de dCas9-FKBP, o componente FKBP recrutará os CEMs onde o dCas9 é recrutado, aumentando a facilidade e flexibilidade de genes-alvo potencial. Imagine-se usando esta tecnologia para genes relevantes para a doença-alvo como um potencial terapêutico ou um meio pelo qual reversível e temporalmente estudar mecanismos de doença a nível de cromatina.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer aos membros dos laboratórios Hathaway e Jin para suas discussões úteis. Os autores também agradecer Dan Crona e Ian MacDonald por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por Grant R01GM118653 de os E.U. National Institutes of Health (para N.A.H.); e por subsídios R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 de o E.U. National institutos de saúde (JJ). Este trabalho também foi apoiado por um nível 3 e um estudante concedem da UNC Eshelman Instituto de inovação (N.A.H e A.M.C, respectivamente). Financiamento adicional de um GM007092 de T-32 (a A.M.C) com suporte a este trabalho. Obteve-se dados de citometria de fluxo na UNC Flow Cytometry Core instalação financiado por um P30 CA016086 Cancer Center núcleo apoio Grant para o UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
- Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
- Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
- Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
- Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
- Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
- Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
- Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
- Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
- Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).
