Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

تنظيم البيئة الكروماتين عملية أساسية للتعبير الجيني السليم. هنا، يمكننا وصف أسلوب للتحكم بالتعبير الجيني عن طريق تعيين الكروماتين--تعديل الآلية بطريقة خاصة بالجينات وعكسها.

Abstract

تنظيم الضغط الكروماتين هو عملية هامة وينظم التعبير الجيني في حقيقيات النوى أعلى. على الرغم من أن الضغط الكروماتين وتنظيم تعبير الجينات تتعطل شائعة في العديد من الأمراض، يكن هناك طريقة محددة المكان، والذاتية، وعكسها لدراسة ومراقبة هذه الآليات من العمل. لمعالجة هذه القضية، لدينا المتقدمة وتتميز جزيئات بيفونكشونال رواية تنظيم الجينات. بربط واحد مكون من جزيء بيفونكشونال رابط بروتين الحمض النووي حيث أن أنه سيتم تعيين لمكان اليل على حدة. ويشرك العنصر الآخر الذاتية الآلية الخلوية تعديل الكروماتين، توظيف هذه البروتينات لجينات للفائدة. هذه الجزيئات الصغيرة، تسمى معدلات جينية الكيميائية (CEMs)، القادرة على التحكم في التعبير الجيني والبيئة الكروماتين بطريقة تعتمد على الجرعة وعكسها. هنا، نحن التفصيل نهجاً جيم وتطبيقه على إنقاص التعبير الجيني و acetylation الذيل هستون في مراسل أخضر نيون بروتين (بروتينات فلورية خضراء) يقع في محور Oct4 في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). نحن تميز القيادة جيم (CEM23) باستخدام مجهر فلوري والتدفق الخلوي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة)، متبوعاً كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). بينما يتضح قوة هذا النظام في محور Oct4 ، نظرياً، التكنولوجيا جيم هو نمطي ويمكن تطبيقه في أنواع الخلايا الأخرى، وفي غيرها المكاني الجينوم.

Introduction

الكروماتين يتكون من الحمض النووي الملتفة حول هيستون أوكتامير البروتينات التي تشكل الجسيمات نوكليوسومي الأساسية. تنظيم الضغط الكروماتين إليه أساسية للمناسبة الحمض النووي وإصلاح النسخ المتماثل، والتعبير1،2،3. إحدى الطرق التي الخلايا التحكم في مستوى الضغط عن طريق إضافة أو إزالة التعديلات ذيل هيستون بوستترانسلاشونال مختلفة. اثنان من هذه التعديلات تشمل acetylation يسين (1)، والأكثر شيوعاً المرتبطة التنشيط الجيني، ومثلايشن يسين (2)، التي يمكن أن تكون مرتبطة بتنشيط الجينات أو القمع، تبعاً للسياق من الأحماض الأمينية. إضافة علامات acetylation ومثلايشن هو تحفزها هيستون أسيتيلترانسفيراسيس (القبعات) وهيستون ميثيلترانسفيراسيس (همتس)، على التوالي، في حين يتم إزالة العلامة هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس) وهيستون ديميثيلاسيس (HDMs )، على التوالي4،5. على الرغم من وجود هذه البروتينات معروفا منذ عقود، آليات عديدة كيف الكروماتين--تعديل إليه يظل يعمل بشكل صحيح تنظيم التعبير الجيني تعريف. نظراً للعمليات التنظيمية الكروماتين dysregulated في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، رؤى ميكانيكية جديدة يمكن أن تؤدي إلى تطبيقات علاجية في المستقبل.

الكروماتين في فيفو المقايسة (السي أي أية) هو تقنية وصف مؤخرا يستخدم محفز كيميائية القرب (CIP) للتحكم في الكروماتين--تعديل إليه التوظيف إلى موضع محدد6. قد استخدمت هذه التكنولوجيا لدراسة قائمة توسيع ديناميات الكروماتين، بما في ذلك البروتينات هستون تعديل, remodelers الكروماتين، والنسخ العوامل6،7،،من89. الكروماتين على أساس CIP الربط من البروتينات مناشئ أعرب أيضا قد مدد في الماضي وكالة المخابرات المركزية الأمريكية تعدل غير التعديل الجيني المكاني الاستخدام مع بروتين المرتبط بتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر كريسبر المعطلة (dCas9) 10 , 11-في نظام السي أي أية، وتم تعديل ميسكس للتعبير عن جين مراسل بروتينات فلورية خضراء في محور Oct4 ، منطقة الغاية المعلنة والتنظيم الصارم لجينوم مسك. سابقا، وقد طبق هذا النظام لوصف توظيف إنزيم التي تربط بين H3K9me3 وتنتشر علامات القمعية (مثلاً، H3K9me3) هيتيروتشروماتين أعرب عن مناشئ البروتين 1 (HP1)، تعتمد على الجرعة وعكسها والحمض النووي مثلايشن6. لإنجاز هذا النوع من استراتيجية التوظيف، مصابون ميسكس بلازميد يعبر عن FK506 ملزمة بروتين (فكبب) مرتبطة Gal4، وهو نقطة ربط الحمض النووي-بروتين الذي يربط بين مجموعة Gal4-ملزمة المنبع للمراسل بروتينات فلورية خضراء. الخلايا مصابون أيضا مجال فكبب-ربمسن-ملزمة (FRB) متصلاً HP1. عندما ميسكس يتعرضون لتركيزات منخفضة نانومولار المركز الدولي للبطاطا، ربمسن، FRB وفكبب، هي جمعت في المكان المستهدف. في غضون أيام علاج ربمسن، تقمع التعبير عن الجين المستهدف، كما يتضح من الأسفار مجهرية والتدفق الخلوي، وانخفض acetylation هستون، سيظهر برقاقة وتسلسل بيكبريتيت. بينما التنمية والتحقق من صحة هذا النهج تم تحقيق تقدم كبير في مجال البحوث الكروماتين والتنظيم، عيب واحد هو تعبير الخارجية المطلوبة لتعديل الكروماتين إليه.

