Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

激光扫描显微术实时跟踪眼球前室胸腺细胞

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

该协议的目的是通过激光扫描显微镜在小鼠眼前腔的胸腺植入物中显示胸腺细胞的纵向活体实时跟踪。角膜的透明度和移植的血管化允许持续记录祖细胞的招募和成熟的 T 细胞出口。

Abstract

所提出的方法的目的是首次显示, 新生儿 thymi 移植到等基因系成年小鼠的前眼室,在体内纵向实时监测 thymocytes´动态在血管内胸腺段。在移植后, 激光扫描显微镜 (LSM) 通过角膜允许在体内无创重复成像的细胞分辨率水平。重要的是, 该方法增加了以前的活体 T 细胞成熟成像模型的可能性, 连续祖细胞招募和成熟的 T 细胞出口记录在同一动物。该系统的额外优点是移植区的透明度, 允许对植入组织进行宏观的快速监测, 以及植入物的可移植性, 除了系统治疗外, 还可以进行局部化处理。主要的限制是组织的体积, 适合在减少的空间的眼睛室, 要求裂片修剪。通过解剖胸腺裂片, 在先前显示为成熟 T 细胞生产功能的模式中, 器官完整性最大化。该技术可能适合于询问与胸腺功能相关的医学相关问题的环境, 包括自身免疫、免疫机能丧失和中枢耐受;仍然机械化的过程。对诱导胸腺细胞迁移、分化和选择的机制进行精细的解剖, 将会导致新的治疗策略以发展 T 淋巴细胞为目标。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

胸腺 t 细胞分化和 t 细胞亚群选择是发展和维持细胞介导免疫在脊椎动物1的关键过程。这一过程涉及复杂有序的活动序列, 包括从血液中招募祖细胞, 增殖和迁移, 膜蛋白的差异表达, 以及大规模程序性细胞死亡的子集选择。其结果是, 成熟的 T 细胞的释放反应到丰富的外国抗原, 同时显示最小的反应, 自肽, 最终殖民的外围淋巴器官的个体2,3。αβTCR 的异常胸腺细胞选择导致自身免疫性疾病或免疫失衡4 , 主要来源于在阴性或阳性前体选择过程中的缺陷。

胸腺胸腺的定向迁移是 T 细胞成熟的所有阶段的内在特性, 它被设想为一系列同时或连续的多重刺激, 包括趋化因子、粘合剂和脱粘细胞外基质 (ECM)。蛋白质相互作用3,5。对固定组织的研究为胸腺微环境56中胸腺细胞迁移线索的表达模式提供了关键信息, 而活体研究揭示了两种常见的胸腺细胞在两个组织学不同区域的迁移行为: 皮质缓慢随机运动, 髓质7,8,9,10,11,12,13. 移徙率增加与胸腺阳性选择13相关, 阴性选择与爬行行为有关, 这一假说表明, 通过胸腺进行的旅程的动力学决定适当的胸腺细胞的成熟。尽管它们的相关性, 胸腺细胞间质细胞相互作用的拓扑结构和胸腺组织运动的动力学在器官微环境期间在 T 体细胞成熟仍然是未定义的。

迄今进行的大多数活体研究包括胎儿或 reaggregate 胸腺器官培养1415、组织切片或完整的胸腺叶外植体, 在那里胸腺细胞运动通过双光子激光扫描可视化。显微术 (TPLSM)8, 活体成像技术, 限制最大工作距离和成像深度1毫米根据组织检查16。与依赖于延长潜伏期形成3维结构的艰苦的胸腺器官培养相比, 胸腺切片技术和完整的胸腺叶方法允许控制引入预先标记的特定子集胸腺细胞进入一个本土的组织建筑环境。然而, 由于这些模型中没有血流, 它们显然仅限于研究胸腺沉降祖 (TSPs) 对胸腺实质的招募过程或成熟 T 细胞胸腺 egression 的动力学。

