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Bioengineering

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Abstract

Regolamento di compattazione della cromatina è un importante processo che regola l'espressione genica negli eucarioti superiori. Anche se la compattazione della cromatina e regolazione dell'espressione genica sono interrotti comunemente in molte malattie, un metodo di luogo-specific, endogeno e reversibile per studiare e controllare questi meccanismi d'azione è stata carente. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato e caratterizzato molecole bifunzionali diregolamenti. Un componente della molecola bifunzionale associa a un ancoraggio della DNA-proteina in modo che che saranno assunti per un locus allele-specifico. L'altro componente si impegna endogeno macchinario cellulare modificante la cromatina, reclutamento di queste proteine ad un gene di interesse. Queste piccole molecole, chiamate modificatori epigenetici chimici (CEMs), sono in grado di controllare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in maniera dose-dipendente e reversibile. Qui, dettagliamo un approccio CEM e la sua applicazione per fare diminuire l'espressione genica e l'acetilazione dell'istone coda presso un reporter della proteina fluorescente verde (GFP) situato al luogo del Oct4 in cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Ci caratterizzano il piombo CEM (CEM23) utilizzo di microscopia fluorescente, citometria a flusso e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), seguita da una reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Mentre il potere di questo sistema è dimostrato a livello del locus Oct4 , concettualmente, la tecnologia CEM è modulare e può essere applicata in altri tipi cellulari e in altri loci genomici.

Introduction

Cromatina è costituito da DNA avvolto intorno alle proteine istoniche istonico che formano la particella nucleosome core. Regolamento di compattazione della cromatina è un meccanismo essenziale per il corretto DNA riparazione, replica e l'espressione1,2,3. Un modo in cui le cellule controllano il livello di compattazione è attraverso l'aggiunta o la rimozione di varie modifiche di coda post-traduzionali degli istoni. Due tali modifiche includono l'acetilazione di lisina (1), che è più comunemente associato con l'attivazione del gene, e (2) lisina metilazione, che può essere associata con l'attivazione del gene o repressione, a seconda del contesto dell'amminoacido. L'aggiunta di segni di acetilazione e metilazione è catalizzata da utilizzando istone acetiltransferasi (Hat) e istone metiltransferasi (HMTs), rispettivamente, mentre la rimozione del marchio avviene istone deacetilasi (HDACs) e istone JmjC (HDMs ), rispettivamente di4,5. Anche se l'esistenza di queste proteine è stato conosciuto per decenni, molti meccanismi di macchinari come modificante la cromatina opere per regolare correttamente l'espressione genica rimangono da definire. Poiché i processi di regolazione della cromatina sono dysregulated in molte malattie umane, nuove comprensioni meccanicistiche potrebbero portare a future applicazioni terapeutiche.

La cromatina in vivo assay (CiA) è una tecnica recentemente descritta che utilizza un induttore chimico di prossimità (CIP) per controllare l'assunzione di macchinari modificante la cromatina a un locus specifico6. Questa tecnologia è stata usata per studiare una lista sempre di dinamica della cromatina, tra cui istone-modificando le proteine, remodelers della cromatina e trascrizione fattori6,7,8,9. CIP-basato della cromatina tethering delle proteine espresse esogenicamente è stato esteso anche passato CiA per modulare loci genetici non modificato da utilizzare con una disattivato cluster regolarmente intervallate breve palindromi ripete CRISPR-collegata della proteina (dCas9) 10 , 11. nel sistema di CiA, mESCs sono stati modificati per esprimere un gene reporter GFP presso il locus Oct4 , una zona altamente espresso e rigorosamente regolamentato del genoma mESC. In precedenza, questo sistema è stato applicato per descrivere il reclutamento dose-dipendente e reversibile della proteina di eterocromatina esogenicamente espresso 1 (HP1), un enzima che lega H3K9me3 e propaga repressivi marchi (ad esempio, H3K9me3) e DNA metilazione6. Per realizzare questo tipo di strategia di reclutamento, la mESCs sono infettati con un plasmide che esprime una proteina di FK506-legante (FKBP) collegata a un Gal4, che è un ancoraggio della DNA-proteina che si lega a una matrice di Gal4-associazione a Monte del reporter GFP. Le cellule inoltre sono infettate con un dominio FKBP-rapamicina-legante (FRB) collegato al HP1. Quando il mESCs sono esposti a concentrazioni nanomolari bassa del CIP, rapamicina, FRB sia FKBP, sono riuniti presso il luogo di destinazione. Nei giorni del trattamento rapamicina, espressione del gene dell'obiettivo è represso, come evidenziato da citometria a flusso e microscopia di fluorescenza e acetilazione dell'istone è diminuita, mostrato da ChIP e del bisolfuro. Mentre lo sviluppo e la convalida di questo approccio sono stati significativi progressi nel campo della ricerca della cromatina e regolamento, uno svantaggio è necessaria espressione esogena di modificante la cromatina macchinari.

Per rendere la tecnologia basata sul reclutamento degli enzimi fisiologicamente rilevanti solo endogeni ed effettuare un sistema più modulare, abbiamo progettato e caratterizzato nuove molecole bifunzionali, definiti CEMs (Figura 1)12. Uno dei componenti del CEMs comprende FK506 che, simile alla rapamicina, lega strettamente e specificamente a FKBP. Così, il CEMs ancora saranno reclutati al locus Oct4 in mESCs La CiA. L'altra componente del CEMs è una molecola che lega endogeno modificante la cromatina macchinari. In uno studio pilota, abbiamo testato CEMs che contengono inibitori HDAC. Mentre il concetto di usare un inibitore di reclutare HDACs sembra contro-intuitivo, l'inibitore è comunque in grado di reclutare attività di HDAC al gene di interesse. Questa operazione viene eseguita (1) reindirizzando le HDAC al locus, rilasciando l'enzima e aumentando la densità di ONU-inibito HDACs nella zona e inibizione di HDAC (2) mantenere a livello del locus, ma complessi repressivi che si legano a HDACs inibito, di reclutamento o (3) una combinazione di entrambi. In uno studio precedente, abbiamo mostrato che il CEMs erano in grado di reprimere con successo il reporter GFP in maniera dose - e tempo-dipendente, così come in un modo che era rapidamente reversibile (cioè, entro 24 ore)12. Abbiamo caratterizzato la capacità della tecnologia CEM presentata qui per controllare l'espressione genica mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e la capacità di controllare l'ambiente di cromatina utilizzando ChIP-qPCR6. Qui, descriviamo un metodo per l'utilizzo e che caratterizzano il CEMs, che faciliterà l'adattamento di questo sistema di rispondere a ulteriori domande legate alla biologia della cromatina.

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Protocol

1) coltura di linea delle cellule per la produzione di Lentivirus

  1. Fresco, crescere basso-passaggio (meno di passaggio 30) cellule embrionali umane del rene (HEK) 293T in alto-glucosio Dulbecco s modified Eagle di base media medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 10 mM HEPES, 1x gli aminoacidi non essenziali (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Dividere le celle ogni 3-5 p e prima che diventino > 95% confluenti.
  2. Passaggio di cellule HEK 293T con 18 x 106 a 15 cm piatto (uno piatto di 15 cm per ogni virus prodotto).
    1. Per un formato di 15 cm, aspirare i vecchi media, aggiungere 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x, aspirare il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina 0.05%. Incubare le cellule in tripsina per 8 min a 37 ° C, a dondolo e toccando le cellule a metà strada attraverso l'incubazione.
      Nota: L'obiettivo di questa fase è quello di ottenere le cellule in sospensione unicellulare.
  3. Quando le cellule hanno raggiunto confluency di 60-80% il giorno seguente, eseguire una trasfezione di polyethylenimine (PEI) con 13,5 µ g di plasmide psPAX2, 4,5 µ g del plasmide pMD2.G, 18 µ g del vettore lentivirale compatibile consegna con il gene di interesse (cioè , FKBP-Gal4), 108 µ l di PEI e 1,8 mL di media di transfezione.
    1. Delicatamente mescolare il DNA, PEI e transfezione media in una provetta conica 15 mL, incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti e aggiungere goccia a goccia la piastra di 15 cm.
      Nota: Si prega di utilizzare adeguate misure di sicurezza e seguire tutto istituzionale e procedure di sicurezza di laboratorio dopo questo passaggio, come tutti i reagenti conterrà un virus vivo.
  4. Dopo 16h di transfezione e incubazione in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO2, aspirare i media e delicatamente aggiungere media HEK 293 fresco (preriscaldato in bagnomaria a 37 ° C) per le piastre di 15 cm. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h dopo il supporto di modifica. Il virus è quindi pronto per essere raccolta.

2) infezione del Mouse cellule staminali embrionali (mESC) con Lentivirus

  1. Basso-passaggio (meno di passaggio 35) di crescere, privo di alimentatore adattato CiA mESCs media base di alto-glucosio DMEM completate con 20% FBS ESC-grado, 10 mM HEPES, inibitore di leucemia di x NEAA, Pen/Strep, 2-mercaptoenthanol e 1: 500 1 fattore (LIF) in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
    Nota: Il LIF è ottenuta dal surnatante delle cellule che producono COS LIF, che sono raccolte in batch e congelato a-80 ° C.
    1. Crescere le cellule in piastre che sono state preincubate per 1-3 h con 0,1% di gelatina in 1X PBS e successivamente lavate con PBS 1X. Nutrire le cellule giornalmente e dividerli ogni 2-3 d, a seconda della loro densità.
      Nota: Morfologicamente, colonie di cellule staminali embrionali (ES) devono essere piccolo, rotondo e distinti gli uni dagli altri.
  2. Passaggio mESC in un formato di 12 pozzetti (100.000 cellule per pozzetto) 1D prima dell'infezione.
    1. Contare le celle con un emocitometro. Per le cellule coltivate in un formato di 10 cm, aspirare i vecchi media, aggiungere 5 mL di PBS 1X, aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina 0,25%. Incubare le cellule in tripsina per 8 min a 37 ° C, a dondolo e toccando le cellule a metà strada attraverso l'incubazione. L'obiettivo di questa fase è quello di ottenere le cellule in sospensione unicellulare.
  3. 48 h dopo aver cambiato i media dal virale 293T15-cm imballaggio cellule dal passaggio 1.4, rimuovere e trasferire il surnatante in una provetta conica da 50 mL.
  4. Centrifugare il supernatante a 300 x g per 5 min a pellet detriti cellulari.
  5. Filtrare il surnatante attraverso una membrana da 0,45 µm.
    Nota: Assicurarsi di utilizzare membrane di acetato di cellulosa privo di tensioattivi (SFCA), come alcuni altri materiali possono mantenere virus e ridurre notevolmente i rendimenti.
  6. Concentrare il virus con ultracentrifugazione, utilizzando una centrifuga con rotore SW32 e girarla a 20.000 giri/min (~ 72.000 x g) per 2,5 ore a 4 ° C.
  7. Mentre il virus si concentra sotto ultracentrifugazione, trattare la mESCs CiA nella piastra 12-pozzetti con fresca media ES contenente 5 µ g/mL di polybrene.
  8. Una volta terminata la concentrazione di virus, attentamente aspirare il supernatante e sospendere il pellet di virus in 100 µ l di PBS 1X (evitare le bolle in eccesso).
  9. Aggiungere il virus e 1x PBS in una provetta da 1,5 mL microfuge. Vortice/agitare la provetta a 300 x g (o l'impostazione più bassa) di sospendere completamente il virus. Rotazione verso il basso il tubo in una centrifuga da mini-tavolo per 5-10 s rimuovere le bolle.
  10. Aggiungere 30 µ l del virus in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Agitare la piastra e poi Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 20 min.
    Nota: La quantità di virus aggiunto può essere variata a seconda del titolo virale, che è inversamente correlato alla dimensione del costrutto di consegna.
    1. In alternativa, flash congelare il virus con azoto liquido e conservare a-80 ° C. Tuttavia, il virus di congelamento si abbassa il titolo virale.
  11. Posizionare la piastra 12-pozzetti indietro nell'incubatore 37 ° C e cambiare i media la mattina seguente (~ 16 h) più tardi con media ES fresco (come descritto al punto 2.1).
  12. Dopo 48 h di infezione, selezionare le celle che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico adatto (cioè, 1,5 µ g/mL di con puromicina, 10 µ g/mL di Dyfed, ecc.). Cambiano i media ogni giorno e lavare le cellule con PBS 1X se una maggioranza delle cellule è galleggianti/morti. Mantenere i supporti di selezione delle celle per 72-96 h in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.

3) trattamento e preparazione di s chimica modificatori epigenetici (CEM)

  1. Sospendere il CEM in polvere in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione stock di 1 mM e una concentrazione di lavoro di 100 µM.
  2. Dopo che le cellule hanno subito la selezione per 72-96 h, dividere il mESCs in un formato di 12-pozzetti con 100.000 cellule per pozzetto. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 24 h. in seguito, preparare una soluzione di media di 100 nM CEM con media ES. Utilizzare questo supporto per nutrire la mESC CiA con 1 mL/bene. Per servire come controllo, tenete bene delle celle senza qualsiasi CEMs aggiunto.
    1. Cambiare il supporto ad aspirazione vecchi media e aggiungendo 1 mL/ben di preparati contenenti CEM rimovibile o privo di CEM ES ogni 24 ore per la durata di un esperimento.

4) analisi dell'espressione di microscopia e citometria a flusso

  1. Dopo 48 ore di trattamento CEM, immagine le cellule senza trattamento di CEM e le cellule trattate con 100 nM CEM utilizzando un microscopio a fluorescenza. Prendere immagini rappresentative utilizzando la fase o il campo chiaro per registrare la morfologia mESC 20 ingrandimenti; le cellule dovrebbero formano colonie rotonde, con poche cellule differenziate. Sotto il canale di fluorescenza di FITC, immagine entrambe le condizioni delle cellule.
  2. Isolare il controllo e le cellule trattate con CEM per citometria a flusso aspirando i media, lavare le cellule con 1 mL di 1X PBS, aspirando il PBS, e aggiungendo 0,25 mL di 0,25% tripsina con EDTA per 8-10 min.
  3. Confermare che le cellule non sono più in grandi ciuffi guardando nel microscopio. Utilizzare un ingrandimento X 20. Se le cellule non sembrano essere in una sospensione unicellulare, pipettare delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per tripsinizzano completamente le cellule.
  4. Placare la tripsina con 1 mL di terreno fresco e risospendere le cellule ad alta velocità con una pipetta sierologica (o utilizzando una pipetta P1000 e punta) fino a quando le cellule sono in sospensione unicellulare.
  5. Rotazione verso il basso le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare il surnatante. Lavate con PBS 1X e Ricentrifugare le cellule. Aspirare il supernatante di PBS.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 200 mL di tampone di FACS (acido etilendiamminotetracetico 1 mM [ed], 1x PBS e 0,2% di sieroalbumina bovina [BSA]).
    1. Il volume totale del buffer FACS sarà dipendono da quante cellule sono presenti, ma la concentrazione deve essere 1.000-3.000 cellule / µ l. contare il numero di cellule in 3 campioni e media la concentrazione delle cellule. Se necessario, aggiungere più buffer di FACS.
  7. Eseguire citometria a flusso su celle > 50.000 con le cellule sospese, mantenere le cellule su ghiaccio quando essi non vengono analizzate. Utilizzare un filtro di 530/40 (FITC, AF488, GFP, ecc.) per registrare i cambiamenti nell'espressione. Determinare la tensione fluorescente appropriata utilizzando un campione di cellule non trattate di controllo e impostare la tensione di avere il picco fluorescente essere nel bel mezzo dello spettro di intensità registrata. Eseguire i campioni ad una velocità di guaina di circa 5.000 cellule/s.
  8. Esportare i dati e analizzare i file di FCS su un programma di citometria a flusso (cioè, FlowJo) di gating prima su forward scatter vs side scatter per cellule vive e poi su Avanti scatter altezza vs zona per camiciole. Quindi, visualizzare i dati del canale GFP su un istogramma per determinare l'espressione relativa di GFP nel mirato e controllare popolazioni.

5) analisi della cromatina di Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) seguita da qPCR

  1. Dividere il mESCs in un piatto di 10 cm con 3 milioni di cellule e 10 mL di media ES (una piastra di 10 cm per ogni sperimentale o controllare la condizione). Il giorno seguente, aggiungere 10 mL di supporti contenenti CEM o privo di CEM. Dopo 48 ore di trattamento CEM, aspirare i vecchi media. Lavare ed aspirare le cellule con 5 mL di 1X PBS. Successivamente, dissociare le cellule con tripsina 0,25% e placare la tripsina con 10 mL di media ES. Contare e isolare un campione di 10 milioni di cellule per condizione.
  2. Rotazione verso il basso tutti gli esempi di cella 10 milioni a 300 x g per 5 min.
  3. Ogni risospendere in 10 mL di 1X PBS e Ricentrifugare le cellule a 300 x g per 5 min.
  4. Ogni risospendere in 10 mL di buffer di CiA Fix (50 mM a pH 8, pH di 1 mM EDTA 8, 0,5 mM glicole etilenico-bis [ß-amminoetil etere]-N, N, N', N'-tetraacetico acido [EGTA] pH 8 e 100mm cloruro di sodio [NaCl]). Aggiungere 1 mL di soluzione di formaldeide 11% e capovolgere immediatamente i campioni 5 x - 10 x. Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 min.
  5. Aggiungere 0,5 mL di glicina di 2,5 M. Invertire i campioni immediatamente e incubare il campione in ghiaccio per 5 min.
  6. Centrifugare il campione a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante.
  7. Risospendere il pellet in 10 mL di CiA risciacquo 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, pH di 1 mM EDTA 8, glicerolo al 10%, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] e lo 0,25% Triton X100). Incubare il campione sul ghiaccio per 10 min e centrifugare a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C.
  8. Risospendere il pellet in 10 mL di CiA risciacquo 2 (10 mM tris [idrossimetilico] amminometano [Tris] a pH 8, pH di 1 mM EDTA 8, 0,5 mM EGTA pH 8 e 200 mM NaCl). Centrifugare il campione a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C.
  9. Aggiungere delicatamente 5 mL di CiA tosatura buffer (0.1% SDS, 1 mM EDTA e Tris 10 mM pH 8) lungo i lati del tubo conico per lavare qualsiasi sale senza interrompere il pellet. Centrifugare il campione a 1.200 x g per 3 min a 4 ° C. Ripetere la fase di lavaggio.
  10. Risospendere il pellet in 90 µ l di tampone tosatura CiA e inibitori della proteasi fresca (uso una miscela di leupeptina, chymostatin e pepstatina A sciolto insieme a 10mg/mL ogni in DMSO per rendere un 1.000 x soluzione madre, rendendo una concentrazione finale di 10 µ g/mL). Aggiungere 10 µ l di sonicazione di miglioramento nanogocce mantenendo tutto il ghiaccio13,14.
  11. Trasferire 100 µ l della soluzione in una provetta di vetro e tappo del tubo.
  12. Sottoporre ad ultrasuoni i campioni per 3,5 min (determinato basato sulla linea cellulare e numero di celle). Per evitare il surriscaldamento dei campioni, è possibile trattare i campioni in tempi di ciclo 2-min-massimo se il tempo di sonicazione totale supera 2 min.
    Nota: L'ultrasonicatore concentrato usato qui funzioni ad alta frequenza (500 kHz). Eseguire la macchina ad una potenza acustica di 55 w. La durata di sonicazione deve essere predeterminata da ogni laboratorio individuale.
  13. Trasferire ciascun campione di cromatina lisati mediante un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Girare i tubi a 8.000 x g per 2 min a 4 ° C.
  14. Per analizzare l'efficienza di taglio e per quantificare la quantità relativa di cromatina, seguire il protocollo del produttore di ChIP kit.
    Nota: Determinare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro (ad es., utilizzando uno strumento di nanodrop DNA), ed eseguire ~ 200 ng di DNA su gel di agarosio 1% per verificare che la cromatina è sonicata per circa 200-500 di basi (bp) in dimensioni.
  15. Per eseguire immunoprecipitazione e isolare la cromatina, seguire il protocollo del produttore di ChIP kit.
    Nota: Per l'immunoprecipitazione di campioni con concentrazioni di DNA, caldo il tampone di eluizione a 37 ° C ed eluire i campioni 2 x con 30 µ l di tampone di eluizione (filatura per 1 min ogni volta).
  16. Per eseguire qPCR, caricare i reagenti in una piastra 384 pozzetti. Aggiungere 5 µ l di mix master della tintura di cianina asimmetrico: 2x, 2,5 µM di ogni primer, acqua e 0,1 - 10 ng di DNA per ogni reazione.
    1. Disegno primer per amplificare 50-100 bp ampliconi e valori CT sono normalizzati a un gene house-keeping, particelle di intracisternal A-tipo (IAP).
      Nota: Per ulteriori metodi di qPCR, Vedi il protocollo del produttore di kit. Il set di primer utilizzati per indirizzare il locus di Oct4 è stato: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Il set utilizzato per destinazione IAP di primer di controllo era: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Basato sugli iniettori e il prodotto desiderato, eseguire la qPCR con 40 cicli di una ricottura temperatura di 60 ° C per 1 min.
      Nota: I dati risultanti è stati quantificati usando i triangolo Ct confronti tra i campioni, con CiA:Oct4 normalizzato sopra IAP. I risultati dell'analisi finale vengono visualizzati come medie dei campioni sperimentali triplice copia, con l'errore rappresentato come la deviazione standard dalla media.

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Representative Results

Abbiamo recentemente sviluppato CEMs ed abbiamo dimostrato che questa tecnologia può essere applicata per regolare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in un locus di reporter in modo dose-dipendente e reversibile. In Figura 1, un modello del piombo CEM, CEM23, si vede. Macchinari HDAC sono reclutato per il locus reporter dall'inibitore HDAC che, in questo caso, è il reporter GFP inserito a livello del locus Oct4 .

Abbiamo cercato di caratterizzare il sistema CEM al luogo del Oct4 in CiA mESCs. Perché le cellule esprimono GFP, era possibile visualizzare rapidamente l'espressione del reporter con microscopia di fluorescenza. Le cellule erano imaged dopo 48 ore di trattamento con 100 nM di CEM23, insieme a cellule non trattate. Le immagini di fase mostrano mESCs sano, che è importante perché insalubri o differenziato mESCs indicherebbe una repressione di GFP non specifici. Le immagini di fluorescenza mostrano una brillante espressione di GFP in cellule di controllo e una ridotta espressione di GFP in mESCs trattati con CEM23. Immagini rappresentative vengono visualizzati nella Figura 2.

Per quantificare i cambiamenti nell'espressione di GFP, citometria a flusso è stata utilizzata. Ancora una volta, la CiA mESCs sono stati trattati con 100 nM di CEM23 per 48 ore. Sperimentale cellule trattate con cellule CEM23 e controllo sono state preparate per citometria a flusso, utilizzando > 100.000 cellule per campione. Coerentemente, abbiamo osservato un > 30% diminuire in cellule che esprimono GFP fra quelli trattati con CEMs. Un rappresentanza istogramma viene mostrato nella Figura 3.

Una volta che è stata mostrata prova di diminuzione di espressione genica indotta da CEM GFP, abbiamo testato per modifiche nell'ambiente di cromatina utilizzando ChIP. Un fattore importante per la preparazione di campioni per il ChIP è l'entità della sonicazione di cromatina. Per i campioni come correttamente tosata come possibile e coerente, 10 milioni di cellule sono stati sonicati per 3,5 minuti per ottenere la cromatina tra 200 e 500 bp in dimensione (Figura 4). Perché abbiamo ipotizzato che il CEMs repressivo erano associazione a e reclutando proteine HDAC e repressivi complessi al reporter, abbiamo testato per modifiche nell'acetilazione dell'istone coda. L'acetilazione dell'istone 3 a lisina 27 (H3K27ac) si trova comunemente lungo il sito iniziale trascrizionale (TSS) dei geni. Abbiamo effettuato ChIP con un anticorpo per H3K27ac e quindi eseguite una qPCR con set di primer a Monte e a valle del TSS. I risultati indicano che un trattamento di 48 ore con 100 nM di CEM23 è diminuito il livello di H3K27ac al luogo di destinazione rispetto alle cellule di controllo non trattate con CEMs (p < 0.01, di due code Student t-test con tre biologico viene replicato, Figura 5).

Figure 1
Figura 1 : CEMs associare alla CiA:Oct4 locus attraverso reclutamento al macchinario epigenetico endogeno FKBP e tether. Il modello del sistema CEM Mostra Gal4-FKBP come l'ancoraggio di proteine a DNA. La porzione di FK506 della CEM si lega al FKBP e l'inibitore HDAC reclute proteine endogene di HDAC per reprimere la GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 2
Figura 2 : Immagini di fluorescenza di cellule staminali embrionali di topo (mESCs) con un CiA:Oct4 Reporter - GFP. Immagini di microscopia di fluorescenza mostrano una diminuzione nell'espressione di GFP previo trattamento di CEM. Il pannello superiore mostra la fase e fluorescente immagini della mESCs cresciuti con i media non trattati. Il pannello inferiore mostra la fase e fluorescenti di mESCs trattati con 100 nM di CEM23 per 48 ore. Le immagini adattate con permesso da biologia sintetica ACS12. Copyright (2018) American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 3
Figura 3 : Analisi di citometria a flusso quantitates una diminuita espressione di GFP in mESCs previo trattamento di CEM23. mESCs senza CEM23 (blu) sono stati confrontati con mESCs trattati con 100 nM di CEM23 per 48 ore (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 4
Figura 4 : Sonicazione di cromatina è uniforme, e una sbavatura è visibile tra 200 e 500 BP. Per eseguire il ChIP-qPCR, la cromatina da mESCs è stata sonicata. Ogni campione ha consistito di circa 10 milioni di cellule, che erano sonicati per 3,5 minuti, produrre i campioni allo stesso modo-ha tosato cromatina tra 200 e 500 bp in lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 5
Figura 5 : CEM23 trattamento provoca una diminuzione della H3K27ac al luogo del CiA. ChIP-qPCR è stato effettuato per verificare le modifiche nell'ambiente della cromatina. Dopo un trattamento di 48 ore con 100 nM di CEM23, è stata osservata una diminuzione di H3K27ac a CiA:Oct4 (* *p < 0.01, di due code Student t-test con tre replicati biologici. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Discussion

Qui, abbiamo descritto il sistema CEM recentemente sviluppato applicato per regolare l'espressione genica e ambiente di cromatina a un gene specifico in modo dose-dipendente. Forniamo un metodo accurato per studiare le dinamiche coinvolte nella regolazione dell'espressione genica attraverso il reclutamento selettivo di proteine regolatrici della cromatina endogeno specifico. Si tratta di una tecnologia altamente modulare che può essere applicata per studiare come le diverse proteine - e cromatina-modificando complessi funzionano di concerto per regolare correttamente l'ambiente di cromatina, nonché per studiare come questi processi sono dysregulated, con il beneficio di raggiungere specificità gene.

Qui, tre modi sono stati dimostrati per visualizzare cambiamenti dell'espressione di gene e struttura della cromatina con nuova tecnologia. Dopo perturbazione di loci specifici mirati con CEMs, tempo reale i cambiamenti di espressione genica potrebbero essere analizzati da microscopia di fluorescenza. Quindi, cambiamenti nei livelli di espressione genica possono essere misurati quantitativamente più con citometria a flusso a endpoint definiti. Infine, le modifiche di posttranslational segni epigenetici sulla cromatina sono state esaminate da ChIP; in particolare, in questo caso, H3K27ac. Non testiamo la assunzione di HDAC con ChIP-qPCR a causa della diversità di HDAC che agiscono in concerto a un singolo locus. È probabile che una popolazione eterogenea di enzimi HDAC fu reclutata e, pertanto, sarebbe tecnicamente difficile di testarli tutti da ChIP. In un lavoro pubblicato in precedenza, abbiamo dimostrato che l'assunzione diretta di HDAC3 da una fusione di GAL4 dovuti a simili attività sulla modificazione genetica espressione e cromatina ChIP12. Se un giornalista non fluorescente è modulabile, cambiamenti nell'espressione genica possono anche essere misurate da (1) un'analisi di espressione di RNA con trascrittasi inversa qPCR o espressione (2) della proteina mediante western blotting, o citometria a flusso di imaging e direzione d'orchestra con fluorescenti anticorpi secondari.

In relazione alle attuali tecniche basate su CIP come il CiA sistema12, questa tecnologia CEM ha il vantaggio di modulatori epigenetici endogeni al gene bersaglio di reclutamento. Reindirizzando i macchinari della cella consente di creare un mezzo più fisiologicamente rilevante della modulazione dell'espressione. Esogenicamente che esprimono gli enzimi master, come cappelli e fattori di trascrizione, potrebbe provocare effetti collaterali da loro espressione aumentata, soprattutto pur non essendo attivamente reclutato per il luogo del gene.

Mentre in questo articolo viene illustrata la funzionalità di questo innovativo sistema con CEMs composto da inibitori HDAC, parecchi altri inibitori o reclutatori di proteina possono essere sintetizzati in sostituzione l'inibitore HDAC. Per ottenere l'attivazione del gene, possono essere sintetizzati cappello inibitore - o HDMT basati su inibitore CEMs. Per reprimere e poi dei overexpress lo stesso gene, è possibile trattare le cellule con un CEM repressivo, lavarli con supporto regolari e quindi aggiungere un CEM d'attivazione. Ciò consentirebbe per un sistema pulito studiare la dinamica dei complessi repressivi e d'attivazione nella stessa regione genomica di reclutamento. Quando si progetta il futuro CEMs, parecchie caratteristiche devono essere considerati, tra cui permeabilità delle cellule, inibitore potenza, struttura e cinetica inibitorio. La lunghezza del linker tra FK506 e la frazione di reclutatore influenzerà la permeabilità del CEMs, così come la posizione della proteina reclutata. Quando si confrontano due CEMs che differivano solo per lunghezza del linker, il CEM con il linker più corto era più efficace12. Mentre non è stato testato direttamente qui, l'efficacia superiore è il risultato di una maggiore permeabilità delle cellule. Inoltre è importante scegliere gli inibitori con strutture chimiche suscettibili di modifica senza interrompere la parte che si lega al sito attivo della destinazione. La potenza e la specificità sono stati considerati anche selezionando inibitori con una potenza elevata ed una specificità per una determinata classe di proteine. La cinetica di inibizione può influenzare l'efficacia del CEMs. CEMs composto da inibitori con lenti accensione tassi tendono ad essere meno efficaci.

Un vincolo della attuale tecnologia CEM è il requisito di una matrice di Gal4-associazione al luogo del gene bersaglio. Per reclutare CEMs a una regione diversa dal locus Oct4 CiA , può essere utilizzato qualsiasi delle centinaia di derivati dal linee di sequenza (UAS) attivazione a Monte Gal4 disponibili alla comunità scientifica. Il sistema dovrà avvenire più modulare è incorporando un Cas9 disattivato (dCas9) con chimica degli enzimi epigenetici reclutamento10,11,15. Questa proteina di nucleasi-morti dal sistema CRISPR-Cas9 ancora sarà reclutata in qualsiasi regione del genoma a cui è stato progettato un RNA di guida (gRNA), ma non taglierà il DNA. Utilizzando una fusione dCas9-FKBP, il componente FKBP assumerà il CEMs dove viene reclutato il dCas9, aumentando notevolmente la facilità e la flessibilità di potenziali geni bersaglio. Immagina di utilizzare questa tecnologia per geni rilevanti per la malattia dell'obiettivo come un potenziale terapeutico o un mezzo per reversibilmente e temporaneamente lo studio dei meccanismi di malattia a livello della cromatina.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Hathaway e Jin per le loro discussioni utili. Gli autori ringraziano anche Dan Crona e Ian MacDonald per loro lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grant R01GM118653 da US National Institutes of Health (a N.A.H.); e di sovvenzioni R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 da l'US National istituti di salute (per J.J.). Questo lavoro è stato supportato anche da un tier 3 e uno studente concedere da UNC Eshelman Istituto per l'innovazione (per N.A.H e A.M.C, rispettivamente). Finanziamenti aggiuntivi da un GM007092 di T-32 (al A.M.C) sostenuto questo lavoro. Dati di citometria a flusso è stati ottenuti presso la UNC flusso Cytometry Core Facility finanziata da una sovvenzione di supporto P30 CA016086 Cancer Center Core a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

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References

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  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

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Bioingegneria problema 139 biologia chimica molecole bifunzionali chimica indotta prossimità regolazione della cromatina repressione genica istone deacetilasi epigenetica chimici modificatori epigenetici CEMs
Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici
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Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

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