لجعل التكنولوجيا القائمة على التوظيف فقط الإنزيمات ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية الذاتية وجعل نظام المرن أكثر، مصممة، وتتميز جزيئات بيفونكشونال الرواية، ووصف يتبع (الشكل 1)12. يتضمن مكون واحد من يتبع FK506 الذي يماثل ربمسن، يربط محكم وعلى وجه التحديد إلى فكبب. وهكذا، سيتم تعيين يتبع لا يزال لمحور Oct4 في ميسكس السي أي أية. العناصر الأخرى من يتبع هو النصف الذي يربط إليه تعديل الكروماتين الذاتية. في دراسة تجريبية، اختبرنا CEMs التي تحتوي على مثبطات هداك. بينما مفهوم استخدام المانع تجنيد هداكس يبدو غير بديهية، المانع غير قادرة على توظيف النشاط هداك للجينات للفائدة. يتم ذلك عن طريق (1) إعادة توجيه في هداك إلى موضع، الإفراج عن الإنزيم، وزيادة كثافة هداكس تحول دون الأمم المتحدة في المنطقة، وتثبيط هداك (2) الحفاظ على في موضع، ولكن توظيف مجمعات القمعية التي تربط هداكس تحول دون، أو (3) مزيج من كليهما. في دراسة سابقة، نحن بينت أن يتبع قادرة على قمع بنجاح المراسل بروتينات فلورية خضراء بطريقة تعتمد على جرعة ووقت، وكذلك في طريقة سرعة عكسها (أيفي غضون 24 ساعة)12. نحن تتميز قدرة التكنولوجيا جيم المقدمة هنا للتعبير الجيني التحكم باستخدام مجهر الأسفار، والتدفق الخلوي، والقدرة للتحكم في بيئة الكروماتين باستخدام رقاقة قبكر6. هنا، يمكننا وصف طريقة لاستخدام وتميز CEMs، مما سيسهل التكيف مع هذا النظام للإجابة على الأسئلة الإضافية ذات الصلة بعلم الأحياء الكروماتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) الخلية خط الثقافة لإنتاج لينتيفيروس

  1. نمو جديدة، مرور منخفضة (أقل من مرور 30) خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK) 293T في دولبيكو الجلوكوز عالية تعديل النسر تكملة الوسائط الأساسية المتوسطة (دميم) مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 10 مم حبيس، 1 × الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، القلم/ بكتيريا، 2-ميركابتونثانول في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تقسيم الخلايا كل 3-5 د وقبل أن تصبح روافد > 95%.
  2. ممر 293T HEK الخلايا مع 18 × 106 كل لوح 15 سم (واحدة تنتج لوحة 15 سم لكل الفيروسات).
    1. لاستخدام تنسيق 15 سم، نضح وسائط الإعلام القديمة وإضافة 10 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ونضح برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل التربسين 0.05%. احتضان الخلايا في التربسين لمدة 8 دقائق في 37 درجة مئوية، والهز، والتنصت على الخلايا في منتصف الطريق من خلال الاحتضان.
      ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة الحصول على الخلايا في تعليق خلية واحدة.
  3. عندما وصلت الخلايا كونفلوينسي 60% إلى 80% في اليوم التالي، أداء من تعداء بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) مع 13.5 ميكروغرام بلازميد psPAX2، 4.5 ميكروغرام من بلازميد pMD2.G، 18 ميكروغرام ناقل لينتيفيرال متوافق مع التسليم بالجينات للفائدة (أي ، فكبب-Gal4)، 108 ميليلتر من بي، و 1.8 مل من تعداء وسائل الإعلام.
    1. بلطف مزيج الحمض النووي، جزيرة الأمير إدوارد، ووسائط الإعلام تعداء في أنبوب مخروطي 15 مل واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وإضافة دروبويسي إلى لوحة 15 سم.
      ملاحظة: الرجاء استخدام المناسبة سلامة التدابير واتبع جميع مؤسسية وإجراءات السلامة في المختبرات بعد هذه الخطوة، كجميع الكواشف وسوف تحتوي على فيروسات حية.
  4. بعد 16 ساعة من تعداء والاحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2، نضح وسائط الإعلام ولطف إضافة جديدة وسائط HEK 293 (بريوارميد في حمام مائي 37 درجة مئوية) إلى لوحات 15 سم. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 عن 48 ساعة بعد تغيير الوسائط. ثم الفيروس على استعداد لأن تحصد.