在活体模型中研究胸腺 T 细胞成熟生理学的小鼠包括移植的片段或整个器官裂片放置在肾囊17或 intradermally18。虽然这些选择显示了他们的效用, 以询问组织的系统性功能植入, 胸腺移植的位置在动物深处或覆盖层的不透明组织限制其使用在体内检查植入物TPLSM。

由于角膜的透明度, 眼睛的前腔提供了一个容易接近的空间, 直接监测任何接枝组织。的优势, 虹膜形成的室的基础是丰富的血管和自主神经的结局, 使移植的快速重建和神经19,20。凯塞多博士在过去21成功地利用这个解剖空间进行胰岛的维持和纵向研究。在这里, 我们表明, 这一策略不仅是研究胸腺细胞在原生器官结构中的动力学的有效方法, 而且是唯一允许将体内纵向记录扩展到祖招募研究和成熟的 T 细胞 egression 的步骤在小鼠。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

迈阿密大学的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 根据 IACUC 指南批准了所有的实验。

1. 新生儿 Thymi 的分离和修整

  1. 用热处理或其他方法制备所有试剂和仪器, 确保无菌条件。
  2. 为了减少污染, 执行所有的手术程序在层流罩下。
  3. 在 euthanizing 捐赠小鼠之前, 用无菌 prechilled 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 值 7.4) 填充60毫米无菌皿, 并将其放在冰上。它将用于冲洗和储存在移植前的捐赠小鼠切除 thymi。
  4. 根据道德准则, 进行斩首, 弄死新生捐献小鼠。
  5. 将鼠标放在无菌吸水纸巾上, 在背直立的位置和喷雾, 后擦拭, 鼠标腹部与70% 乙醇。
  6. 通过在下腹部的水平上做一个表面的 V 形切口, 并用一对直10厘米的解剖剪刀在腹中线下切开皮肤, 在胸部水平处留下大约 0.5-1 厘米的开口, 从而暴露胸腔。折叠胸部两侧的皮肤, 以暴露胸腔。
  7. 通过隔膜和胸腔用相同类型的剪刀使两个更深的 0.5-1 厘米侧切口进入前胸腔的上纵隔。胸腺应该出现在心脏上方的两个苍白的裂片上。
  8. 将一组弯曲钳置于胸腺下方, 垂直拉拔, 提取完整的器官。用一副镊子防止胸腔保护。如有需要, 使用细钳在提取器官前, 小心撕除周围的结缔组织, 而不干扰胶囊。
    注意: 使用解剖范围有助于此步骤。
  9. 将孤立的胸腺浸入冷不育的 1x PBS (pH 7.4), 以前显示为60毫米无菌皿, 并用手术刀切开连接峡, 以分离胸腺裂片。除去盘子里的杂物, 不伤害胶囊。为了尽量减少 thymi 暴露的时间, 在植入前修剪百里香裂片。
    注意: 每个孤立的新生儿胸腺通常会呈现六段约1毫米宽, 最多三宿鼠在接受植入物的两眼。
  10. 对每个捐献者鼠标重复步骤 1.4-1.9。为了尽量减少 thymi 暴露的时间, 一次分离一个胸腺。

2. 胸腺植入眼前腔

  1. 在移植之前, 标记并称每个收件人鼠标。
  2. 使用 1-2% isofluorane 蒸气之间的剂量来麻醉接收鼠标。在开始手术前, 在脚趾捏后没有反射, 确保正确的麻醉。
  3. 进行胸腺段移植术如下:
    1. 将鼠标置于侧侧卧位, 使一只眼睛面对直接接触到解剖范围的透镜。
    2. 在寒冷的 1x PBS (pH 7.4) 中, 一个孤立的胸腺裂片, 填充60毫米的盘子成片, 1 毫米宽度用于种植体。遵循一个曲折的模式, 以确保每个部分包含胸腺皮质和髓质。根据图 1A中提供的指南, 使用 vannas 剪刀进行修剪。
      注意: 应在植入前对胸腺进行修整, 以优化组织植入。
    3. 从与手术区对应的角膜基底开始, 引入40毫米 G18 针的尖端, 使小切口进入外角膜层, 从而可以介绍解剖剪刀尖端。
    4. 用 vannas 剪刀直接在角膜基底周围进行5-10 毫米侧切口, 同时保持角膜开放, 以防止重新封装。使用平端钳, 避免组织损伤。
    5. 抓住切口角膜上皮, 用一双平端钳抱住角膜, 并通过开口推胸腺段, 从而暴露开口。用无菌 1x PBS (pH 7.4) 或人工泪湿眼, 以防止组织干燥直到操作完成。
    6. 在眼睛表面轻轻按压, 将所介绍的组织段滑向侧向位置, 以保持 eye´s 功能。确保移植物位于眼睛开口对面的位置, 以防止因受欺负而产生的后向干扰。
    7. 借助扁钳, 按压牢固, 约3-5 秒, 两侧角膜张开互相促进自密封。手术不需要任何装订或缝纫。
  4. 如果两只眼睛进行移植, 将鼠标翻转到相反的侧面, 直接将第二只眼睛暴露在解剖显微镜透镜上, 重复步骤 2.3. 2-2. 3.7。
  5. 手术完成后, 用热灯将鼠标返回空笼 prewarmed。
  6. 确保每只被移植的老鼠在把它放进与其他动物共享的笼子之前, 恢复完全的机动性和意识。这通常发生在1小时之内在手术以后。
  7. 在移植时, 根据需要治疗小鼠止痛药, 并为小鼠在饮用水中浓度为1.6 毫克/毫升的乙酰氨基酚。
  8. 对每个收件人鼠标重复步骤 2.2-2.9。
  9. 监测术后动物活动以及植入的眼睛的外观, 以检测潜在的健康并发症。

3. 用3D 单光子荧光共聚焦显微镜对植入 Thymi 的共焦成像

  1. 使用 1-2% isofluorane 蒸气之间的剂量麻醉接收鼠标。在开始成像过程前, 在脚趾捏后没有反射, 确保正确的麻醉
  2. 将鼠标放在一个固定的舞台显微镜平台上, 在一侧的侧卧位置, 使一只眼睛朝上。在显微镜平台上放置一个热垫, 以确保在录音过程中小鼠的体温恒定。
    注: 有关详细信息, 请参阅辅助图 1
  3. 将鼠标的头部插入一个立体定向的 headholder, 并调整旋钮, 以抑制鼠标头部在侧侧位置, 使显微镜的目标直接进入眼睛持有胸腺移植。
  4. 将鼠标的鼻子放进防毒面具, 使动物在整个过程中被麻醉。这可以根据需要调整 isofluorane 蒸气。
  5. 为了便于在录音过程中保持眼睛的稳定, 同时避免眼睑退缩, 在角膜边缘用一双镊子将眼睛拉回眼睑, 并将其贴在聚乙烯管上, 并附有UST-2 实心万向节。这种安排可以稳定的头部和眼睛的固定, 并提供灵活性, 不扰乱血液流动的眼睛, 如前所述22
    注:补充图 1B, C显示完整的组装。
  6. 添加几滴不育的生理盐水或人工泪作为浸泡液之间的角膜和晶状体, 在把显微镜的目标放在鼠标的眼睛。
    注: 在整个过程中需要额外滴液, 以保持显微镜的路径和防止眼部干燥。
  7. 首先使用低放大 (5X) 透镜定位胸腺在显微镜领域。然后切换到更高的分辨率 (10, 20 和 40X) 水浸泡浸渍目标与长的工作距离。使用最小激光功率, 尽量减少扫描时间, 避免光损伤和漂白胸腺植入物。这是通过使用显微镜的共振扫描仪来实现的。
    注: 我们使用的共焦显微镜配备有能够在25帧/秒内采集图像的共振扫描镜。其他品牌有自己的显微镜与共振扫描仪。
  8. 使用显微镜软件选择采集模式, 并启动谐振扫描仪模式。然后选择 XYZT 成像模式并按如下方式配置采集设置:
    1. 旋转氩激光, 并调整功率为30% 的荧光激发。
    2. 选择励磁激光线, 并设置不同发射波长的声光分束器 (AOBS) 控制。此外, 为了检测背向散射和描绘组织结构, 同时使用反射检测。
      注: 选择一组用于励磁 (GFP 和 RFP) 的颜色时, AOBS 自动编程, 将这些励磁线引导到试样上, 并传输它们之间的发射。例如, 对于 GFP 和 RFP, 我们分别使用 488 nm 和561纳米的励磁光的窄反射带。这为发射荧光光子的收集提供了广泛的波段, 从而减少了对激光功率和采集时间的需求。在反射模式下, AOBS 被用作50/50 光束分配器, 用于在任何波长之外的图像反射光, 用于荧光发射检测。
    3. 收集在选定波长的发射, 然后选择一个分辨率的512×512像素, 并开始实时成像通过按下实时按钮, 调整增益水平, 根据需要 (典型的增益约 600 V)。
    4. 定义 z 堆栈的开始和结束, 重点放在胸腺种植体的顶端, 然后选择 "开始", 然后移动到最后一个可以聚焦在植入胸腺中的平面, 然后选择 "末端"。使用 z 步骤大小为5µm。该软件将自动计算共焦平面的数目。
    5. 选择获取每个 z 堆栈的时间间隔 (通常为1.5 到2秒), 然后选择 "获取",直到停止以进行连续成像。
  9. 按 "开始" 按钮进行初始化。
  10. 重复步骤 3.1-3.9, 在不同的时间从同一动物中反复成像移植物。
    注意: 如果动物在两只眼睛上都持有移植物, 可以通过重复步骤 3.2-3.9 在鼠标头部的直立位置一侧进行记录。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

从 B6 中分离出新生小鼠胸腺。Cg-Tg (CAG-DsRed * MST) 1 纳吉/雅小鼠如本议定书所述 (步骤 1.1-1.9)。在这些转基因小鼠中, 鸡β肌动蛋白启动子引导红荧光蛋白质变体 DsRed 的表达。MST 的影响下, 巨细胞病毒 (CMV) 立即早期增强促进跟踪植入物。

为防止组织排斥, 等基因系个体的基因型: C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚荧光蛋白) 30 scha/J被选择为寄主。在这些转基因小鼠中, 人类泛素 C 启动子引导增强的绿色荧光蛋白 (GFP) 在所有组织中的表达, 使受体和供体组织之间有明显的分化。人类泛素 C 启动子的作用导致不同的 GFP 表达模式在某些造血细胞类型。特别是 T 细胞呈现2倍高的 GFP 表达水平比 CD19+B220+ B 细胞或其他外周血细胞, 这可能有助于他们识别的定量敏感技术, 如流式细胞术, 没有任何需要额外的标签。此外, 在成年动物和所有胚胎阶段都能观察到这些小鼠的荧光表达, 并且在细胞类型谱系中给予标记稳定性是一致的。

图 1A所示的胸腺修剪模式如下: 在肾脏胶囊23中植入的功能性胸腺片段的先前描述。这种修剪程序允许减少所植入的组织的总体积, 同时保留器官的功能性组织学基本单位 (皮质, 髓质和皮质-髓质连接 (CMJ) 血管)。从一周大鼠 (图 1A, 右) 的新生儿胸腺 (图 1A, 左) 和胸腺大小之间的显著差异, 应考虑到修剪, 因为空间可容纳植入物在老鼠的前室眼睛是受限的。本文的研究结果包括仅从新生儿获得的植入物。图 1B显示了一种在 GFP 老鼠眼的前腔内植入胸腺段的宏观图像, 以保持动物视觉。在辅助视频 1中共聚焦图像的3D 重建中可以观察到角膜的组织学细节 (与 RFP 植入物相邻的 GFP 组织)。虹膜的植入显示在视频 1图 2中。

图 1C1D分别说明了同一区域的明亮场和荧光图像, 这可能有助于在继续研究中对组织生长和合体的双重宏观跟踪。图 1C也说明了植入组织的血管化, 这应该唯一允许研究胸腺生理学依赖于器官血液供应的时间。

插入胸腺片段的血管化发生在72h 植入后。快速血管化过程与虹膜中发现的大量血管和胸腺在细胞因子生成中的丰富程度有较好的吻合。这些特性使插入 thymi 的快速植入。植入物的血管化表现在视频 2中, 显示了胸腺血管与宿主个体的 iris´ (与 RFP 植入物相邻的 GFP 组织) 的植入, 因此, 确认这里所提供的模型, 实际上允许血管性胸腺无创连续 monitorization 的显微水平。使用 LSM 来可视化的内源性胸腺或胸腺以前植入在不同的解剖位置受组织不透明度和组织厚度超过1毫米的限制。眼睛的前腔被认为是一个 "窗口" 的有机体, 促进观察植入组织在微观层面上。

在这里, 它表明, 由我们的小组开发的模型允许从血液洪流 (视频 2) 的细胞轮回的可视化成植入胸腺 (想必祖);用于跟踪在分化和选择过程中进入胸腺种植体的 GFP 祖细胞与上皮和间质胸腺细胞 (RFP 标记) 的接触 (视频 34), 也为出口细胞 (想必是成熟的 T 细胞) 进入血管 (视频 5)。

因此, 我们所描述的方法代表了 "原则证明", 根据在72小时和一个月后植入的记录, 从三个独立的新生儿捐献者中移植的六人, 为动物模型,允许在体内实时跟踪带血管的胸腺片段中胸腺细胞在一段时间内的无创过程中的成熟, 因此, 该议定书可能需要进一步的改进。该模型可以进一步研究利用具有标记胸腺细胞分子标记的转基因动物, 例如, 作为荧光融合产品, 从而允许直接可视化 T 电池成熟中间体。该系统可以帮助解决争议和反应 incognitas 与胸腺细胞分化和选择事件等。

Figure 1
图1。供体新生胸腺裂片切片, 并移植到小鼠眼前腔内.(A) 新生儿 (左) 和一周后产后 (右) thymi 图像。在新生胸腺上的虚线代表引导, 准备移植到小鼠前眼室的部分, 以估计一个捐献者的最大移植数量。(B) 显示新植入胸腺的代表性图像。(C) 移植后带血管的胸腺2周的代表性图像。(D) 胸腺移植的荧光图像显示在 (C)。刻度条显示 (1 毫米)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。共焦图像显示胸腺片段 (红色) 植入在虹膜 (绿色) 的细节.用显微镜获得的图像, 使用以下设置: 488 和561毫微米 excitation/500 和 575 nm 发射波长, 512x512 像素分辨率和40X 浸洗目标与长的工作距离。显示刻度条 (40 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Supplementary Figure 1
补充图1。采用3D 单光子荧光激光共聚焦显微镜对胸腺移植共聚焦成像的建立.(A) Heatpad、立体定向 headholder 和防毒面具细节。(B) 建立小鼠持有胸腺移植的 LSM。请单击此处查看此图的较大版本.

Video 1
视频1。在活体成像的胸腺植入物在前室的小鼠眼.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Video 2
视频2。从血流 (GFP) 到胸腺实质 (RFP) 中推测胸腺 (TSP) 的招募.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Video 3
视频3。皮层胸腺细胞 (早期胸腺祖细胞或 ETPs) 的随机运动.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Video 4
视频4。胸腺细胞 (GFP) 与胸腺基质细胞 (RFP) 的相互作用 (cTECs) 或 mTECs (髓质胸腺上皮细胞)。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Video 5
视频5。可能的成熟 T 细胞的实时出口成像.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Supplementary Video
补充视频 1. 3D-在活体成像的胸腺植入物在小鼠眼前室.请单击此处下载此文件.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

由于 T 细胞成熟过程对个体免疫能力4的重要性以及前体细胞动力学对胸腺23所产生的成熟 T 细胞的推定影响, 已经投入了大量的努力。开发替代传统的固定组织快照方法。

