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Biology

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

Abstract

L’objectif de la méthode présentée est de montrer, pour la première fois, la greffe du nouveau-né thymi dans le compartiment antérieur de le œil de souris adultes isogéniques pour in vivo longitudinal suivi en temps réel de thymocytes´ dynamique dans un vascularisé segment du thymus. Après la transplantation, laser, microscopie (LSM) à travers la cornée permet en vivo imagerie répétés non invasive au niveau cellulaire de la résolution. Ce qui est important, l’approche ajoute au précédente maturation des lymphocytes intravitale imagerie modèles la possibilité pour le recrutement de cellules progénitrices continu et enregistrements de sortie lymphocytes matures chez le même animal. Avantages supplémentaires du système sont la transparence de la zone greffée, permettant une surveillance rapide macroscopique des tissus implantés, et l’accessibilité à l’implant permettant localisés en plus de traitements systémiques. La principale limite est le volume du tissu qui s’inscrit dans l’espace réduit de la chambre de le œil qui exige pour que la suppression du lobe. Intégrité de l’organe est maximisée en disséquant des lobes de thymus chez les patrons déjà montrés pour être fonctionnel pour la production de lymphocytes T mature. La technique est potentiellement adaptée pour interroger un milieu de médicalement des questions liées à la fonction du thymus qui incluent l’auto-immunité, l’immunodéficience et tolérance centrale ; processus qui restent mécaniquement mal définis. La dissection fine des mécanismes guidant la sélection, la différenciation et la migration des thymocytes devrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les cellules T en développement.

Introduction

Intrathymique différenciation des lymphocytes T et sélection de sous-populations de lymphocytes T constituent des processus clés pour le développement et le maintien de l’immunité à médiation cellulaire dans les vertébrés1. Ce processus implique une séquence complexe d’événements étroitement organisés y compris le recrutement des progéniteurs de circulation sanguine, la prolifération cellulaire et migration, expression différentielle des protéines membranaires et la mort cellulaire programmée massives pour des sous-ensembles sélection. Le résultat est la libération des lymphocytes T matures réactives à un ample spectre d’antigènes étrangers tout en affichant les réponses réduites aux auto-peptides, dont fin-up coloniser les organes lymphoïdes périphériques des individuels2,3. Sélection de thymocytes aberrante du répertoire αβTCR mène à une maladie auto-immune ou de déséquilibre immunitaire4 qui dérivent principalement de défauts au cours du processus de sélection positive ou négative précurseur, respectivement.

Migration directionnelle des thymocytes dans le thymus est inhérente à tous les stades de la maturation des lymphocytes T et il est envisagé comme une série de simultanée ou séquentielle des stimuli multiples, y compris les chimiokines, adhésif, et colle la matrice extracellulaire (ECM) interactions de protéine3,5. L’étude des tissus fixés a rendu les informations essentielles concernant les modes d’expression pour les piles migrateurs thymocyte microenvironnements thymique défini5,6, tandis que des études ex vivo a révélé deux répandu les comportements migratoires des thymocytes dans deux zones distinctes sur le plan histologique de l’organe : ralentir les mouvements stochastiques dans le cortex et la motilité rapide, confinée dans le bulbe rachidien7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. augmentation taux migratoires sont en corrélation avec la sélection positive du thymus13 et une sélection négative est associé au comportement rampant supporte l’hypothèse que la cinétique du voyage à travers le thymus détermine propre maturation des thymocytes. Malgré leur importance, la topologie des interactions entre les cellules stromales-thymocyte et la dynamique de la motilité des thymocytes travers microenvironnements orgue durant la maturation des lymphocytes reste mal définie.

La plupart ex vivo études réalisées à ce jour incluent foetales ou regroupement d’organe thymique cultures14,15, tranches de tissu ou des explants de lobe thymique intacte où les mouvements de thymocytes sont visualisées par deux photons laser à balayage microscopie (TPLSM)8, une technique d’imagerie intravitale restreint maximum distance de travail et d’imagerie profondeur de 1 mm selon le tissu examiné16. Par contraste avec les cultures d’organe thymique laborieux qui dépendent du temps d’incubation prolongée pour former des structures 3D-, fois, la technique de la tranche du thymus et l’introduction de permis contrôlé approche lobe thymique intact des sous-ensembles spécifiques du pré étiquetés thymocytes dans un environnement d’architecture native de tissu. Toutefois, étant donné que le débit sanguin est absent dans ces modèles, ils sont clairement limitées pour l’étude du processus de recrutement du thymus décantation progéniteurs (FST), le parenchyme du thymus ou la dynamique de l’égression thymique des lymphocytes T matures.

In vivo modèles pour l’étude de la physiologie de la maturation lymphocytes thymique chez les souris comprennent les greffons de fragments ou lobes organe entier placés soit à l’intérieur de la capsule rénale17 ou par voie intradermique18. Bien que ces options ont montré leur utilité pour interroger systémique fonctionnelle greffe des tissus, la position des greffes thymiques profonds au sein de l’animal ou recouverts par des couches de tissu opaque limite leur utilisation pour l’examen in vivo des implants par TPLSM.

La chambre antérieure de le œil offre un espace facilement accessible pour un contrôle direct de n’importe quel tissu greffé en vertu de la transparence des couches de la cornée. D’avantage, la base de la cavité formée par l’iris est riche en vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses autonomes, permettant une revascularisation rapide et la réinnervation des greffes19,20. Dr. Caicedo a utilisé avec succès cet espace anatomique pour l’entretien et l’étude longitudinale des îlots pancréatiques dans le passé21. Ici, nous montrons que cette stratégie constitue non seulement une approche valable pour étudier la dynamique des thymocytes au sein de la structure native orgue, mais également unique permet d’étendre l' in vivo des enregistrements longitudinales à l’étude du recrutement de l’ancêtre et égression de lymphocytes T mature étapes chez la souris.

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Protocol

L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et d’institutionnels animalier a approuvé toutes les expériences conformément aux lignes directrices IACUC.

1. isolement et rasage de nouveau-né barigoule

  1. Préparer tous les réactifs et les instruments par autoclavage ou d’autres méthodes, en s’assurant des conditions stériles.
  2. Pour minimiser les contaminations, effectuer toutes les interventions chirurgicales sous une hotte à flux laminaire.
  3. Avant d’euthanasier les souris donneur, remplir un récipient stérile de 60 mm avec stérile prérefroidies 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) et placez-le sur la glace. Il servira pour le rinçage et stocker la thymi excisé chez des souris de donateurs avant la transplantation.
  4. Passez à euthanasier des souris nouveau-nées donneur par décapitation, conformément aux lignes directrices éthiques.
  5. Placez votre souris sur des serviettes en papier absorbant stérile dans une dorsale en position verticale et de pulvérisation et plus tard essuyer, l’abdomen de la souris avec l’éthanol à 70 %.
  6. Exposer la cavité thoracique par une incision superficielle en forme de V au niveau du bas-ventre et couper la peau avec une paire de droite 10 cm dissection ciseaux après une médiane ventrale à laisser une ouverture d’environ 0,5 à 1 cm au niveau de la poitrine. Repliez la peau de chaque côté de la poitrine pour exposer la cavité thoracique.
  7. Faire deux profondes 0,5-1 cm incisions latérales à travers la membrane et de la cage thoracique avec le même type de ciseaux pour accéder le médiastin supérieur dans la cavité thoracique antérieure. Le thymus doit apparaître comme deux lobes pâles juste au-dessus du cœur.
  8. Place un ensemble de pince courbée sous le thymus et la traction verticale pour extraire l’organe complet. Prévenir le repli de la cage thoracique avec une paire de pinces. Si nécessaire, utilisez des pinces fines pour soigneusement déchirer le tissu conjonctif qui entoure l’organe sans perturber la capsule avant l’extraction de l’organe.
    Remarque : Cette étape est facilitée en utilisant une dissection étendue.
  9. Submerger le thymus isolé dans froid stérile 1 x PBS (pH 7,4) précédemment affichées dans un récipient stérile de 60 mm et couper l’isthme conjonctive avec un scalpel pour séparer les lobes thymiques. Enlever tous les débris de la capsule sans nuire à la capsule. Pour réduire le temps thymi affleurent, garniture lobes thym juste avant l’implant.
    Remarque : Chaque isolés thymus nouveau-né rendra généralement six segments d’environ 1 mm de large pour un maximum de trois souris hôte lors de la réception des implants dans les deux yeux.
  10. Répétez les étapes 1,4 à 1,9 pour la souris de chaque donateur. Pour réduire le temps thymi affleurent, isoler un thymus à la fois.

2. thymus Implantation dans la chambre antérieure de l’oeil

  1. Avant la transplantation, tag et peser chaque souris destinataire.
  2. Utilisez une dose entre 1 et 2 % des vapeurs d’isofluorane à anesthésier la souris destinataire. Assurer la bonne anesthetization par l’absence de réflexe pincée d’orteil suivantes avant de commencer l’intervention chirurgicale.
  3. Procéder à la greffe de thymus segments comme suit :
    1. Placez votre souris dans une position couchée latérale côté afin qu’un oeil vers le haut directement exposés à l’objectif de l’étendue de la dissection.
    2. L’accise un des lobes thymiques isolées se trouvant dans du PBS 1 x contre le rhume (pH 7,4)-rempli plat 60 mm en morceaux jusqu'à 1 mm de largeur pour l’implant. Suivent un modèle zigzag pour s’assurer que chaque segment contienne la médulla et le cortex thymique. Utiliser des ciseaux de vannas pour tailler selon les directives fournies dans la Figure 1 a.
      NOTE : Parage du thymus devrait être fait juste avant l’implant afin d’optimiser la prise de greffe de tissus.
    3. À partir de la base de la cornée correspondant à la zone chirurgicale, introduire la pointe d’une aiguille de 40 mm G18 pour faire une petite incision dans les couches de la cornée externe pour que la pointe de ciseaux dissection peut être introduite.
    4. Faire un 5-10 mm incision directement autour de la base de la cornée à l’aide de ciseaux de vannas tout en maintenant l’ouverture de la cornée fermement prévient-on rescellement de flanc. Utiliser des pinces avec extrémités plates afin d’éviter des lésions tissulaires.
    5. Saisir la coupe de l’épithélium cornéen et exposer l’ouverture par la tenue de la cornée avec une paire de pinces à plat tout en poussant un segment thymique par l’ouverture. Mouillez le œil avec stérile 1 x PBS (pH 7,4) ou des larmes artificielles au besoin pour empêcher la dessiccation des tissus jusqu'à ce que la manipulation est terminée.
    6. Appuyez doucement sur la surface de le œil pour glisser le segment tissu introduites à une position latérale par rapport à l’élève pour préserver la fonction eye´s. Veiller à ce que la greffe se trouve à un emplacement en face de l’oeil ouverture pour éviter les interférences postérieur avec l’imagerie de bizutage.
    7. À l’aide d’une pince plate, appuyez fermement, pour environ 3-5 s, les deux côtés de l’ouverture de cornée uns contre les autres pour promouvoir auto-obturant. La chirurgie ne nécessite pas d’agrafage ou couture.
  4. Si les greffes sont effectuées sur les deux yeux, tourner la souris sur le côté latéral opposé directement exposer le deuxième œil à l’objectif de microscope dissection et répéter les étapes 2.3.2-2.3.7.
  5. Une fois l’opération terminée, retourner la souris à une cage vide préchauffée avec une lampe chauffante.
  6. Assurez-vous que chaque souris transplantées retrouve une mobilité complète et conscience avant de le placer dans une cage, partagée avec d’autres animaux. Ceci a généralement lieu à 1 h après la chirurgie.
  7. Lors de la transplantation, traiter les souris avec des analgésiques, selon les besoins et fournir les souris avec de l’acétaminophène à une concentration de 1,6 mg/mL dans l’eau potable.
  8. Répétez les étapes 2,2 à 2,9 pour la souris de chaque destinataire.
  9. Suivi post-opératoire activité animale ainsi que l’apparence des yeux implantés pour détecter les complications potentielles de santé.

3. confocal imagerie de barigoule implantés à l’aide de 3D unique Photon Fluorescence microscopie confocale

  1. Anesthésier la souris destinataire en utilisant une dose entre 1 et 2 % des vapeurs isofluorane. Assurer le bonne anesthetization par l’absence de réflexe pincée d’orteil suivantes avant de commencer la procédure d’imagerie
  2. Placez votre souris sur une plate-forme de microscope de scène fixe en position couchée latérale côté afin qu’un oeil vers le haut. Une bouillote est placé sur la plate-forme de microscope pour température corporelle constante des souris lors des enregistrements.
    Remarque : Voir figure1 supplémentaire pour plus de détails.
  3. Insérer la tête de la souris dans un headholder stéréotaxique et réglez le bouton pour retenir la tête de la souris sur une position latérale permettant un accès direct de l’objectif de microscope à l’oeil, tenant la greffe de thymus.
  4. Placez le museau de la souris dans un masque à gaz pour garder l’animal anesthésié tout au long de la procédure. Cela permet l’ajustement des vapeurs d’isofluorane selon les besoins.
  5. Afin de faciliter la stabilisation de l’oeil pendant les enregistrements tout en évitant la rétraction des paupières, tirez les paupières tout en maintenant le œil à la marge de la cornée avec une paire de pincettes qui ont leur extrémité couverte par un tube de polyéthylène qui sont attachés à un UST-2 cardan solide. Cette disposition permet une fixation stable de la tête et les yeux et offre une souplesse sans interruption de la circulation sanguine dans les yeux, comme précédemment décrit22.
    NOTE : Les chiffres supplémentaires 1 b, C montrent l’ensemble complet.
  6. Ajouter quelques gouttes des larmes artificielles ou de solution salines stériles comme le liquide d’immersion entre la cornée et la lentille, avant de placer l’objectif de microscope sur l’oeil de la souris.
    Remarque : autres pentes sont dispensés sur nécessité tout au long de la procédure pour garder le chemin de microscope et éviter le dessèchement des yeux.
  7. Utilisez d’abord la lentille de faible grossissement (X 5) pour localiser le thymus dans le champ du microscope. Basculez ensuite sur l’immersion en eau supérieure résolution (10, 20 et 40 X) trempage des objectifs à longue distance de travail. Éviter le photovieillissement de la LSM et le blanchiment de l’implant thymique en appliquant la puissance du laser minime et réduire le temps de balayage autant que possible. Ceci est réalisé à l’aide de l’analyseur de résonance du microscope.
    Remarque : La microscopie confocale, que nous utilisons est équipée de miroirs de balayage résonants capables de recueillir des images à 25 images/s. D’autres marques ont leurs propre microscopes avec les scanners de résonance.
  8. Sélectionnez le mode d’acquisition en utilisant le logiciel de microscope et démarrez le mode scanner résonance. Puis choisissez le mode d’imagerie XYZT et configurer les paramètres d’acquisition comme suit :
    1. Le laser à Argon et régler la puissance à 30 % pour l’excitation de fluorescence.
    2. Choisissez une excitation laser ligne et définir le contrôle splitter (AOBS) de faisceau acousto-optique pour les longueurs d’onde d’émission différents. En outre, afin de détecter la rétrodiffusion et définissent la structure des tissus, utiliser la détection de réflexion en même temps.
      Remarque : Lorsque vous sélectionnez un jeu de couleurs pour l’excitation (GFP et DP), le AOBS est automatiquement programmé pour diriger ces lignes d’excitation sur l’échantillon et de transmettre les émissions entre eux. Par exemple, pour GFP et DP, nous utilisons des bandes étroites de réflexion pour la lumière d’excitation environ 488 nm et 561 nm, respectivement. Cela laisse de larges bandes pour la collecte des photons de fluorescence émise, réduisant ainsi le besoin pour laser de puissance et l’acquisition de temps. En mode de réflexion, le AOBS est utilisé comme un séparateur de faisceau 50/50 à l’image de la lumière réfléchie dans toute longueur d’onde de ceux utilisés pour la détection par fluorescence d’émission.
    3. Recueillir l’émission à longueur d’onde sélectionnée, puis sélectionnez une résolution de 512 × 512 pixels et commencer direct imaging en appuyant sur le bouton Live , en ajustant les niveaux de gain au besoin (gain typique est environ 600 V).
    4. Définir le début et la fin de la z-pile en mettant l’accent sur le haut de l’implant thymique et sélectionnez commencer, puis passer au dernier plan peut se concentrer dans le thymus implanté et sélectionnez fin. Utilisez une taille de z-étape de 5 µm. Le logiciel calculera automatiquement le nombre d’avions confocale.
    5. Choisir l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile-z (en général, 1,5 à 2 secondes) et sélectionnez l’option d’acquérir jusqu'à l’arrêt pour imagerie continu.
  9. Appuyez sur la touche Start pour initialiser.
  10. Image à plusieurs reprises les greffons dans le temps le même animal en répétant les étapes 3.1 à 3.9.
    Remarque : Si l’animal possède des greffes sur les deux yeux, enregistrements de chaque œil peuvent être prises en répétant les étapes 3.2 à 3.9 après le passage du côté de la position verticale de la tête de la souris.

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Representative Results

Thymus des souris nouveau-nées ont été isolés de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas souris comme décrit dans le présent protocole (étapes 1.1 à 1.9). Chez ces souris transgéniques, le promoteur de l’actine beta poulet dirige l’expression de la variante de la protéine fluorescente rouge DsRed. MST sous l’influence de l’enrichisseur début immédiat de cytomégalovirus (CMV) facilitant le suivi des implants.

Pour prévenir le rejet de tissus, isogéniques particuliers avec le génotype : C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J ont été choisis en tant qu’hôtes. Chez ces souris transgéniques, le promoteur d’ubiquitine humaine C dirige l’expression d’une protéine fluorescente verte (GFP) dans tous les tissus, permettant une différenciation claire entre le tissu receveur et donneur. L’action du promoteur humain ubiquitine C conduit à différentiels profils d’expression de GFP dans certains types de cellules hématopoïétiques. En particulier, les lymphocytes T présentent une expression de GFP 2 fois plus élevée des niveaux que CD19+B220+ B les cellules ou les autres cellules du sang périphérique qui peut faciliter leur identification par des techniques quantitatives sensibles tels que cytométrie en flux, sans aucune besoins d’étiquetage supplémentaires. En outre, expression fluorescente chez ces souris est observée chez les animaux adultes, ainsi qu’à tous les stades embryonnaires et elle est homogène au sein d’une lignée de type cellule octroi stabilité de marqueur.

Le modèle pour que la suppression du thymus, illustré à la Figure 1 a suit les descriptions antérieures de fragments de thymus fonctionnel implantés dans le rein capsula23. Cette procédure de coupe permet une réduction du volume total du tissu pour être implantés tout en préservant les unités fonctionnelles de base histologiques de l’organe (cortex, bulbe rachidien et la jonction cortico-médullaire (CMJ) des vaisseaux sanguins). La différence notable dans la taille entre nouveau-né thymus (Figure 1 a, à gauche) et le thymus des souris âgés d’un semaine (Figure 1 a, droite) devrait être tenue compte pour dégrossir, comme les implants de l’espace disponible pour s’adapter dans la chambre antérieure de la souris œil est restreinte. Les résultats présentés ici incluent les implants provenant uniquement des nouveaux-nés. Figure 1 b montre une image macroscopique d’un segment du thymus, implanté dans la chambre antérieure d’un œil de souris GFP, logé pour préserver la vision animale. Détails histologiques de l’implant en référence à la cornée (tissus GFP adjacents à implant DP) peuvent être observés dans la reconstruction 3D des images confocales dans supplémentaire vidéo 1. La greffe à l’iris apparaît en vidéo 1 et 2.

Figure 1 et 1D respectivement illustrent champ lumineux et images de fluorescence d’une même zone pouvant servir pour une double-macroscopique suivent de la croissance des tissus et involution dans les études de continuation. La figure 1 illustre également la vascularisation des tissus implantés qui devraient permettre de façon unique pour l’étude de la physiologie du thymus dépendent de l’apport sanguin orgue dans le temps.

La vascularisation des fragments insérés thymiques a eu lieu au sein de l’implant après 72h. Le processus de vascularisation rapide est en bon accord avec la grande quantité de vaisseaux sanguins dans l’iris et la richesse du thymus dans la production de cytokines. Ces caractéristiques permettent une greffe rapide de barigoule inséré. La vascularisation des implants est illustrée en vidéo 2, montrant la greffe de thymus de vaisseaux sanguins avec l’iris´ de l’hôte individuel (tissu GFP adjacent à l’implant de DP), par conséquent, confirmant que le modèle présenté ici, permet en effet, pour non invasive continue informationnelle du thymus vascularisé à l’échelle microscopique. L’utilisation de LSM pour visualiser le thymus endogène ou thymus déjà implantés dans différents lieux anatomique est limitée par l’opacité des tissus et l’épaisseur de tissu de plus de 1 mm. La chambre antérieure de l’oeil est considérée comme une « fenêtre » à l’organisme facilitant l’observation des tissus implantés au niveau microscopique.

Ici, il est démontré que le modèle mis au point par notre groupe permet la visualisation de la transmigration des cellules avec le torrent de sang (Video 2) dans le thymus implanté (vraisemblablement des progéniteurs) ; pour le suivi des contacts des cellules progénitrices GFP entrants dans l’implant thymique avec résident thymique épithéliale et stromale cellules (DP-étiqueté) au cours du processus de différenciation et de la sélection (vidéos 3 et 4) et, également, pour l’évacuation des cellules (lymphocytes T matures sans doute) dans les vaisseaux sanguins (vidéo 5).

L’approche que nous décrivons donc représente la «preuve de principe», basées sur des enregistrements pris entre 72 heures et un mois après l’implantation de six individus transplantés avec les segments de trois donateurs nouveau-né indépendants, pour un animal modèle qui permet en vivo suivi en temps réel de la maturation des thymocytes dans un fragment du thymus vascularisé par invasifs dans le temps, et à ce titre, le protocole pourrait être nécessaire d’autres raffinements. Ce modèle pourrait être autrement travaillé sur l’utilisation d’animaux transgéniques hébergeant des thymocytes étiquetées de marqueurs moléculaires, par exemple, fluorescents comme produits de fusion, ce qui permet une visualisation directe des intermédiaires de maturation des lymphocytes T. Le système peut aider à résoudre les controverses et répondre incognitas liée à la sélection et la différenciation des thymocytes événements parmi d’autres.

Figure 1
Figure 1. Sectionnement des lobes thymiques nouveau-né de donateurs et de la greffe dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. (A) nouveau-né (à gauche) et les images de barigoule (à droite) après l’accouchement une semaine. Lignes de tableau de bord sur thymus nouveau-nés représentent des guides pour préparer des articles destinés à la transplantation dans la chambre antérieure de le œil des souris pour estimer le nombre maximal de greffes provenant d’un donneur. (B) représentant l’image nouvellement implanté du thymus. (C) image représentative des greffés, vascularisé thymus 2 semaines après l’implantation. (D) image de Fluorescence de la greffe de thymus montré sur (C). Barre d’échelle est montré (1 mm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Confocal image montrant le détail de la prise de greffe du thymus segment (rouge) dans l’iris (vert). Image obtenue au microscope, en utilisant les paramètres suivants : 488 et 561 nm excitation/500 et longueurs d’onde de 575 nm d’émission, 512 x 512 pixels et 40 X objectif à longue distance de travail de trempage. Barre d’échelle est montré (40 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplementary Figure 1
Supplémentaire Figure 1. Le programme d’installation pour l’imagerie confocale de greffe du thymus par fluorescence monophotonique 3D laser microscopie confocale. (A) Heatpad, headholder stéréotaxique et détails de masque à gaz. (B) mettre en place de la souris en maintenant la greffe de thymus pendant LSM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Video 1
Vidéo 1. Les implants de l’imagerie in vivo du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 2
Vidéo 2. Recrutement du thymus présumable décantation progéniteurs (c. à thé) de la circulation sanguine (GFP) dans le parenchyme thymique (DP). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 3
Vidéo de 3. Stochastique mouvement des thymocytes (progéniteurs thymiques précoces ou ETP) dans le cortex. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 4
Vidéo de 4. Interaction des thymocytes (GFP) avec les cellules du stroma thymiques (DP) Trainers (cellules épithéliales corticales thymiques) ou mTECs (cellules épithéliales thymiques médullaires). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 5
Vidéo de 5. Imagerie en temps reel évacuation des lymphocytes T matures potentiels. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Supplementary Video
Supplémentaire vidéo 1. implants de 3Din vivo d’imagerie du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

En raison de l’importance du processus de maturation des lymphocytes pour chaque compétence immunitaire4 et de l’impact présumé de dynamique cellule précurseur sur les T-cellules matures produites par le thymus2,3, des efforts considérables ont été investis pour développer des solutions de rechange à l’approche ponctuelle classique tissu fixe.

Bien que les tranches de tissus et autres explants sont clairement supérieurs en reproduisant l’architecture tissulaire que monocouches ou organe thymique globale cultures14,15, l’absence d’une connexion à la vascularisation limite leur utilisation afin d’étudier la étapes d’entrée ou de c. à thé (translocation des progéniteurs pare-les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins) et de sortie (translocation des lymphocytes T matures pare-les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins) de l’orgue. Comme on fait l’hypothèse que la dynamique des lymphocytes entre en contact avec d’autres cellules, y compris les cellules du stroma thymiques et leur motilité travers micro-environnements dans le cortex et la médulla déterminer leur statut de différenciation et le processus de sous-population sélection (positifs et négatifs)2,3,4,5, et étant donné que ces processus peuvent dépendre de TSP et événements de sortie lymphocytes matures, un modèle qui inclut la connexion à l’individual´s la circulation sanguine système serait souhaitable.

Les implants capsules intradermique et rein du thymus permettent cette mise à jour17,18. Cependant, elles constituent des méthodes invasives ayant des limitations imposées à l’imagerie par TPLSM en raison de la position profonde de l’implant dans le corps ou la présence de couches opaques de tissu au-dessus de la greffe. L’adaptation de la chambre de souris antérieur de le œil, précédemment utilisée comme une « fenêtre »21,22 , longitudinalement suivre les performances de plusieurs tissus, tel qu’un site pour suivre les lymphocytes T dans un thymus vascularisé présente plusieurs avantages par rapport à d’autres stratégies de transplantation. D’un côté, la chirurgie est plus simple car sans sutures sont nécessaires, conduisant à une récupération plus rapide des animaux de l’hôte. De l’autre côté, l’observation d’implants ne nécessite une chirurgie additionnelle comme il arrive pour les implants capsule rénale, permettant les enregistrements répétés de l’animal même. En outre, les particularités anatomiques de le œil permettent de moduler facilement réglementaires entrées sur les tissus implantés non seulement systémique mais aussi localement. Comme précédemment décrit, avec cette approche, les substances peuvent être appliqués sur le œil par voie topique ou injectés dans la chambre antérieure de le œil. Elle représente aussi une option facile d’introduire des substances ou cellules directement dans le thymus (i.e., maturation intermédiaires ou cellules souches étiquetées ex vivo et Moutschen transféré), qui a traditionnellement été une procédure très complexe en raison de l’emplacement anatomique du thymus24,25. En outre, la perfusion de la chambre antérieure permet l’échange de l’humeur aqueuse ou chargement du greffon par diffusion avec indicateurs fluorescents, comme précédemment indiqué pour d’autres type d’implants26.

L’approche qui permet plus fidèlement l’étude de la physiologie du thymus est fourni par l’imagerie intravitale des poissons médakas transgéniques exprimant des marqueurs lymphocytaires fluorescent étiquetés. La transparence des médakas au cours du développement et tout au long de la vie de nombreuses souches de medaka rend cet organisme avantageux pour le suivi dynamique cellulaire in vivo21. Le faible nombre de thymocytes motiles observée dans medaka (29 %),18 , en référence à mouse´s (95 %)13, en plus de différences dans les taux de mobilité entre ces deux organismes, cependant, suggère que le froid du sang des vertébrés plus petit avec un système immunitaire adaptatif peut se limiter à révéler particulier cinétique mécaniste de supérieurs événements de maturation des lymphocytes vertébrés.

Une limitation de l’utilisation de la chambre antérieure de l’oeil de la souris comme le site de greffe de thymus est la restriction de l’espace. Études à long terme pourraient être, par conséquent, compromis ; en particulier pour les nouveau-nés ou embryonnaires des tissus avec un potentiel de croissance élargi. En ce sens, il faut dire que bien que les implants nouveau-né présentés avec expansion tissulaire apparent après la première semaine après l’implantation dans l’oeil de la souris (données non présentées), l’élargissement ne semblent pas en péril l’intégrité de le œil jusqu'à deux mois après l’implant. Néanmoins, il devrait être d’intérêt pour évaluer si l’environnement tissulaire de l’implant (oeil chambre, capsule rénale ou du derme) influe sur la croissance implant´s et/ou vascularisation avant la pertinence de l’approche peut être établie pour définir applications.

La grande incision nécessaire sur la cornée pour permettre que le passage du fragment du thymus, de la chambre antérieure de le œil conduit parfois à certains bizutage à ce niveau (données non présentées), probablement associés à certain degré de fibrose associée à la cicatrisation. L’attention est exigée sur l’étape 2.3.6 du protocole pour s’assurer qu’en cas de bizutage minimalement interférera avec les étapes d’imagerie en aval. Comme l’incision est faite au niveau latéral, l’implant ni le bizutage devrait considérablement affecter les performances de vue animaux.

La nécessité d’une coupe de tissu faire le thymus s’insérer dans la chambre de le œil semble être un inconvénient si on les compare à d’autres sites anatomiques ne nécessitant pas de modifier l’intégrité anatomique de l’organe. Néanmoins, l’approche de capsule rénale a montré que les fragments du thymus contenant, à la fois, le cortex et la médulla obtenus par les lignes directrices de la dissection semblables à celles indiquées dans la Figure 1, devenu entièrement fonctionnel comme ils peuvent reconstituer des lymphocytes T immunité à médiation immunodéficientes hôtes thymeless18. Cela milite en faveur de traits fonctionnels intacts de ce type de segments du thymus. Aussi, le protocole décrit ici souligne que le thymus isolé doivent être conservé dans le froid (étape 1.9) et seulement coupé juste avant l’implant (étape 2.3.2) pour minimiser l’exposition de tissus et ischémie froide vers l’optimisation de greffe de tissus.

Une autre limite potentielle de l’approche réside dans les différences de composition entre l’humeur aqueuse dans la chambre antérieure de l’oeil et le plasma sanguin, la question qu’il faut garder à l’esprit lors de l’interprétation des observations faites à cet endroit anatomique . Des études antérieures avec les autres tissus, cependant, n’ont déclaré aucun effet évident sur la fonction du greffon normal par le œil local environnement22. Bien que l’expérience avec le modèle présenté ici est limitée à une poignée d’individus (N = 6 et N = 3 pour les bénéficiaires et les donateurs, respectivement) à l’heure actuelle, nous n’avons pas observé les modifications majeures associées pour implanter le site dans le cas d’implants thymiques dans aucun de la individus ou l’autre.

Le protocole présenté ici constitue une validation de principe pour l’étude d’intravitale imagerie longitudinale de la dynamique des thymocytes par implantation tissulaire du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. En raison de la sélection des récipiendaires immunocompétents, le système ne permettait pas de questionner la fonction systémique de la prothèse. Futures études peuvent s’appuyer sur cette approche en choisissant différents donateurs et/ou destinataires et/ou en soumettant les hôtes d’irradiation et de la transplantation de moelle osseuse (BM) selon les plans d’étude particulière. Par exemple, le choix de souris SCID (immunodéficience combinée sévère) comme bénéficiaires élimine les interférences des lymphocytes T endogènes, et le choix des donateurs de souris transgéniques (implant thymique et/ou BM) présentant des marqueurs de cellules T, marqueurs de DC, thymiques stromales marqueurs de cellules, etc.., individuellement ou en combinaison devrait permettre directement en vivo suivi des sous-populations cellulaires. Par ailleurs, sous-populations de cellules dans la chambre antérieur de le œil des souris pouvaient être suivies, comme décrit plus haut, par en vivo fluorescence cytolabeling26.

Un avantage majeur du modèle présenté ici est qu’il permet d’étudier les progéniteurs et translocation de lymphocytes T mature d’et vers les vaisseaux sanguins. Ainsi, il devrait être pertinente déterminer si la vascularisation rapidement acquise du thymus après être implanté dans la chambre antérieure de le œil récapitule la vascularisation endogène. En faveur de cette possibilité, il convient de mentionner que la néovascularisation dans la chambre antérieure souris semble être dictée par le greffon18,20 , plutôt que par le bénéficiaire et, par conséquent, les connexions à la vascularisation de l’iris doit préserver l’intégrité du domaine de jonction cortico-médullaire (CMJ) thymus endogène.

Un autre avantage vient du fait que le système permet l’évaluation de deux implants indépendants (deux chambres antérieur de le œil) sur des antécédents différents identiques (un seul hôte). Les études nécessitant des combinaisons de tissus peuvent également trouver avantageux d’utiliser ce système.

Comme le thymus joue un rôle important dans les pathologies auto-immunes et immunitaires déficients, cette approche pourrait être utilisée pour traiter une multitude de questions potentielles. En particulier, le système devrait permettre macroscopique en plus de l’imagerie intra-orgue pour la progression de l’involution du thymus. Il peut aussi servir à étudier les événements de la tolérance de transplantation et de dysfonctionnements immunitaires liés aux infections. Il est probable que la dissection fine des mécanismes qui régissent la maturation des thymocytes fournira de nouvelles pistes pour la conception d’autres stratégies thérapeutiques ciblant les cellules T en développement.

Transplantation du thymus de la chambre antérieure de le œil a moins de 45 min, notamment l’isolement du thymus néonatale et tailler pour chaque hôte individuel avec des implants dans chaque oeil. In vivo d’imagerie enregistrements nécessitent 1 à 5 h, selon les caractéristiques surveillés.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) et R21ES025673 (AC) et par l’octroi de meilleurs/2015/043 (Consellería de Educació, cultura j’ai esport, Generalitat valenciana, Valencia, Espagne) (EO). Auteurs tiennent à remercier l’équipe envoyés à l’Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valence, en Espagne et Alberto Hernandez au Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valence, Espagne, pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

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Real Time <em>In Vivo</em> suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser
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Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

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