2) العدوى من "الماوس الخلايا الجذعية الجنينية" (مسك) مع لينتيفيروس

  1. تنمو مرور منخفضة (أقل من سن 35)، خالية من تغذية ميسكس وكالة المخابرات المركزية تكييف في عالية-الجلوكوز دميم قاعدة الوسائط وتستكمل مع 20% FBS الصف ESC، 10 مم حبيس، عامل مثبط اللوكيميا x NEAA والقلم/بكتيريا ميركابتونثانول 2 1: 500 1 (LIF) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% 2من أول أكسيد الكربون.
    ملاحظة: يتم الحصول على ليف من المادة طافية الخلايا المنتجة "ليف كوس"، والتي تم جمعها في دفعة والمجمدة في-80 درجة مئوية.
    1. تنمو الخلايا في اللوحات التي تم بريينكوباتيد ح 1-3 مع الجيلاتين 0.1% في برنامج تلفزيوني x 1، وغسلها في وقت لاحق مع برنامج تلفزيوني 1 x. تغذية الخلايا يوميا وتقسيمها كل د 2-3، اعتماداً على كثافة.
      ملاحظة: شكلياً، مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية (ES) ينبغي أن تكون صغيرة، مستديرة، وتختلف عن بعضها البعض.
  2. مرور مسك في شكل لوحة 12-جيدا (100,000 الخلايا في البئر) د 1 قبل الإصابة.
    1. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير. للخلايا التي نمت في شكل 10 سم، نضح وسائط الإعلام القديمة وإضافة 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني ونضح برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 0.25% التربسين. احتضان الخلايا في التربسين لمدة 8 دقائق في 37 درجة مئوية، والهز، والتنصت على الخلايا في منتصف الطريق من خلال الاحتضان. والهدف من هذه الخطوة الحصول على الخلايا في تعليق خلية واحدة.
  3. تعبئة الخلايا من الخطوة 1، 4، ح 48 بعد تغيير وسائط الإعلام من الفيروسية 293T15-سم إزالة ونقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. الطرد المركزي المادة طافية في 300 x ز لمدة 5 دقائق بيليه خلية الحطام.
  5. تصفية المادة طافية عبر غشاء 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: تأكد من استخدام الأغشية خلات السليولوز خالية من السطح (سفكا)، وبعض المواد الأخرى يمكن أن تحتفظ بالفيروس وتقلل إلى حد كبير من المحاصيل.
  6. تركز الفيروس مع تنبيذ فائق، باستخدام أجهزة الطرد مركزي مع دوار SW32، وأنها تدور 20,000 لفة في الدقيقة (x ~ 72,000 ز) ح 2.5 في 4 درجات مئوية.
  7. بينما يركز الفيروس تحت تنبيذ فائق، علاج ميسكس وكالة المخابرات المركزية في لوحة 12-جيدا مع الوسائط ES الطازجة التي تحتوي على 5 ميكروغرام/مل من بوليبريني.
  8. عند الانتهاء من تركيز الفيروس، نضح المادة طافية بعناية وتعليق بيليه الفيروس في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (تجنب فقاعات الزائدة).
  9. إضافة الفيروس وبرنامج تلفزيوني x 1 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. دوامة/هزة الأنبوب في 300 × ز (أو في وضع أدنى) تعليق هذا الفيروس بشكل كامل. تدور أسفل الأنبوبة في الطرد مركزي منضدية صغيرة ل s 5-10 لإزالة الفقاعات.
  10. إضافة 30 ميليلتر للفيروس لكل بئر من صفيحة 12-جيدا. دوامة اللوحة وثم الطرد المركزي اللوحة في 1,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الفيروس وأضاف تبعاً لعيار الفيروسية، التي ارتباطاً عكسيا بحجم بنية التسليم.
    1. وبدلاً من ذلك، فلاش تجميد الفيروس مع النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية. ومع ذلك، سيخفض تجميد الفيروس عيار الفيروسية.
  11. ضع لوحة 12-جيدا مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية وتغيير وسائط الإعلام في صباح اليوم التالي (ح ~ 16) في وقت لاحق مع وسائل الإعلام وفاق جديدة (كما هو موضح في الخطوة 2، 1).
  12. بعد 48 ساعة إصابة، حدد الخلايا التي تدمج بلازميد الفيروسية عن طريق إضافة المضادات الحيوية المناسبة (أي، 1.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين، 10 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين، و ما إلى ذلك). تغيير وسائل الإعلام يوميا وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x إذا كانت أغلبية الخلايا العائمة/قتيلا. تبقى وسائل الإعلام التحديد في الخلايا ح 72-96 في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2.

3) إعداد s الكيميائية المعدلات جينية (جيم) والعلاج

  1. تعليق جيم المجفف إلى ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى تركيز مخزون من 1 مم وتركيز عامل من 100 ميكرومتر.
  2. بعد الخلايا خضعوا لاختيار ح 72-96، تقسيم ميسكس في شكل 12-جيدا مع خلايا 100,000/جيدا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 24 h. بعد ذلك، تعد حلاً وسائط من 100 نانومتر جيم مع وسائل الإعلام ES. استخدام هذه الوسائط لتغذية مسك وكالة المخابرات المركزية مع 1 مل/حسنا. لتكون بمثابة عنصر تحكم، تبقى جيدا خلايا دون أي يتبع المضافة.
    1. تغيير الوسائط يسفط وسائل الإعلام القديمة وإضافة 1 مل/جيدا من الطازجة المحتوية على جيم أو ES خالية من جيم وسائل الإعلام كل 24 ساعة طوال فترة التجربة.

4) تحليل التعبير بالفحص المجهري والتدفق الخلوي

  1. بعد 48 ساعة معاملة جيم، صورة الخلايا دون علاج جيم والخلايا تعامل مع 100 نانومتر جيم باستخدام مجهر الأسفار. تأخذ الصور التمثيلية باستخدام المرحلة أو برايتفيلد لتسجيل مورفولوجية مسك في 20 X التكبير؛ ينبغي أن تشكل الخلايا المستعمرات الجولة، مع بعض الخلايا المتمايزة. تحت القناة fluorescence فيتك، صورة كلا الشرطين الخلية.
  2. عزل بالتحكم والخلايا المعالجة بجيم للتدفق الخلوي يسفط وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 1 مل من 1 x PBS، يسفط في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.25 مل التربسين 0.25% مع يدتا لمدة 8-10 دقيقة.
  3. التأكد من أن الخلايا لم تعد في كتل كبيرة من خلال النظر في المجهر. استخدم تكبير X 20. إذا لم تظهر الخلايا في تعليق خلية واحدة، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع ماصة P1000 الكامل تريبسينيزي الخلايا.
  4. آرو التربسين مع 1 مل من وسائط الإعلام الجديدة وريسوسبيند الخلايا بسرعة عالية مع ماصة مصلية (أو باستخدام ماصة P1000 ونصيحة) حتى يتم الخلايا في تعليق خلية واحدة.
  5. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 300 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية. يغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x وريسينتريفوجي الخلايا. نضح المادة طافية PBS.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 مل من المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية (1 مم الإيثيلين حمض [يدتا]، 1 x PBS، و 0.2% ألبومين المصل البقري [جيش صرب البوسنة]).
    1. إجمالي حجم المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية سوف تعتمد على عدد الخلايا موجودة، ولكن ينبغي أن يكون التركيز الخلايا 1,000 3,000/ميليلتر. حساب عدد الخلايا في عينات 3 ومتوسط تركيز الخلايا. إضافة المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية أكثر إذا لزم الأمر.
  7. أداء التدفق الخلوي في > 50,000 الخلايا مع الخلايا مع وقف التنفيذ، وحفظ الخلايا على الجليد عندما يتم لم يجري تحليلها. استخدام عامل تصفية 530/40 (فيتك، AF488، التجارة والنقل، و ما إلى ذلك) لتسجيل التغييرات في التعبير. تحديد الجهد الفلورسنت المناسب باستخدام نموذج خلية تحكم غير معالجة وتعيين الجهد أن يكون ذروة الفلورسنت تكون في وسط الطيف كثافة مسجل. تشغيل العينات بسرعة غمد من خلايا حوالي 5,000/s.
  8. تصدير البيانات وتحليل الملفات FCS على برنامج تدفق الخلوي (أي، فلوجو) طريق النابضة أولاً على مبعثر الأمام مقابل الجانب المبعثر للخلايا الحية، ثم على مبعثر إلى الأمام من الارتفاع مقابل منطقة لنوع. ثم، تصور بروتينات فلورية خضراء قناة البيانات في الرسم بياني تحديد تعبير بروتينات فلورية خضراء النسبي في المستهدفة والسيطرة على السكان.

5) تحليل الكروماتين بلونين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) متبع قبل قبكر

  1. انقسام في ميسكس صفيحة 10 سم مع الخلايا 3 مليون و 10 مل من دإط وسائل الإعلام (لوح 10 سم واحد لكل التجريبية أو السيطرة على حالة). وفي اليوم التالي إضافة 10 مل وسائط التي تحتوي على جيم أو جيم مجاناً. بعد 48 ساعة معاملة جيم، نضح وسائط الإعلام القديمة. أغسل ونضح الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS. المقبل، فصل الخلايا مع التربسين 0.25%، واخماد التربسين مع 10 مل من دإط وسائل الإعلام. عد وعزل عينة خلايا 10 مليون كل حالة.
  2. تدور أسفل كل من العينات 10 مليون خلية في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  3. ريسوسبيند كل بيليه في 10 مل من 1 x PBS وريسينتريفوجي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. ريسوسبيند كل بيليه في 10 مل من المخزن المؤقت لإصلاح وكالة المخابرات المركزية الأمريكية (50 مم درجة الحموضة 8، 1 مم يدتا درجة الحموضة 8، 0.5 مم جليكول-مكررا [ß-أمينو إيثايل البروم ثنائي الفينيل]-N, N, N '، N'-tetraacetic acid [عطا] درجة الحموضة 8، و 100 ملم كلوريد الصوديوم [كلوريد الصوديوم]). أضف 1 مل من محلول الفورمالديهايد 11% وعكس العينات 5 x-10 x فورا. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. إضافة 0.5 مل جليكاين 2.5 م. عكس العينات فورا واحتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق.
  6. الطرد المركزي العينة في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية.
  7. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من وكالة المخابرات المركزية الأمريكية شطف 1 (50 مم حبيس درجة الحموضة 8، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا درجة الحموضة 8، والغليسيرول 10%، 0.5% P-40 نونيديت [NP40]، و 0.25% تريتون X100). احتضان العينة على الجليد للحد الأدنى 10 الطرد المركزي في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  8. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من وكالة المخابرات المركزية الأمريكية شطف 2 (10 ملم تريس [هيدروكسيميثيل] أمينوميثاني [تريس] درجة الحموضة 8، 1 مم يدتا درجة الحموضة 8، 0.5 مم عطا pH 8، و 200 ملم كلوريد الصوديوم). الطرد المركزي العينة في س 1,200 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. إضافة 5 مل من وكالة المخابرات المركزية الأمريكية القص المخزن المؤقت (0.1% الحزب الديمقراطي الصربي ويدتا 1 ملم 10 ملم تريس pH 8) على طول جانبي الأنبوبة المخروطية يغسل أي الملح دون تعطيل بيليه بلطف. الطرد المركزي العينة في س 1,200 ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر الخطوة الغسيل.
  10. ريسوسبيند بيليه في 90 ميليلتر من وكالة المخابرات المركزية الأمريكية القص المخزن المؤقت ومثبطات البروتياز الطازجة (استخدام خليط من ليوبيبتين وتشيموستاتين وبيبستاتين بحله معا في 10 ملغ/مل كل في [دمس] جعل من 1,000 x حل الأسهم، مما يجعل تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل). إضافة 10 ميليلتر لتعزيز سونيكيشن نانودروبليتس مع إبقاء كل شيء على الجليد13،14.
  11. نقل 100 ميليلتر من الحل إلى أنبوب زجاج وكاب الأنبوب.
  12. Sonicate العينات لمدة دقيقة 3.5 (يحدد على أساس خط الخلية وعدد من الخلايا). لتجنب الانهاك العينات، عملية العينات في أوقات الدورة 2-دقيقة-الحد الأقصى إذا تجاوز الوقت الإجمالي sonication 2 دقيقة.
    ملاحظة: أولتراسونيكاتور مركزة المستخدمة هنا وظائف في وتيرة عالية (500 كيلو هرتز). تشغيل الجهاز طاقة صوتية من 55 جورج وينبغي أن سلفا مدة سونيكيشن بكل مختبر الفردية.
  13. نقل كل عينة الكروماتين سونيكاتيد إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة. تدور هذه الأنابيب في 8,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  14. لتحليل كفاءة القص والتحديد الكمي لمقدار نسبي من الكروماتين، اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة مجموعة شرائح.
    ملاحظة: تحديد تركيز الحمض النووي سبيكتروفوتوميتريكالي (مثلاً، استخدام أداة نانودروب الحمض النووي)، وتشغيل ~ 200 نانوغرام من الحمض النووي في 1% [اغروس] هلام للتحقق من أن الكروماتين هو سونيكاتيد إلى ما يقرب من 200-500 باسيبيرس (bp) في الحجم.
  15. لإجراء إيمونوبريسيبيتيشن وعزل في الكروماتين، اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة مجموعة شرائح.
    ملاحظة: إيمونوبريسيبيتيشن العينات بتركيزات أعلى من الحمض النووي، الحارة شطف المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية والوت العينات 2 x مع 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (الغزل لمدة 1 دقيقة في كل مرة).
  16. لإجراء قبكر، تحميل الكواشف صفيحة 384-جيدا. إضافة 5 ميليلتر من 2 × سينين غير متناظرة صبغ مزيج الرئيسي، 2.5 ميكرون كل التمهيدي والماء 0.1-10 نانوغرام من الحمض النووي لكل رد فعل.
    1. كبسولة تفجير تصميم لتضخيم 50-100 أمبليكونس شركة بريتيش بتروليوم، وقيم CT تطبيع لجين حفظ البيت، جسيمات من نوع A إينتراسيستيرنال (IAP).
      ملاحظة: لمزيد من أساليب qPCR، انظر البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة كيت. كانت مجموعة التمهيدي المستخدمة لاستهداف موضع Oct4 : كاكاتجاجكاجكاكجاكت (و)؛ (ص) ككتجاجاجاتجتجكجك. كان التمهيدي التحكم المحددة المستخدمة للأكاديميات الهدف: أتتكجككتاجاكجتجتكا (واو)؛ (ص) أكتككاتجتجكتكتجككتك.
    2. استناداً الإشعال والمنتج المطلوب، تشغيل في قبكر مع دورات 40 درجة حرارة انلينغ 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: البيانات الناتجة كانت quantitated استخدام المقارنات Ct دلتا دلتا بين العينات، مع CiA:Oct4 تطبيع خلال الأكاديميات. يتم عرض نتائج التحليل النهائي كمتوسطات ثلاث عينات تجريبية، مع الخطأ تمثيل كالانحراف المعياري من الوسط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ونحن مؤخرا نمواً يتبع وأثبتت أنه يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا لتنظيم التعبير الجيني والبيئة الكروماتين في موضع مراسل بطريقة تعتمد على الجرعة وعكسها. في الشكل 1، نموذجا للقيادة جيم، CEM23، ويرد. إليه هداك جندتهم لمحور مراسل المانع هداك هو، في هذه الحالة، المراسل بروتينات فلورية خضراء إدراجها في محور Oct4 .

سعينا إلى تميز النظام جيم في محور Oct4 في ميسكس السي أي أية. لأن الخلايا التعبير عن التجارة والنقل، كان من الممكن تصور بسرعة التعبير عن المراسل مع الفحص المجهري الأسفار. تم تصويرها في الخلايا بعد 48 ساعة معاملة مع 100 نانومتر CEM23، جنبا إلى جنب مع الخلايا غير المعالجة. إظهار الصور المرحلة ميسكس صحية، الذي أمر مهم لأن ميسكس غير صحية أو متمايزة سيشير قمع بروتينات فلورية خضراء غير محددة. إظهار الصور fluorescence تعبير بروتينات فلورية خضراء مشرقة في الخلايا التحكم وتعبير بروتينات فلورية خضراء انخفاض في ميسكس تعامل مع CEM23. يتم عرض الصور الممثل في الشكل 2.

واستخدمت لقياس التغيرات في تعبير بروتينات فلورية خضراء، التدفق الخلوي. مرة أخرى، يعاملون ميسكس وكالة المخابرات المركزية مع 100 نيوتن متر CEM23 لمدة 48 ساعة. تعد تجريبية الخلايا تعامل مع الخلايا CEM23 ومراقبة للتدفق الخلوي، باستخدام الخلايا > 100,000 كل عينة. دأبت، لاحظنا > 30% انخفاض في خلايا معربا عن التجارة والنقل بين تلك تعامل مع يتبع. يظهر الرسم بياني ممثل في الشكل 3.

مرة واحدة وقد أظهرت الأدلة الانخفاض التعبير الجيني بروتينات فلورية خضراء الناجمة عن جيم، قمنا باختبار للتغيرات في بيئة الكروماتين باستخدام رقاقة. هو أحد العوامل الهامة لإعداد العينات لرقاقة مدى sonication الكروماتين. أن العينات التي تتسق والمنفصمة بشكل صحيح قدر الإمكان، كانت سونيكاتيد الخلايا 10 مليون لمدة 3.5 دقيقة للحصول على الكروماتين بين 200 و 500 bp في الحجم (الشكل 4). لأن افترضنا أن يتبع القمعية الملزمة وتوظيف البروتينات هداك ومجمعات القمعية للمراسل، قمنا باختبار للتغييرات في هيستون acetylation الذيل. هيستون 3 27 يسين أسيتيليشن (H3K27ac) يوجد عادة على طول الموقع ابدأ النسخي (TSS) الجينات. ونحن أداء رقاقة مع جسم مضاد ل H3K27ac وثم يقوم قبكر مع مجموعات التمهيدي المنبع والمصب لخدمات الدعم التقني. وتبين النتائج أن علاج 48 ساعة مع 100 نيوتن متر CEM23 انخفض مستوى H3K27ac في موضع الهدف عند مقارنة مع الخلايا التحكم لا تعامل مع يتبع (ف < 0.01،-التائي t-يعيد الاختبار مع ثلاثة البيولوجية، الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1 : ربط يتبع CiA:Oct4 موضع من خلال التوظيف على إليه جينية الذاتية فكبب وحبل. يظهر نموذج النظام جيم Gal4-فكبب كمرساة البروتين للحمض النووي. الجزء FK506 جيم يربط فكبب والمانع هداك المجندين البروتينات هداك الذاتية لقمع التجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : الصور fluorescence الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ميسكس) مع CiA:Oct4 المراسل-التجارة والنقل- صور مجهرية الأسفار تظهر انخفاضا في تعبير بروتينات فلورية خضراء على المعاملة جيم. يظهر أعلى اللوحة المرحلة ونيون صور ميسكس نمت مع وسائل الإعلام غير المعالجة. تظهر لوحة أسفل المرحلة وفلوري ميسكس تعامل مع 100 نيوتن متر CEM23 لمدة 48 ساعة. الصور تكييفها مع إذن من البيولوجيا التركيبية ACS12. حقوق التأليف والنشر (2018) جمعية الكيميائيين الأمريكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 3
الشكل 3 : تحليل التدفق الخلوي كوانتيتاتيس تعبير انخفض من التجارة والنقل في ميسكس عند المعاملة CEM23. وقورنت ميسكس دون CEM23 (الأزرق) مع ميسكس تعامل مع 100 نيوتن متر CEM23 لمدة 48 ساعة (أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 : سونيكيشن الكروماتين موحدة، وتشويه مرئياً بين 200 و 500 هناك أداء رقاقة--قبكر، وكان سونيكاتيد الكروماتين من ميسكس. كل عينة تتألف من حوالي 10 مليون الخلايا، التي كانت سونيكاتيد لمدة 3.5 دقيقة، لإنتاج عينات الكروماتين المثل المنفصمة بين 200 و 500 bp في الطول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الشكل 5 : العلاج CEM23 يسبب نقصان في H3K27ac في مقر وكالة المخابرات المركزية الأمريكية- وأجرى رقاقة qPCR لاختبار للتغييرات في البيئة الكروماتين. بعد علاج 48 ساعة مع 100 نانومتر CEM23، لوحظ انخفاض في H3K27ac في CiA:Oct4 (* *ف < 0.01،-التائي t-الاختبار مع ثلاثة replicates البيولوجية. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف النظام جيم وضعت مؤخرا يجري تطبيقها على تنظيم التعبير الجيني والبيئة الكروماتين في جين معين بطريقة تعتمد على الجرعة. نحن نقدم طريقة دقيقة لدراسة ديناميات المشاركة في تنظيم التعبير الجيني من خلال التوظيف الانتقائي من البروتينات التنظيمية المحددة الكروماتين الذاتية. هذا هو نمطي عالية تكنولوجيا التي يمكن تطبيقها للتحقيق المختلفة كيفية تعديل البروتين والكروماتين مجمعات العمل يدا واحدة لتنظيم البيئة الكروماتين، وكذلك بشكل صحيح فيما يتعلق بدراسة كيف أن هذه العمليات هي dysregulated، مع الاستفادة من تحقيق خصوصية الجينات.

هنا، وقد عرضت ثلاث طرق لتصور التغيرات في هيكل والجينات الكروماتين التعبير مع التكنولوجيا الجديدة. بعد اضطراب المكاني مستهدفة محددة مع يتبع، يمكن تحليل التغييرات في الوقت الحقيقي للتعبير الجيني بالفحص المجهري الأسفار. ثم، يمكن قياس التغيرات في مستويات التعبير الجيني أكثر كمياً مع التدفق الخلوي في نقاط نهاية محددة. وأخيراً، بحثت التغييرات على علامات جينية بوستترانسلاشونال في الكروماتين برقاقة؛ على وجه التحديد، في هذه الحالة، H3K27ac. نحن لا اختبار التوظيف هداك مع رقاقة--قبكر بسبب تنوع هداكس التي تعمل في الحفل محور واحد. فمن المحتمل أنه تم توظيف عدد سكان المتباينين من الإنزيمات هداك و، ولذلك سيكون صعباً من الناحية التقنية اختبار لهم من قبل جميع شرائح. في عمل منشورة سابقا، لقد أظهرنا أن التوظيف المباشر من HDAC3 طريق انصهار GAL4 الناجمة عن نشاط مماثل على تعديل الكروماتين والتعبير الجيني رقاقة12. إذا كان هو يجري التضمين مراسل غير الفلورية، تغييرات في التعبير الجيني أيضا يمكن أن يقاس ب (1) تحليل الحمض النووي الريبي تعبير مع qPCR المنتسخة العكسية أو التعبير (2) البروتين مع النشاف الغربية، أو التصوير وإجراء التدفق الخلوي مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت.

فيما يتعلق بالتقنيات الحالية على أساس CIP مثل نظام السي أي أية 12، هذه التكنولوجيا جيم بالاستفادة من توظيف الذاتية المغيرون جينية للجين المستهدف. إعادة توجيه أجهزة الخليوي الخاصة يخلق وسيلة ذات صلة أكثر من الناحية الفسيولوجية لتحوير التعبير. مناشئ معربا عن الإنزيمات الرئيسية، مثل القبعات وعوامل النسخ، قد يؤدي إلى آثار جانبية من التعبير عنها زيادة، لا سيما حين لا يجندون بنشاط إلى موضع الجينات.

بينما توضح هذه المقالة وظيفة هذا النظام رواية مع يتبع يتألف من مثبطات هداك، يمكن توليفها عدة مثبطات أخرى أو المجندين البروتين بدلاً من المانع هداك. لتحقيق تنشيط الجينات، يمكن توليفها هات المانع-أو هدمت يتبع المستندة إلى المانع. لقمع وثم أوفيريكسبريس نفس الجين، من الممكن علاج الخلايا مع جيم قمعية وغسلها مع وسائط الإعلام العادية ثم إضافة تفعيل جيم. وهذا سيسمح لنظام نظيف لدراسة ديناميات تجنيد القمعية وتفعيل المجمعات إلى نفس المنطقة الجينوم. عند تصميم يتبع مستقبلا، تحتاج العديد من الخصائص النظر، بما في ذلك نفاذية الخلية وفاعلية المانع والهيكل وحركية المثبطة. طول الرابط بين FK506 ومجموعة المجند ستؤثر على نفاذية يتبع، وكذلك موقف البروتين المعينين. عند مقارنة يتبع اثنين تختلف فقط في طول الرابط، كان جيم مع رابط أقصر أكثر فعالية12. وفي حين أنه لم يتم اختباره مباشرة هنا، فعالية أعلى نتيجة لزيادة نفاذية الخلية. اختيار مثبطات التركيبات الكيميائية قابلة للتعديل دون الإخلال بالجزء الذي يربط بين موقع نشط الهدف مهم أيضا. واعتبرت أيضا بفاعلية وخصوصية بتحديد الموانع بفاعلية عالية وخصوصية لفئة معينة من البروتينات. قد تؤثر حركية تثبيط فعالية يتبع. يتبع تتألف من مثبطات ببطء على الخروج معدلات تميل إلى أن تكون أقل فعالية.

قيد واحد جيم التكنولوجيا الحالية هو المطلب لمجموعة Gal4-ملزمة في موضع الجينات المستهدفة. لتعيين يتبع لمنطقة خلاف موضع Oct4 السي أي أية ، يمكن استخدام أي المئات من المهندسة Gal4 التنشيط المنبع تسلسل (UAS) الخطوط المتاحة للمجتمع العلمي. طريقة واحدة وستبذل المزيد من وحدات النظام من خلال إدماج Cas9 المعطلة (dCas9) مع إنزيم جينية الكيميائية توظيف10،،من1115. لا يزال سيتم توظيف هذا البروتين نوكلاس-الميت من نظام كريسبر-Cas9 إلى أي منطقة في الجينوم الذي صمم دليل الحمض النووي الريبي (جرنة)، إلا أنها لن تخفض الحمض النووي. استخدام انصهار dCas9-فكبب، سوف تجند المكون فكبب CEMs حيث يتم تجنيده في dCas9، إلى حد كبير زيادة السهولة والمرونة للجينات المستهدفة المحتملة. تخيل استخدام هذه التكنولوجيا لاستهداف الجينات ذات الصلة بالمرض كاحتمال علاجية أو وسيلة من خلالها بشكل قابل للعكس ووقتيا دراسة آليات المرض على مستوى الكروماتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات هاثاوي وجين للمناقشات المفيدة. كما يشكر المؤلفون كرونا دان وإيان ماكدونالد للقراءة الحرجة من المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا R01GM118653 منحة من "معاهد الصحة الوطنية الأمريكية" (إلى N.A.H.)؛ وقبل منح R01GM122749، R01CA218600، و R01HD088626 من المستوى الوطني الأمريكي معاهد الصحة (ج. ج.). كما أيد هذا العمل مستوى 3 وطالب بمنحه من معهد اشيلمان UNC للابتكار (N.A.H و A.M.C، على التوالي). تمويل إضافي من GM007092 T-32 (A.M.C) تدعم هذا العمل. تم الحصول على بيانات التدفق الخلوي في UNC التدفق الخلوي الأساسية مرفق تموله P30 CA016086 السرطان مركز الأساسية دعم منحة لمركز السرطان الشامل لينبرجر UNC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، علم الأحياء الكيميائية الجزيئات بيفونكشونال،، 139 مسألة المواد الكيميائية الناجمة عن قرب، تنظيم الكروماتين، القمع الجينات، deacetylase هيستون، والتخلق، والمعدلات الكيميائية جينية، ويتبع
قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter