染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。
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本文内容
摘要
摘要
染色质压缩的调控是高等真核生物中控制基因表达的重要过程。尽管在许多疾病中，染色质压缩和基因表达调控常常受到破坏，但长期以来缺乏一种位点特异性、内源性且可逆的方法来研究和控制这些作用机制。为解决这一问题，我们开发并表征了一类新型的双功能基因调控分子。该双功能分子的一个组分可结合于DNA-蛋白质锚定结构，从而被招募至等位基因特异性位点；另一个组分则可招募内源性细胞染色质修饰机器，将这些蛋白引导至目标基因。这类小分子被称为化学表观遗传修饰剂（CEMs），能够以剂量依赖性和可逆的方式调控基因表达及染色质环境。本文详细描述了一种CEM方法及其在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中Oct4位点的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因上的应用，用于降低该位点的基因表达和组蛋白尾部乙酰化水平。我们通过荧光显微镜、流式细胞术和染色质免疫沉淀（ChIP）结合定量聚合酶链式反应（qPCR）对先导化合物CEM23进行了表征。尽管该系统在Oct4位点的应用展示了其强大功能，但从概念上讲，CEM技术具有模块化特性，可适用于其他细胞类型及其他基因组位点。
引言
染色质由缠绕在组蛋白八聚体蛋白周围的DNA构成，该结构形成核小体核心颗粒。染色质压缩程度的调控是实现DNA正确修复、复制和表达的关键机制1,2,3。细胞控制染色质压缩水平的方式之一是通过添加或去除组蛋白尾部的各种翻译后修饰。其中两种重要的修饰包括：（1）赖氨酸乙酰化，通常与基因激活相关；（2）赖氨酸甲基化，其功能取决于氨基酸的上下文环境，可与基因激活或抑制均相关。乙酰化和甲基化修饰的添加分别由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白甲基转移酶（HMTs）催化完成，而去除这些修饰则分别由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和组蛋白去甲基化酶（HDMs）执行4,5。尽管这些蛋白质的存在已被发现数十年，但关于染色质修饰机制如何精确调控基因表达的许多细节仍有待阐明。由于染色质调控过程在多种人类疾病中出现异常，深入理解其作用机制有望为未来的治疗应用提供新思路。
染色质体内分析（chromatin in vivo assay, CiA）是一种最近报道的技术，利用化学诱导邻近分子（chemical inducer of proximity, CIP）来调控染色质修饰机器向特定基因座....
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方案
1) 用于生产慢病毒的细胞系培养
- 在含10%胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、1×非必需氨基酸（NEAA）、青霉素/链霉素（Pen/Strep）和2-巯基乙醇的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂培养箱中培养新鲜的低传代（传代次数少于30次）293T人胚胎肾细胞2每3至5天或在细胞达到完全融合前进行传代培养 > 95% 汇合度。
- 传代293T HEK细胞，细胞数量为18 × 106 每15厘米培养皿（每种病毒制备使用一个15厘米培养皿）。
- 对于15 cm培养皿，吸除旧培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），吸除PBS，再加入3 mL 0.05%胰蛋白酶。将细胞在37 °C孵育8分钟，期间在孵育一半时间时轻轻摇动并轻敲培养皿使细胞脱落。
注意：此步骤的目的是将细胞制成单细胞悬液。
- 对于15 cm培养皿，吸除旧培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），吸除PBS，再加入3 mL 0.05%胰蛋白酶。将细胞在37 °C孵育8分钟，期间在孵育一半时间时轻轻摇动并轻敲培养皿使细胞脱落。
- 当细胞在次日达到 60%–80% 汇合度时，使用 13.5 µg psPAX2 质粒、4.5 µg pMD2.G 质粒和 18 µg 携带目的基因的慢病毒兼容型递送载体进行聚乙烯亚胺（PEI）转染（即，FKBP-Gal4），108 µL PEI 和 1.8 mL 转染培养基。
- 将DNA、PEI和转染培养基在15 mL锥形管中轻轻混匀，室温孵育15分钟，然....
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结果
我们近期开发了CEM，并证明该技术能够以剂量依赖性和可逆的方式调控报告基因位点的基因表达和染色质环境。图1展示了先导化合物CEM23的模型。在此情况下，插入到Oct4位点的GFP报告基因作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，可将HDAC复合物招募至报告基因位点。
我们旨在表征CiA mESCs中Oct4位点的CEM系统。由于细胞表达GFP，可通过荧光显微镜快速观察报告基因的表达情况。在用100 nM CEM23处理48小时后对细胞进行成像，同时包括未处理的对照细胞。相位图像显示mESCs状态健康，这一点非常重要，因为不健康或已分化的mESCs可能提示GFP表达受到非特异性抑制。荧光图像显示对照组细胞中GFP表达强烈，而经CEM23处理的mESCs中GFP表达降低。代表性图像见图2。
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讨论
本文介绍了近期开发的CEM系统，该系统可用于以剂量依赖的方式调控特定基因的基因表达及染色质环境。我们提供了一种精确的方法，用于研究通过选择性招募特定的内源性染色质调控蛋白来调节基因表达的动态过程。这是一种高度模块化的技术，可用于探究不同的蛋白质修饰和染色质修饰复合物如何协同作用以正确调控染色质环境，同时也有助于研究这些过程在何种情况下发生失调，并具有实现基因特异性的优势。
本文展示了利用新技术可视化染色质结构和基因表达变化的三种方法。通过CEM对特定靶向位点进行扰动后，可利用荧光显微镜分析基因表达的实时变化。随后，可在预设的时间节点上，通过流式细胞术更定量地测量基因表达水平的变化。最后，通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测染色质上翻译后表观遗传修饰的变化；在本实验中，特异性检测了H3K27ac修饰。我们未采用ChIP-qPCR检测HDAC的招募情况，原因是单个基因座上协同作用的HDAC种类繁多。很可能招募的是多种HDAC酶的异质性群体，因此在技术上难以通过ChIP逐一检测所有类型。在先前发表的研究中，我们已证明由GAL4融合蛋白直接招募HDAC3可导致基因表达和染色质修饰发生类似的变.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Hathaway实验室和Jin实验室成员提供的有益讨论。作者还感谢Dan Crona和Ian MacDonald对稿件的审阅。本工作部分由美国国立卫生研究院（N.A.H.）资助项目R01GM118653支持；以及由美国国立卫生研究院（J.J.）资助项目R01GM122749、R01CA218600和R01HD088626支持。本工作还得到了北卡罗来纳大学教堂山分校Eshelman创新研究所提供的三级资助和学生资助（分别由N.A.H.和A.M.C.获得）。额外的资金支持来自T-32 GM007092项目（A.M.C.）。流式细胞术数据在北卡罗来纳大学流式细胞术核心实验室获得，该实验室由北卡罗来纳大学Lineberger综合癌症中心获得的P30 CA016086癌症中心核心支持拨款资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES（用于组织培养） | Corning | 25-060-Cl | |
| BME（2-巯基乙醇） | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | 每批次均经质量检测 |
| Covaris 管 | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris 盖帽 | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI（聚乙烯亚胺） | Polysciences | 23966-1 | |
| 转染培养基（Opti-mem） | Gibco | 31985070 | |
| 病毒离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| 病毒滤膜 | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | 含 EDTA |
| 0.05% 胰蛋白酶 | Gibco | 25400-054 | 含 EDTA |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green 主混合液（不对称花青染料） | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac 抗体 | Abcam | ab4729 | |
| （ChIP 试剂盒）ChIP-IT 高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 | |
| 超声破碎仪 | Covaris | E110 | |
| 超速离心机 | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 离心转子 | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti 离心吊篮 | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 人胚胎肾细胞 | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| 甘油 | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| 甘氨酸 | Fisher | BP381-500 | |
| TE 缓冲液 | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES（用于 ChIP） | Fisher | BP310-100 | |
| 明胶 | Sigma | G1890 | |
| 流式细胞仪，Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 质粒 | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G 质粒 | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| 蛋白酶抑制剂（亮抑蛋白酶肽） | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| 蛋白酶抑制剂（抑肽酶） | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| 蛋白酶抑制剂（胃蛋白酶抑制剂） | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | 由 G. Crabtree 惠赠 | ||
| 分泌 Lif-1C-alpha 的 Cos 细胞 | 由 J. Wysocka 惠赠 |
参考文献
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouz....
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