虽然组织切片和其他外植体在再生组织结构上明显优于单分子膜或胸腺1415的总器官培养, 但由于缺乏与血管的连接限制了它们用于研究进入或 TSP 的步骤 (祖细胞跨血管内皮细胞屏障的易位) 和退出 (在血管内皮细胞屏障的成熟 T 淋巴细胞易位) 从器官。由于假设 T 细胞与其他细胞 (包括胸腺基质细胞) 的接触动力学, 以及它们在皮层和髓质内微环境的运动, 决定了它们的分化状态和亚群的过程。选择 (阳性和阴性)2,3,4,5, 因为这些过程可能依赖于 TSP 和成熟的 T 细胞出口事件, 一个模型, 包括与 individual´s 血流的连接系统是可取的。

胸腺和肾脏囊内植入物可使此升级17,18。然而, 它们构成了侵入性方法, 对 TPLSM 成像施加限制, 原因是植入体的深部位置或移植物上方的不透明层组织存在。小鼠前眼室的适应, 以前用作 "窗口"21,22纵向监测几个组织的性能, 作为一个网站跟踪的 T 细胞在血管内的胸腺提供了几个优势与其他移植策略相比。一方面, 手术更简单, 因为不需要缝合, 从而加快了宿主动物的恢复。另一方面, 对植入物的观察不需要额外的手术, 因为它发生在肾囊植入物, 允许重复录音从同一动物。此外, 眼睛的特定解剖特征允许很容易地调节植入组织的调控输入, 不仅系统地, 而且在本地。如前所述, 用这种方法, 物质可以局部应用于眼部或注射到前眼室。它还是一个简单的选择, 直接引入物质或细胞的胸腺 (i., 前身或成熟中间体标记的体内和过继转输转移), 历来是一个高度复杂的程序由于胸腺解剖位置24,25。此外, 前室灌注允许与荧光指示器的扩散的水的幽默或装载的移植, 如前所示的其他类型的植入物26

更忠实地允许研究胸腺生理学的方法是由荧光标记淋巴细胞标记的转基因鳉鱼的活体成像提供的。鳉在许多鳉菌株的发育过程中和整个生命期的透明度使得这个生物体在体内21的细胞动力学监测中具有优势。在鳉 (29%)18中观察到的运动性胸腺细胞数量较少, mouse´s (95%)13, 除了这两种有机体之间的动力率差异, 但建议, 冷血最小的脊椎动物与自适应免疫系统可能局限于揭示更高脊椎动物 T 细胞成熟事件的特定机械动力学。

使用小鼠眼前腔作为胸腺移植部位的一个局限性是空间限制。因此, 长期研究可能会受到损害;特别是对于生长潜力较大的新生儿或胚胎组织。从这个意义上说, 我们必须指出, 虽然新生的植入物呈现出明显的组织扩张后, 第一周后植入后的鼠标眼 (数据没有显示), 扩大似乎没有把眼睛的完整性在风险长达两个月后植入。然而, 应该有兴趣评估植入物 (眼室、肾囊或真皮) 的组织环境是否影响 implant´s 生长和/或血管化之前, 是否可以建立足够的方法来确定应用。

在角膜上需要的大切口允许胸腺片断的通过到前眼室偶尔地导致一些欺负在这个水平 (数据未显示), 最可能与某一程度的纤维化相关与愈合过程有关。需要注意的是协议的步骤 2.3.6, 以确保如果发生了恶作剧, 将会最小地干扰下游成像步骤。由于切口是在横向水平, 植入物和侮辱都不应显著影响动物视力的表现。

如果与不需要改变器官解剖完整性的其他解剖部位相比, 组织修剪使胸腺适合眼室的需要似乎是一个劣势。然而, 肾脏胶囊的方法已经表明, 胸腺的片段, 包括, 皮质和髓质获得的类似解剖指南, 如图 1所示, 变得完全功能, 因为他们可以重建 T 细胞介导的免疫在 immunodeficient thymeless 主机18。这就有利于这类胸腺片段的完整功能特征。此外, 这里描述的协议强调, 孤立的胸腺必须保持在寒冷 (步骤 1.9), 只有修剪右前种植 (步骤 2.3.2), 以减少冷缺血和组织接触, 以优化组织植入。

这种方法的另一个潜在局限在于眼睛和血浆前腔内的水中幽默的构成差异, 在解释这个解剖位置的观察时需要牢记的问题.然而, 以前的研究与其他组织, 没有报告任何明显的影响, 正常移植功能的地方眼睛环境22。虽然这里所介绍的模型的经验仅限于少数个人 (分别为6和 n = 3), 但我们没有观察到任何与植入物部位有关的重大改变, 如在胸腺种植体中的任何个人。

这里提出的协议构成了研究胸腺细胞动力学的活体纵向成像的原则, 通过将胸腺组织植入小鼠眼的前腔。由于选择免疫接受者, 该系统不允许质疑移植的系统性功能。未来的研究可能基于这种方法, 选择不同的捐赠者和/或受体和/或通过服从宿主辐射和骨髓 (BM) 移植根据特定的研究设计。例如, 作为受体的免疫缺陷 (严重结合) 小鼠的选择消除了内源性 t 细胞的干扰, 并选择了转基因小鼠捐献者 (胸腺种植体和/或 BM) 呈现 T 细胞标记, DC 标记, 胸腺基质细胞标记, 单独或组合应允许直接在体内跟踪细胞亚群。或者, 如前所述,在体内荧光 cytolabeling26, 可以追踪小鼠前眼室细胞亚群。

这里提出的模型的一个主要优点是, 它允许研究祖和成熟的 T 细胞易位和向血管。因此, 在概括内源性血管内植入前眼室后, 应确定胸腺快速获得的血管化。为支持这种可能性, 应该提到的是, 前老鼠室的新生血管似乎是由移植18,20而不是由接受者, 因此连接到虹膜血管应保持内源性胸腺皮质髓内结 (CMJ) 的完整性。

一个额外的优势来自于这样一个事实, 即系统允许评估两个独立的植入物 (两个前眼室) 在相同的个人背景 (一个单一的主机)。需要组织组合的研究也可能发现使用这个系统是有利的。

由于胸腺在自身免疫和免疫缺陷病理中起着重要作用, 这种方法可以用来解决无数潜在的问题。特别是, 该系统应该允许宏观除了器官内成像的进展胸腺。它也可能有助于研究移植耐受事件和与感染有关的免疫功能障碍。对胸腺细胞成熟的机制进行精细解剖, 将为靶向发育的 T 淋巴细胞的进一步治疗策略的设计提供新的线索。

胸腺移植到眼睛的前室需要少于45分钟, 包括新生儿胸腺隔离和修剪为每个宿主个体与植入物在任一眼。在活体成像录音需要1到 5 h, 根据被监视的特征。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了 NIH 赠款 R56DK084321 (ac)、R01DK084321 (ac)、R01DK111538 (ac)、R01DK113093 (ac) 和 R21ES025673 (ac) 以及 BEST/2015/043 赠款 (Consellería Educació、文化宫 i 电子竞技、加泰罗尼亚自治区、巴伦西亚、西班牙) (《雇佣条例》) 的支持。作者感谢派出的团队在瓦伦西亚天主教 Mártir, 瓦伦西亚, 西班牙和中心 de Investigación 圣多美和普林西比马萨, 瓦伦西亚, 西班牙的帮助下, 视频拍摄和编辑。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6, (2), 127-135 (2006).
  3. Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69, (5), 663-682 (2012).
  4. James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. (2018).
  5. Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75, (6), 951-961 (2004).
  6. Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
  7. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  8. Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
  9. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
  10. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  11. Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
  12. Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
  13. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3, (6), e160 (2005).
  14. Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
  15. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
  16. Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
  17. Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
  18. Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179, (3), 1605-1615 (2007).
  19. Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
  20. Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10, (1), 73-80 (2002).
  21. Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3, (8), 1278-1286 (2008).
  22. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14, (5), 574-578 (2008).
  23. Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99, (99), (2015).
  24. Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87, (2), 140-147 (2012).
  25. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
  26. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (31), 12863-12868 (2011).
激光扫描<em></em>显微术实时跟踪眼球前室胸腺细胞
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter