Summary
对染色质环境的调节是正确基因表达所需的必要过程。在这里, 我们描述了一种方法来控制基因表达, 通过招募的染色质修改机制, 基因特异和可逆的方式。
Abstract
染色质压实调控是控制高真核生物基因表达的重要过程。虽然染色质压实和基因表达调控在许多疾病中普遍被打乱, 但缺乏一个轨迹特异、内生和可逆的方法来研究和控制这些作用机制。为解决这一问题, 我们开发了新的基因调控双分子的特点。双分子的一个成分结合 DNA 蛋白锚, 使其被招募到一个等位基因特定的轨迹。另一个成分参与内源性细胞染色质修饰机制, 将这些蛋白质招募到感兴趣的基因上。这些小分子, 称为化学后生修饰语 (CEMs), 能够以剂量依赖性和可逆的方式控制基因表达和染色质环境。在这里, 我们详细介绍了一个方法和它的应用, 以减少基因表达和组蛋白尾乙酰化在绿色荧光蛋白 (GFP) 记者位于Oct4的位置在小鼠胚胎干细胞 (mESCs)。我们用荧光显微镜、流式细胞术和染色质免疫沉淀 (芯片) 来描述 CEM23 的铅, 然后定量聚合酶链反应 (qPCR)。虽然这个系统的力量在Oct4轨迹上显示, 在概念上, 杰姆技术是模块化的, 可以应用于其他细胞类型和其他基因组的基因座。
Introduction
染色质由 DNA 包裹在组蛋白 octamer 蛋白组成的核心核粒子。规范染色质压实是正确的 DNA 修复, 复制和表达1,2,3的基本机制。细胞控制压实水平的一种方法是通过添加或移除不同的平移后组蛋白尾修饰。两个这样的修改包括 (1) 赖氨酸乙酰化, 这是最常见的与基因激活, (2) 赖氨酸甲基化, 这可以与基因激活或压迫, 取决于氨基酸上下文。添加乙酰化和甲基的标记由组蛋白乙酰转移酶 (帽子) 和组蛋白甲基转移酶 (HMTs) 分别催化, 而去除标记是由组蛋白乙酰 (HDACs) 和组蛋白 demethylases (HDMs) 分别为4、5。虽然这些蛋白质的存在几十年来已经知道, 许多机制的染色修饰机制如何工作, 以适当调节基因表达仍然有待确定。由于染色质调控过程在许多人类疾病中失调, 新的机械洞察可能会导致未来的治疗应用。
染色质在体内检测 (CiA) 是最近被描述的技术, 使用化学诱导剂接近 (CIP) 控制染色质修改机械招募到特定的轨迹6。该技术已被用来研究一个不断扩大的染色质动力学列表, 包括组蛋白修饰蛋白, 染色质 remodelers, 转录因子6,7,8,9。以 CIP 为基础的外部表达蛋白的染色质结合也被延长过去中情局通过使用与停用的群集定期 Interspaced 短回文重复 (CRISPR) 相关蛋白 (dCas9) 来调节非修饰的遗传基因座10,11. 在中情局系统中, mESCs 被修改为在Oct4轨迹上表达 GFP 报告基因, 这是卓制基因组高度表达和严格调控的区域。以前, 这个系统被应用来描述剂量依赖性和可逆的招募外部表达染色质蛋白 1 (HP1), 一种酶, 结合 H3K9me3 和传播压制标记 (如, H3K9me3) 和 DNA甲基化6。为了完成这种类型的招聘策略, mESCs 感染了一种质粒, 表达 FK506-binding 蛋白 (FKBP) 链接到 Gal4, 这是一个 DNA 蛋白锚绑定到一个 Gal4-binding 阵列上游的 GFP 记者。细胞也感染了 FKBP-雷帕霉素结合域 (FRB) 连接到 HP1。当 mESCs 暴露于低 nanomolar 浓度的 CIP, 雷帕霉素, 无论是 FRB 和 FKBP, 都聚集在一起的目标轨迹。在雷帕霉素治疗几天内, 通过荧光显微镜和流式细胞仪对靶基因的表达进行抑制, 并通过芯片和亚硫酸氢化序列显示组蛋白乙酰化的降低。虽然这种方法的发展和验证在染色质研究和调控领域取得了重大进展, 但其中一个缺点是染色质修饰机械所需的外源表达。
为了使这项技术的基础上只有内生生理相关的酶和制造一个更模块化的系统, 我们设计和特点新的双分子, 称为 CEMs (图 1)12。CEMs 的一个组成部分包括 FK506, 与雷帕霉素相似, 紧密结合, 专门 FKBP。因此, CEMs 仍将被招募到中央情报局 mESCs 的Oct4轨迹。CEMs 的其他成分是一种结合内源染色质修饰机械的基团。在一项试验性研究中, 我们测试了含有 HDAC 抑制剂的 CEMs。虽然使用抑制剂来招募 HDACs 的概念似乎是反直觉的, 但抑制剂仍然能够招募 HDAC 活动的基因感兴趣。这是通过 (1) 重定向 HDAC 到轨迹, 释放酶, 并增加不受抑制的 HDACs 在该地区的密度和 (2) 保持 HDAC 抑制在这个轨迹, 但招募压制性复合物, 约束 HDACs,或 (3) 两者的结合。在先前的一项研究中, 我们表明 CEMs 能够以剂量和时间依赖性的方式成功地压制 GFP 的记者, 并且以一种快速可逆的方式 (即在24小时内)12。我们以 qPCR6的荧光显微镜、流式细胞术和控制染色质环境的能力为特点, 提出了利用该技术控制基因表达的能力。在这里, 我们描述了一种使用和表征 CEMs 的方法, 这将促进该系统的适应性, 以回答与染色质生物学有关的其他问题。
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Protocol
1) 细胞线培养生产慢病毒北疆
- 生长新鲜, 低通道 (少于 30) 293T 人胚肾 (HEK) 细胞在高葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 基质中补充10% 胎牛血清 (血清), 10 毫米 HEPES, 1x 非必需氨基酸 (NEAA), 钢笔/链球菌, 2-mercaptoenthanol 在37°c 孵化器与 5% CO2。分裂细胞每 3-5 d 和之前, 他们成为 > 95% 汇合。
- 通过 293T HEK 细胞与 18 x 106每 15 cm 板材 (一个 15 cm 板材为每种病毒生产)。
- 对于15厘米的格式, 吸入旧媒体, 添加10毫升的1x 磷酸盐缓冲生理盐水 (pbs), 吸入 PBS, 并添加3毫升0.05% 胰蛋白酶。将胰蛋白酶中的细胞孵育为8分钟, 在37摄氏度时, 在孵化的中途摇晃并拍打细胞。
注意: 这个步骤的目的是让细胞进入单细胞悬浮。
- 对于15厘米的格式, 吸入旧媒体, 添加10毫升的1x 磷酸盐缓冲生理盐水 (pbs), 吸入 PBS, 并添加3毫升0.05% 胰蛋白酶。将胰蛋白酶中的细胞孵育为8分钟, 在37摄氏度时, 在孵化的中途摇晃并拍打细胞。
- 当细胞在第二天达到 60%-80% 融合时, 执行聚乙烯亚胺 (裴) 转染13.5 µg 的 psPAX2 质粒, 4.5 µg 的 pMD2. G 质粒, 18 µg 的慢病毒载体兼容传递载体与感兴趣的基因 (即, FKBP-Gal4), 108 µL, 和1.8 毫升的转染介质。
- 将 DNA、裴和转染介质轻轻地混合在一个15毫升锥形管中, 在室温下孵化15分钟的样品, 并将其滴入15厘米的板中。
注: 在这一步骤之后, 请使用适当的安全措施并遵循所有的机构和实验室安全程序, 因为所有试剂都将含有活病毒。
- 将 DNA、裴和转染介质轻轻地混合在一个15毫升锥形管中, 在室温下孵化15分钟的样品, 并将其滴入15厘米的板中。
- 经过16小时的转染和孵化37°c 孵化器与 5% CO2, 吸入介质, 并轻轻地添加新鲜 293 HEK 媒体 (prewarmed 在37°c 水浴) 到15厘米板。在37°c 孵化器孵化细胞与 5% CO2为 48 h 在媒介变动以后。病毒就可以被收割了。
2) 慢病毒北疆对小鼠胚胎干细胞 (卓制) 的感染
- 生长低通道 (少于通道 35), 无馈线适应 CiA mESCs 在高葡萄糖 DMEM 基地媒介补充与 20% ESC 级血清, 10 毫米 HEPES, 1x NEAA, 笔/链球菌, 2-mercaptoenthanol 和1:500 白血病抑制剂因素 (LIF) 在37°c 孵化器与5%CO2。
注: lif 是从产自生细胞的上清液中获得的, 它们是分批收集的, 在-80 摄氏度时被冷冻。- 在 1x pbs 中, 用0.1% 明胶 preincubated 1-3 小时的平板上生长细胞, 随后用 1x pbs 冲洗。每天给细胞喂食, 每 2-3 维, 根据它们的密度来分割。
注意: 从形态学上来说, 胚胎干细胞的菌落应该是小的、圆的、不同的。
- 在 1x pbs 中, 用0.1% 明胶 preincubated 1-3 小时的平板上生长细胞, 随后用 1x pbs 冲洗。每天给细胞喂食, 每 2-3 维, 根据它们的密度来分割。
- 在感染前, 通道卓制成12井板格式 (10万细胞/井) 1 d。
- 用 hemocytometer 计数单元格。对于以10厘米格式生长的细胞, 吸入旧介质, 加入5毫升 1x pbs, 吸入 pbs, 并添加1毫升0.25% 胰蛋白酶。将胰蛋白酶中的细胞孵育为8分钟, 在37摄氏度时, 在孵化的中途摇晃并拍打细胞。这个步骤的目的是让细胞进入单细胞悬浮。
- 48 h 在从步骤1.4 中改变293T15 病毒包装细胞的介质后, 将上清液移除并转移到50毫升锥形管上。
- 离心机在 300 x g的上清液为5分钟, 颗粒细胞碎片。
- 通过0.45 µm 膜过滤上清液。
注: 请确保使用无表面活性剂的醋酸纤维素 (SFCA) 膜, 因为其他一些材料可以保留病毒并显著降低产量。 - 将病毒集中在离心, 使用离心机与 SW32 转子, 并旋转它在 2万 rpm (~ 7.2万 x g) 2.5 小时4°c。
- 当病毒集中在离心, 治疗 CiA mESCs 在12井板与新鲜 ES 媒介包含5µg 或毫升凝聚胺。
- 当病毒浓度完成后, 小心地吸入上清, 并在100µL 的 1x PBS 中暂停病毒颗粒 (避免过量气泡)。
- 将病毒和 1x PBS 添加到1.5 毫升离心管中。涡流/摇动管在 300 x g (或最低设置), 以完全暂停病毒。在 5-十年代的迷你台式离心机上旋转管子以除去气泡。
- 将30µL 的病毒添加到12井板的每一个井中。旋转板, 然后离心板在 1000 x g 20 分钟。
注: 添加的病毒数量可以根据病毒滴度而变化, 这与交付构造大小呈反比关系。- 或者, 闪光冷冻的病毒与液氮和存储在-80 摄氏度。然而, 冷冻病毒会降低病毒滴度。
- 将12井板放回37°c 孵化器, 第二天早上 (16 小时后) 用新鲜 ES 介质 (如步骤2.1 所述) 改变介质。
- 在感染48小时后, 通过添加适当的抗生素 (即1.5 µg 嘌呤霉素、10µg/毫升 blasticidin等), 选择集成病毒质粒的细胞。如果大多数细胞漂浮/死亡, 每天更换介质, 用 1x PBS 冲洗细胞。将所选介质保留在 72-96 小时的单元格中, 37 摄氏度孵化器与 5% CO2。
3) 化学表观修饰剂 (杰姆) 的制备与治疗
- 将粉状的杰姆悬浮到二甲基亚砜 (亚砜), 以1毫米的浓度和工作浓度为100µM。
- 在细胞经历了 72-96 小时的选择后, 将 mESCs 分成10万个细胞的12井格式。孵化细胞在一个37摄氏度孵化器与 5% CO2为24小时之后, 准备一个媒体解决方案的 100 nM 与 ES 媒体。使用这个媒体来养活中情局卓制与1毫升/好。作为一个控制, 保持一个良好的细胞没有任何添加 CEMs。
- 在实验期间, 通过吸旧介质, 并在试验期间每24小时添加1毫升/好的新制备的包含或无杰姆的 ES 介质, 以改变介质。
4) 显微和流式细胞术的表达分析
- 经过48小时的杰姆治疗, 图像的细胞没有杰姆治疗和细胞处理的 100 nM 杰姆使用荧光显微镜。采用相或 brightfield 的典型图像, 以20X 放大率记录卓制形态;细胞应该形成圆的殖民地, 有几个分化的细胞。在 FITC 荧光通道下, 图像两种细胞条件。
- 通过吸滤培养基, 用1毫升的 1x pbs 洗涤细胞, 吸出 pbs, 并在 8-10 分钟内加入0.25 毫升0.25% 胰蛋白酶, 将该控制和待处理的细胞用于流式细胞术。
- 通过显微镜观察, 确认细胞不再大团簇。使用20X 放大倍数。如果细胞似乎没有在单细胞悬浮液中, 轻轻地用 P1000 吸管向上和向下吸管完全胰蛋白酶处理细胞。
- 用1毫升的新鲜培养基将胰蛋白酶淬火, 用血清吸管 (或使用 P1000 吸管和尖端) 高速并用重悬细胞, 直到细胞处于单细胞悬浮。
- 向下旋转 300 x g的细胞, 5 分钟吸入上清。用 1x PBS 清洗并 recentrifuge 细胞。吸入 PBS 上清。
- 并用重悬200毫升 (1 毫米乙二胺四乙酸 (EDTA), 1x PBS, 0.2% 牛血清白蛋白 [BSA]) 的细胞颗粒。
- 该流量的总容量将取决于有多少细胞存在, 但浓度应该是 1000-3000 细胞/µL. 计算3个样本中的细胞数和平均细胞浓度。如果需要, 添加更多的外地资产管制缓冲区。
- 用悬浮细胞对 > 5万细胞进行流式细胞术, 在没有分析的情况下保持细胞在冰上。使用530/40 过滤器 (FITC、AF488、GFP等) 记录表达式的变化。使用未经处理的控制单元样本确定适当的荧光电压, 并设置电压使荧光峰处于记录强度谱的中间。以大约5000个细胞/秒的鞘速度运行样品。
- 导出数据并分析流式细胞术 (即FlowJo) 中的 FCS 文件, 方法是先对活细胞进行前向散射和侧向散射, 然后再在正向散射高度与汗衫的区域进行对比。然后, 在直方图上可视化 gfp 通道数据, 以确定目标和控制种群中的相对 gfp 表达式。
5) 染色质免疫沉淀 (片) 后 qPCR 的染色质分析
- 将 mESCs 分成10厘米板, 300万个细胞和10毫升 ES 介质 (每个实验或控制条件下的一个10厘米板)。第二天, 添加10毫升的含杰姆或无杰姆的媒体。经过48小时的杰姆治疗, 吸取了旧媒体。用5毫升的 1x PBS 冲洗和吸入细胞。接下来, 将细胞与0.25% 胰蛋白酶分离, 用10毫升 ES 培养基将胰蛋白酶熄灭。计算和隔离每个条件下1000万个单元格的样本。
- 在 300 x g处向下旋转1000万个细胞样本5分钟。
- 并用重悬每个颗粒在10毫升 1x PBS 和 recentrifuge 细胞在 300 x g 5 分钟。
- 并用重悬每粒10毫升中情局固定缓冲器 (50 毫米 pH 8, 1 毫米 EDTA pH 值 8, 0.5 毫米乙二醇-双 [ß氨基乙基醚]-n, n, n '-四乙酸四酸 [EGTA] pH 8, 和100毫米氯化钠 [NaCl])。添加1毫升11% 甲醛溶液, 并立即反转样品 5x-10x。在室温下孵化样品10分钟。
- 加入0.5 毫升的2.5 米甘氨酸。立即反转样品, 在冰上孵化样品5分钟。
- 离心样品在 1200 x g 5 分钟在4°c。吸入上清液。
- 并用重悬10毫升的中情局冲洗 1 (50 毫米 HEPES pH 8, 140 毫米氯化钠, 1 毫米 EDTA ph 值 8, 10% 甘油, 0.5% Nonidet P-40 [NP40] 和0.25% 海卫四 X100)。将样品在冰上孵化10分钟, 离心机在 1200 x g处为5分钟, 4 摄氏度。
- 并用重悬10毫升的中情局冲洗 2 (10 毫米三 [羟甲基] 氨基甲烷 [三] ph 8, 1 毫米 EDTA pH 值 8, 0.5 毫米 EGTA ph 8, 和200毫米氯化钠)。离心样品在 1200 x g 5 分钟在4°c。
- 轻轻地添加5毫升的 CiA 剪切缓冲 (0.1% SDS, 1 毫米 EDTA, 10 毫米三 pH 8) 沿圆锥管两侧冲洗任何盐, 不破坏颗粒。离心样品在 1200 x g 3 分钟在4°c。重复洗涤步骤。
- 并用重悬在90µL 的中情局剪切缓冲和新鲜蛋白酶抑制剂 (使用混合的 leupeptin, chymostatin 和 pepstatin 一起溶解在10毫克/毫升每亚砜, 使1,000x 库存解决方案, 使最终浓度10µg/毫升)。添加10µL 的超声波增强 nanodroplets, 同时保持一切在冰13,14。
- 将溶液的100µL 转移到玻璃管上并盖上管。
- 油脂实验样品3.5 分钟 (根据细胞线和细胞数确定)。为避免样品过热, 如果总超声波时间超过2分钟, 则在2分钟最大循环时间内处理样品。
注意: 这里使用的聚焦 ultrasonicator 在高频 (500 赫) 中起作用。以 55 W 的声学功率运行该机器。超声波的持续时间应由每个实验室预先确定。 - 将每个微气泡染色质样品转移到一个新的1.5 毫升离心管。旋转管在 8000 x g 2 分钟在4摄氏度。
- 为了分析剪切效率并量化染色质的相对数量, 请遵循芯片套件制造商的协议。
注: 确定 dna 浓度 spectrophotometrically (例如, 使用 dna nanodrop 仪器), 并在1% 琼脂糖凝胶上运行 200 ng dna, 以验证染色质是否微气泡到大约 200-500 basepairs (bp) 的大小。 - 要执行免疫沉淀并隔离染色质, 请按照芯片套件制造商的协议进行操作。
注: 对于 DNA 浓度较高的样品, 免疫沉淀37摄氏度的洗脱缓冲器, 洗脱 2x, 30 µL 洗脱缓冲器 (每次旋转1分钟)。 - 要执行 qPCR, 将试剂装入384井板中。添加5µL 的2x 不对称的菁染料大师混合, 2.5 µM 的每一个底漆, 水, 0.1-10 ng 的 DNA 为每一个反应。
- 设计引物放大 50-100 bp amplicons, CT 值被规范化为一家饲养基因, intracisternal a 型粒子 ()。
注: 有关进一步的 qPCR 方法, 请参阅套件制造商的协议。用于靶向Oct4轨迹的底漆集为: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT;(R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC。用于靶向的控制底漆集为: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA;(R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC。 - 根据引物和所需产品, 运行 qPCR 40 循环的退火温度为60°c 为1分钟。
注: 所得到的数据是量化使用三角洲三角洲 Ct 比较样本之间, 与CiA:Oct4正常化。最后的分析结果显示为三个实验样品的平均值, 其误差表示为标准偏离平均值。
- 设计引物放大 50-100 bp amplicons, CT 值被规范化为一家饲养基因, intracisternal a 型粒子 ()。
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Representative Results
我们最近开发了 CEMs, 并证明该技术可以应用于调节基因表达和染色质环境在一个记者的轨迹, 以剂量依赖性和可逆的方式。在图 1中, 显示了 CEM23 的一个模型。HDAC 机械是由 HDAC 抑制剂招募到记者的轨迹, 在这种情况下, 是 GFP 记者插入到Oct4的轨迹。
我们试图在 CiA mESCs 的Oct4轨迹上描述杰姆系统。由于细胞表达 GFP, 它是可能的快速可视化的表达的记者与荧光显微镜。细胞在48小时的治疗后被成像, 100 纳米的 CEM23, 连同未经处理的细胞。相图显示健康的 mESCs, 这是很重要的, 因为不健康或分化 mESCs 将表明非特定的 GFP 镇压。荧光图像显示了明亮的 gfp 在控制细胞中的表达, 并减少了 gfp 在 CEM23 治疗 mESCs 的表达。图 2显示了代表性图像。
为了量化 GFP 表达的变化, 采用流式细胞术。再次, 中情局 mESCs 100 纳米 CEM23 治疗48小时。用 CEM23 和控制细胞处理的实验细胞用于流式细胞术, 每个样品使用 > 10万细胞。我们一致观察到, CEMs 治疗的荧光蛋白表达细胞的 > 减少了30%。图 3显示了一个有代表性的直方图。
一旦证实了对 GFP 基因表达减少的证据, 我们就用芯片检测染色质环境的变化。制备切片样品的一个重要因素是染色质超声波的程度。为了使样品尽可能一致和适当地剪切, 1000万个细胞被微气泡3.5 分钟, 以获得200和 500 bp 之间的染色质大小 (图 4)。因为我们假设压制 CEMs 对记者有约束力, 并招募 HDAC 蛋白和压制性复合体, 我们测试了组蛋白尾乙酰化的变化。组蛋白3赖氨酸27乙酰化 (H3K27ac) 通常被发现沿转录起始点 (TSS) 的基因。我们用抗体对 H3K27ac 进行了切片, 然后在 TSS 的上游和下游进行了 qPCR。结果表明, 48 小时的治疗与 100 nM 的 CEM23 降低了 H3K27ac 的水平, 当对照细胞没有治疗 CEMs (p < 0.01, 双尾学生的t测试与三生物复制, 图 5)。
图 1: CEMs 绑定到CiA:Oct4通过招聘 FKBP 和系内源性表观机械.该系统的模型显示 Gal4-FKBP 为蛋白质到 DNA 锚点。FK506 部分结合 FKBP 和 HDAC 抑制剂新兵内源 HDAC 蛋白抑制 GFP。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠胚胎干细胞 (mESCs) 的荧光图像CiA:Oct4-GFP 记者.荧光显微图像显示, 在杰姆治疗时, GFP 的表达减少。顶部面板显示了 mESCs 与未经处理的介质一起生长的相位和荧光图像。底部的面板显示的阶段和荧光的 mESCs 处理100纳米 CEM23 48 小时。符合 ACS 合成生物学12的许可的图像。版权所有 (2018) 美国化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 流式细胞术分析 quantitates 荧光蛋白在 mESCs CEM23 治疗后的表达减少。mESCs 不 CEM23 (蓝) 与 mESCs 治疗100毫微米 CEM23 48 小时 (红色) 进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 染色质的超声波是均匀的, 涂片在200和 500 bp 之间是可见的.为了执行芯片 qPCR, mESCs 的染色质是微气泡的。每个样品包括大约1000万个细胞, 是微气泡3.5 分钟, 生产相似地被剪的染色质样品在200和500之间 bp 在长度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: CEM23 治疗导致中情局所在地 H3K27ac 减少.qPCR 是为了测试染色质环境的变化而进行的。经过48小时的治疗与 100 nM 的 CEM23, H3K27ac 的下降观察在CiA:Oct4 (**p < 0.01, 两尾学生的t检验与三生物复制。误差线表示标准偏差)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了最近开发的杰姆系统是用来调节基因表达和染色质环境在特定的基因, 以剂量依赖性的方式。我们提供了一个准确的方法来研究调控基因表达的动态, 通过选择性地招募特定的内源性染色质调节蛋白。这是一种高度模块化的技术, 可用于研究不同的蛋白质和染色质修饰配合物在如何有效地调节染色质环境, 以及研究这些过程是如何失调的, 与实现基因特异性的好处。
在这里, 三种方法被证明, 以可视化的变化的染色质结构和基因表达与新技术。在 CEMs 特定靶点的摄动后, 用荧光显微镜对基因表达的实时变化进行分析。然后, 在定义的终点流式细胞术可以更定量地测量基因表达水平的变化。最后, 用芯片对染色质上翻译后表观的变化进行了研究;具体地说, 在这种情况下, H3K27ac。我们没有测试 HDAC 招聘与芯片 qPCR, 因为 HDACs 的多样性, 在一个单一的轨迹演出。有可能是 HDAC 酶的异构种群被招募, 因此, 它将在技术上很难通过芯片来测试它们。在以前发表的著作中, 我们已经证明, 通过 GAL4 融合直接招募 HDAC3, 导致了基因表达和染色质修饰的类似活动, 芯片12。如果非荧光记者被调制, 基因表达的变化也可以通过 (1) RNA 表达分析与逆转录酶 qPCR 或 (2) 蛋白表达与西方印迹, 或成像和传导流式细胞术荧光二次抗体。
对于目前的基于 CIP 技术的中情局系统12, 这种杰姆技术有优势, 招募内源性的后生调制器的目标基因。重定向细胞自身的机械会产生一种更具生理学意义的调制表达方式。外部表达的主要酶, 如帽子和转录因子, 可能会导致副作用, 从他们增加的表达, 特别是当没有积极招募到基因的轨迹。
虽然本文显示了这个新系统的功能, 由 HDAC 抑制剂组成的 CEMs, 其他一些抑制剂或蛋白质的招聘者可以合成代替 HDAC 抑制剂。为了实现基因活化, 可以合成帽子抑制剂或 HDMT 抑制剂 CEMs。为了压制和过度表达 tshr 同一基因, 有可能用压制性的杰姆治疗细胞, 用常规的培养基冲洗, 然后添加激活的杰姆。这将允许一个干净的系统来研究在同一基因组区域招募压制和活化复合物的动态。在设计未来 CEMs 时, 需要考虑几个特性, 包括细胞渗透性、抑制剂效力、结构和抑制动力学。FK506 与招聘方之间的连接器长度将影响 CEMs 的渗透性, 以及所吸收蛋白质的位置。当比较两个仅在链接器长度上不同的 CEMs 时, 使用较短链接器的杰姆更有效12。虽然它没有直接在这里进行测试, 但更高的有效性是由于细胞通透性的提高。选择具有化学结构的抑制剂, 而不破坏目标活动场地的部分, 也很重要。通过选择具有较高效力和特异性的抑制剂, 对给定的一类蛋白质进行了研究。抑制动力学可能影响 CEMs 的有效性。CEMs 由缓断率的抑制剂组成, 往往效果较差。
目前的杰姆技术的一个约束是 Gal4-binding 阵列在目标基因轨迹上的要求。要招募 CEMs 到Oct4 中情局所在地以外的地区, 可以使用数以百计的工程 Gal4 上游活化序列 (无人接入) 线路。系统将被使更加模块化的一种方式是通过加入一个被停用的 Cas9 (dCas9) 与化学后生酵素招募10,11,15。这种核酸酶死蛋白的 CRISPR-Cas9 系统仍将被招募到任何区域的基因组, 其中指南 RNA (gRNA) 是设计, 但它不会削减 DNA。利用 dCas9-FKBP 融合, FKBP 组件将招募 dCas9 的 CEMs, 大大提高了潜在目标基因的易用性和灵活性。想象一下, 利用这项技术将疾病相关基因作为一种潜在的治疗方法或一种手段, 用于可逆和世俗地研究染色质水平的疾病机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢哈撒韦和金实验室的成员们的有益讨论。作者还感谢丹 Crona 和伊恩. 麦克唐纳对手稿的批判性阅读。这项工作部分是由美国国立卫生研究院授予 R01GM118653 (N.A.H.) 支持的;还有来自美国国立卫生研究院 (R01GM122749)、R01CA218600 和 R01HD088626 的赠款。这项工作还得到了3级的支持, 还有来自 Eshelman 创新研究所 (分别为 H 和上午 C) 的学生补助金。T-32 GM007092 (上午 C) 提供的额外资金支持这项工作。流式细胞术数据是在 unc 流式细胞术核心设施中获得的, 由 P30 CA016086 癌症中心核心支助赠款向 unc Lineberger 综合癌症中心提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha - producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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