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Biology

लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा आंख के पूर्वकाल चैंबर में Vivo ट्रैकिंग Thymocytes में वास्तविक समय

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

प्रोटोकॉल के लक्ष्य को दिखाने के लिए अनुदैर्ध्य intravital वास्तविक समय लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा thymocytes की ट्रैकिंग thymic प्रत्यारोपण में माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में है । भ्रष्टाचार के कॉर्निया और vascularization की पारदर्शिता लगातार रिकॉर्डिंग जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

प्रस्तुत किया जा रहा है विधि का उद्देश्य, पहली बार के लिए, vivo अनुदैर्ध्य में thymocytes ´ गतिशीलता के एक संवहनी के भीतर वास्तविक समय की निगरानी के लिए isogenic वयस्क चूहों के पूर्वकाल नेत्र कक्ष में नवजात thymi का प्रत्यारोपण थाइमस सेगमेंट. रोपाई के बाद, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (LSM) कॉर्निया के माध्यम से vivo में सेलुलर संकल्प स्तर पर इनवेसिव दोहराया इमेजिंग की अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, दृष्टिकोण पिछले intravital टी सेल परिपक्वता इमेजिंग मॉडल के लिए एक ही जानवर में सतत जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास रिकॉर्डिंग के लिए संभावना कहते हैं । प्रणाली के अतिरिक्त लाभ भ्रष्टाचारी क्षेत्र की पारदर्शिता, प्रत्यारोपित ऊतक के macroscopic तेजी से निगरानी की अनुमति, और प्रणालीगत उपचार के अलावा स्थानीयकृत के लिए अनुमति प्रत्यारोपण के लिए पहुंच रहे हैं । मुख्य सीमा ऊतक की मात्रा जा रहा है कि आंख चैंबर के कम जगह में फिट बैठता है जो पालि trimming के लिए मांग करता है । अंग अखंडता पहले परिपक्व टी सेल उत्पादन के लिए कार्यात्मक हो दिखाया पैटर्न में विदारक थाइमस पालियों द्वारा अधिकतम है । तकनीक संभावित रूप से प्रतिरक्षा, इम्यूनो और केंद्रीय सहिष्णुता शामिल है कि थाइमस समारोह से संबंधित चिकित्सकीय प्रासंगिक सवालों के एक वातावरण पूछताछ करने के लिए अनुकूल है; प्रक्रियाओं जो mechanistically खराब परिभाषित रहते हैं । तंत्र के ठीक विच्छेदन thymocyte प्रवास मार्गदर्शक, भेदभाव और चयन उपंयास चिकित्सीय टी कोशिकाओं के विकास को लक्षित रणनीतियों को बढ़ावा देना चाहिए ।

Introduction

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Intrathymic टी-सेल विभेद और टी सेल उप जनसंख्या चयन रीढ़1में कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा के विकास और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का गठन । इस प्रक्रिया में खून से progenitors की भर्ती, सेल प्रसार और प्रवास, झिल्ली प्रोटीन की विभेदक अभिव्यक्ति, और सबसेट के लिए बड़े पैमाने पर क्रमादेशित सेल मौत सहित कसकर संगठित घटनाओं के एक जटिल अनुक्रम शामिल चयन. परिणाम परिपक्व टी की रिहाई के लिए विदेशी प्रतिजनों के एक पर्याप्त स्पेक्ट्रम के लिए प्रतिक्रियाशील है जबकि स्वयं पेप्टाइड्स, जो अंत तक व्यक्तिगत2,3के परिधीय लसीकावत् अंगों बस्तियां के लिए कम प्रतिक्रियाओं प्रदर्शित । αβTCR प्रदर्शनों की ंयायपालिका thymocyte चयन स्व-प्रतिरक्षित रोग या प्रतिरक्षा असंतुलन4 कि मुख्य रूप से नकारात्मक या सकारात्मक प्रणेता चयन की प्रक्रिया के दौरान दोषों से प्राप्त करने के लिए सुराग, क्रमशः ।

थाइमस भर thymocytes के दिशात्मक प्रवास टी के सभी चरणों के लिए आंतरिक है-सेल परिपक्वता और यह एक साथ की एक श्रृंखला के रूप में परिकल्पना की है, या अनुक्रमिक एकाधिक उत्तेजनाओं, सहित chemokines, चिपकने वाला, और de-चिपकने वाला extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन इंटरैक्शन3,5. फिक्स्ड ऊतकों के अध्ययन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की गई है thymocyte प्रवासी cues के लिए अभिव्यक्ति के पैटर्न के बारे में परिभाषित thymic microenvironments5,6, जबकि पूर्व vivo अध्ययन दो प्रचलित पता चला है दो histologically में thymocytes के प्रवासी व्यवहार अंग के विशिष्ट क्षेत्रों: प्रांतस्था और तेज, गतिशीलता7,8,9,10 में सिमटा मज्जा में धीमी गति से stochastic आंदोलनों , 11 , 12 , 13. बढ़ी हुई प्रवासी दरों thymic सकारात्मक चयन के साथ सहसंबंधी13 और नकारात्मक चयन की परिकल्पना का समर्थन रेंगने व्यवहार के साथ जुड़ा हुआ है कि थाइमस के माध्यम से यात्रा के कैनेटीक्स उचित निर्धारित करता है thymocytes की परिपक्वता । उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, thymocyte के टोपोलॉजी-stromal सेल बातचीत और अंग microenvironments भर में thymocyte गतिशीलता की गतिशीलता टी सेल के दौरान परिपक्वता बीमार परिभाषित रहते हैं ।

सबसे पूर्व vivo अध्ययन तिथि करने के लिए प्रदर्शन किया भ्रूण या समग्र thymic अंग संस्कृतियों14,15, ऊतक स्लाइस या बरकरार thymic पालि explants जहां thymocyte आंदोलनों दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग द्वारा कल्पना कर रहे है शामिल माइक्रोस्कोप (TPLSM)8, एक प्रतिबंधित अधिकतम काम की दूरी और इमेजिंग गहराई के साथ एक intravital इमेजिंग तकनीक के अनुसार 1 मिमी के ऊतकों की जांच की16. श्रमसाध्य thymic अंग संस्कृतियों जो विस्तारित मशीन समय पर निर्भर करने के लिए 3 डी संरचनाओं, दोनों के विपरीत, thymic टुकड़ा तकनीक और बरकरार thymic पालि दृष्टिकोण पूर्व के विशेष सबसेट का परिचय नियंत्रित अनुमति लेबल एक देशी ऊतक वास्तुकला वातावरण में thymocytes । हालांकि, के बाद से रक्त प्रवाह इन मॉडलों में अनुपस्थित है, वे स्पष्ट रूप से थाइमस पैरेन्काइमा या परिपक्व टी कोशिकाओं के thymic egression की गतिशीलता के लिए थाइमस बसने progenitors (TSPs) की भर्ती प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं ।

thymic टी सेल के अध्ययन के लिए वीवो मॉडल में चूहों में परिपक्वता फिजियोलॉजी के टुकड़े या पूरे अंग या तो गुर्दे कैप्सूल के अंदर रखा पालियों17 या intradermally18के भ्रष्टाचार शामिल हैं । हालांकि इन विकल्पों के ऊतकों के प्रणालीगत कार्यात्मक engraftment पूछताछ करने के लिए अपनी उपयोगिता से पता चला, thymic की स्थिति में गहरे जानवर या अपारदर्शी ऊतक की परतों द्वारा कवर के लिए उनके उपयोग को प्रतिबंधित करने के लिए vivo में प्रत्यारोपण के परीक्षा TPLSM ।

आंख के पूर्वकाल कक्ष corneal परतों की पारदर्शिता के आधार पर किसी भी भ्रष्टाचारी ऊतक के प्रत्यक्ष निगरानी के लिए एक आसानी से सुलभ जगह प्रदान करता है । लाभ के, आईरिस द्वारा गठित चैंबर के आधार रक्त वाहिकाओं और स्वायत्त तंत्रिका अंत में समृद्ध है, तेजी से revascularization और भ्रष्टाचारियों के reinnervation को सक्षम करने के19,20। डॉ Caicedo सफलतापूर्वक पिछले21में अग्नाशय के टाप के रखरखाव और अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इस संरचनात्मक अंतरिक्ष का इस्तेमाल किया है । यहां, हम बताते है कि इस रणनीति न केवल मूल अंग संरचना के भीतर thymocytes ' गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण का गठन किया है, लेकिन यह भी अद्वितीय परमिट जनक भर्ती के अध्ययन के लिए vivo अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग में विस्तार करने के लिए और परिपक्व टी सेल egression माउस में कदम ।

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Protocol

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विश्वविद्यालय मियामी के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी ।

1. अलगाव और नवजात Thymi की छंटनी

  1. autoclaving या अन्य तरीकों से, बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के द्वारा सभी एजेंट और उपकरणों को तैयार करें ।
  2. संदूषण को कम करने के लिए, एक लामिना प्रवाह हुड के तहत सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन ।
  3. euthanizing दाता चूहों से पहले, बाँझ ठंडा 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब, पीएच ७.४) और यह बर्फ पर जगह के साथ एक ६० mm बाँझ पकवान भरें । यह प्रत्यारोपण करने से पहले दाता चूहों से आबकारी thymi को धोने और भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  4. नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार decapitation द्वारा नवजात दाता चूहों को euthanize के लिए आगे बढ़ें ।
  5. एक पृष्ठीय ईमानदार स्थिति और स्प्रे में बाँझ शोषक कागज तौलिए पर माउस प्लेस, और बाद में पोंछ, ७०% इथेनॉल के साथ माउस पेट ।
  6. निचले पेट के स्तर पर एक सतही वी के आकार का चीरा बनाने के द्वारा वक्ष गुहा बेनकाब और छाती के स्तर पर लगभग 0.5-1 सेमी की एक खोलने छोड़ने के लिए एक ventral midline के बाद सीधे 10 सेमी विदारक कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा में कटौती । छाती के प्रत्येक पक्ष से अधिक त्वचा गुना वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए ।
  7. पूर्वकाल वक्ष गुहा में बेहतर मध्यावकाश का उपयोग करने के लिए एक ही प्रकार के कैंची के साथ डायाफ्राम और ribcage के माध्यम से दो गहरे 0.5-1 सेमी पार्श्व चीरा बनाओ । थाइमस दिल के ठीक ऊपर दो पीली पालियों के रूप में प्रकट होना चाहिए ।
  8. थाइमस के नीचे घुमावदार संदंश का एक सेट रखें और पूरा अंग निकालने के लिए लंबवत खींचो । संदंश की एक जोड़ी के साथ ribcage के foldback को रोकें । यदि आवश्यक हो, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए ध्यान से अंग निकालने से पहले कैप्सूल बाधित बिना अंग आसपास के संयोजी ऊतक आंसू ।
    नोट: यह चरण एक विदारक गुंजाइश का उपयोग करके सुविधा है ।
  9. ठंडा बाँझ 1x पंजाब (पीएच ७.४) में अलग थाइमस जलमग्न पहले एक ६० मिमी बाँझ पकवान में प्रदर्शित, और thymic पालियों अलग करने के लिए एक स्केलपेल के साथ संयोजी स्थलडमरूमध्य में कटौती. कैप्सूल को नुकसान पहुंचाए बिना डिश से कोई भी मलबा निकालें । समय thymi को कम करने के लिए उजागर कर रहे हैं, ठीक प्रत्यारोपण से पहले अजवायन के संभागों ट्रिम ।
    नोट: प्रत्येक पृथक नवजात थाइमस आम तौर पर दोनों आंखों में प्रत्यारोपण प्राप्त जब तीन मेजबान चूहों की एक अधिकतम के लिए के बारे में 1 मिमी चौड़ा के छह खंडों प्रदान करेगा ।
  10. दोहराएं चरण 1.4-1.9 प्रत्येक दाता माउस के लिए । thymi समय को कम करने के लिए, एक समय में एक थाइमस को अलग करें ।

2. आंख के पूर्वकाल कक्ष में थाइमस आरोपण

  1. प्रत्यारोपण करने से पहले, टैग और प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस तौलना ।
  2. प्राप्तकर्ता माउस anesthetize करने के लिए isofluorane वाष्पों के 1-2% के बीच एक खुराक का उपयोग करें । शल्य प्रक्रिया शुरू करने से पहले पलटा के बाद पैर की अंगुली चुटकी के अभाव से उचित anesthetization सुनिश्चित करें ।
  3. निम्नानुसार थाइमस सेगमेंट प्रत्यारोपण के साथ आगे बढ़ें:
    1. एक पक्ष पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में माउस रखें ताकि एक आंख ऊपर सीधे विदारक गुंजाइश के लेंस के संपर्क में आ रहा है ।
    2. एक्साइज एक अलग thymic पालियों में ठंडे 1x पंजाबियों (पीएच 7.4) में झूठ बोल-६० मिमी पकवान के साथ टुकड़ों में भरा 1 मिमी चौड़ाई प्रत्यारोपण के लिए । प्रत्येक खंड thymic प्रांतस्था और मज्जा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक zig-मेढ़ी पैटर्न का पालन करें । चित्र 1aमें दिए गए दिशानिर्देशों के अनुसार ट्रिमिंग के लिए vannas कैंची का उपयोग करें.
      नोट: थाइमस की छंटनी सही प्रत्यारोपण ऊतक engraftment का अनुकूलन करने से पहले किया जाना चाहिए ।
    3. कॉर्निया के आधार में शुरू शल्य क्षेत्र के लिए इसी, एक ४० mm G18 सुई की नोक परिचय करने के लिए बाहरी कॉर्निया परतों में एक छोटा सा चीरा इतना है कि विदारक कैंची टिप पेश किया जा सकता है ।
    4. एक 5-10 मिमी पार्श्व सीधे vannas कैंची का उपयोग कॉर्निया के आधार के आसपास चीरा जबकि कॉर्निया खोलने मजबूती से सील करने को रोकने के लिए धारण करें । ऊतक नुकसान से बचने के लिए फ्लैट सिरों के साथ संदंश का प्रयोग करें ।
    5. कटौती corneal उपकला समझ और फ्लैट की एक जोड़ी के साथ कॉर्निया धारण द्वारा खोलने का पर्दाफाश-संदंश समाप्त जबकि खोलने के माध्यम से एक thymic खंड धक्का । गीला बाँझ 1x पंजाबियों (पीएच ७.४) या कृत्रिम आँसू के रूप में हेरफेर पूरा हो गया है जब तक ऊतक सुखाना को रोकने के लिए जरूरत के साथ आंख गीले ।
    6. आंख की सतह पर धीरे प्रेस करने के लिए शिष्य के संबंध में एक पार्श्व की स्थिति के लिए शुरू की ऊतक खंड स्लाइड करने के लिए आंख ´ एस समारोह का संरक्षण । यह सुनिश्चित करें कि भ्रष्टाचार एक आंख खोलने के विपरीत स्थान पर hazing द्वारा इमेजिंग के साथ पीछे हस्तक्षेप को रोकने के लिए निहित है ।
    7. फ्लैट संदंश की सहायता के साथ, मजबूती से प्रेस के बारे में 3-5 एस, एक दूसरे के खिलाफ corneal खोलने के दोनों पक्षों को बढ़ावा देने के लिए स्वयं को सील । सर्जरी में किसी स्टैपल या सिलाई की जरूरत नहीं होती ।
  4. यदि प्रत्यारोपण दोनों आंखों पर प्रदर्शन कर रहे हैं, विपरीत पार्श्व पक्ष पर माउस बारी करने के लिए सीधे विदारक माइक्रोस्कोप लेंस के लिए दूसरी आंख बेनकाब और कदम 2.3.2-2.3.7 दोहराएं ।
  5. सर्जरी के बाद पूरा हो गया है, एक खाली एक गर्मी चिराग के साथ गरम पिंजरे में माउस लौटें ।
  6. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रत्यारोपित माउस एक पिंजरे में इसे रखने से पहले पूरा गतिशीलता और चेतना प्राप्त अंय जानवरों के साथ साझा की है । यह आमतौर पर सर्जरी के बाद 1 घंटे के भीतर जगह लेता है ।
  7. प्रत्यारोपण पर, जरूरत के रूप में दर्द हत्यारों के साथ चूहों का इलाज, और पीने के पानी में १.६ मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर एसिटामिनोफेन के साथ चूहों प्रदान करते हैं ।
  8. दोहराएं प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस के लिए 2.2-2.9 कदम ।
  9. निगरानी के बाद ऑपरेटिव पशु गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से प्रत्यारोपित आंखों की उपस्थिति के लिए संभावित स्वास्थ्य जटिलताओं का पता लगाने ।

3. प्रत्यारोपित Thymi की फोकल इमेजिंग 3d एकल फोटॉन प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग

  1. प्राप्तकर्ता माउस Anesthetize isofluorane वाष्पों के 1-2% के बीच एक खुराक का उपयोग कर । इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले पलटा के बाद पैर की अंगुली चुटकी के अभाव से उचित anesthetization सुनिश्चित करें
  2. एक साइड पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में एक निश्चित चरण माइक्रोस्कोप मंच पर माउस रखें ताकि एक आंख अप का सामना करना पड़ रहा है । रिकॉर्डिंग के दौरान चूहों के लगातार शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए एक हीट पैड माइक्रोस्कोप मंच पर रखा गया है ।
    नोट: विवरण के लिए अनुपूरक चित्रा 1 देखें ।
  3. एक stereotaxic headholder में माउस के सिर डालें और थाइमस भ्रष्टाचार पकड़ आंख को माइक्रोस्कोप उद्देश्य के सीधे उपयोग की अनुमति एक पार्श्व पक्ष स्थिति पर माउस सिर को नियंत्रित करने के लिए घुंडी समायोजित करें ।
  4. प्रक्रिया के दौरान पशु anesthetized रखने के लिए एक गैस मास्क में माउस थूथन रखें । इससे isofluorane वाष्पों का समायोजन आवश्यकतानुसार हो पाता है.
  5. पलकों के कर्षण से परहेज करते हुए रिकॉर्डिंग के दौरान आंखों के स्थिरीकरण की सुविधा के लिए, वापस पलकें खींच जबकि चिमटी की एक जोड़ी है कि उनके सुझावों एक पॉलीथिन ट्यूब जो एक से जुड़े होते है द्वारा कवर किया है के साथ corneal मार्जिन पर आंख पकड़े उस्त-2 ठोस सार्वभौमिक संयुक्त । यह व्यवस्था सिर और आंख के स्थिर निर्धारण परमिट और आंख में रक्त के प्रवाह के विघटन के बिना लचीलापन प्रदान करता है, के रूप में पहले22वर्णित है ।
    नोट: अनुपूरक आंकड़े 1b, C पूरा विधानसभा दिखाओ ।
  6. कॉर्निया और लेंस के बीच विसर्जन तरल के रूप में बाँझ खारा या कृत्रिम आँसू की कुछ बूंदें जोड़ें, माउस आंख पर माइक्रोस्कोप उद्देश्य रखने से पहले.
    नोट: अतिरिक्त बूँदें माइक्रोस्कोप पथ रखने और आँख सुखाने को रोकने के लिए प्रक्रिया भर की जरूरत पर तिरस्कृत कर रहे हैं.
  7. पहले माइक्रोस्कोप क्षेत्र में थाइमस का पता लगाने के लिए कम आवर्धन (5x) लेंस का उपयोग करें । तो उच्च संकल्प (10, 20 और 40X) पानी विसर्जन लंबे समय से काम दूरी के साथ सूई उद्देश्यों के लिए स्विच । मिनिमल लेजर पावर लागू करके thymic प्रत्यारोपण के LSM धूप और ब्लीचिंग से बचें और जितना संभव हो उतना स्कैनिंग समय कम करें । इस माइक्रोस्कोप के गुंजयमान स्कैनर का उपयोग करके हासिल की है ।
    नोट: फोकल माइक्रोस्कोप हम का उपयोग करें गुंजयमान स्कैनिंग के साथ सुसज्जित है दर्पण 25 फ्रेम में छवियों सभा के लिए सक्षम/ अंय ब्रांडों गुंजयमान स्कैनर के साथ अपने स्वयं के सूक्ष्मदर्शी है ।
  8. अधिग्रहण मोड का चयन माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग और गुंजयमान स्कैनर मोड शुरू करते हैं । फिर XYZT इमेजिंग मोड चुनें और अर्जन सेटिंग्स निम्नानुसार कॉन्फ़िगर करें:
    1. आर्गन लेजर चालू करें और प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए पावर को 30% समायोजित करें ।
    2. एक उत्तेजना लेजर लाइन चुनें और अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए acousto ऑप्टिकल बीम अलगानेवाला (AOBS) नियंत्रण सेट । इसके अलावा, backscatter और चित्रित ऊतक संरचना का पता लगाने के लिए, एक साथ प्रतिबिंब का पता लगाने का उपयोग करें ।
      नोट: उत्तेजना (GFP और आरएफपी) के लिए रंग का एक सेट का चयन करने पर, AOBS स्वचालित रूप से नमूना पर इन उत्तेजना लाइनों प्रत्यक्ष और उन दोनों के बीच उत्सर्जन संचारित करने के लिए क्रमादेशित है । उदाहरण के लिए, GFP और आरएफपी के लिए, हम क्रमशः ४८८ एनएम और ५६१ एनएम के आसपास उत्तेजना प्रकाश के लिए संकीर्ण प्रतिबिंब बैंड का उपयोग करें । यह उत्सर्जित प्रतिदीप्ति फोटॉनों के संग्रह के लिए व्यापक बैंड छोड़ देता है, इस प्रकार लेजर शक्ति और अधिग्रहण के समय की आवश्यकता को कम करने । प्रतिबिंब मोड में, AOBS प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल लोगों से दूर किसी भी तरंग दैर्ध्य में प्रकाश प्रतिबिंबित छवि के लिए एक 50/50 बीम अलगानेवाला के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
    3. चयनित तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन ले लीजिए, तो 512 × 512 पिक्सल के एक प्रस्ताव का चयन करें और लाइव बटन दबाकर लाइव इमेजिंग शुरू, लाभ के स्तर को समायोजित करने की जरूरत के रूप में (ठेठ लाभ ६०० वी के आसपास है) ।
    4. thymic प्रत्यारोपण के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करने और शुरूका चयन करें, तो पिछले विमान है कि प्रत्यारोपित थाइमस में ध्यान केंद्रित किया जा सकता है और अंतका चयन करने के लिए कदम से z-ढेर की शुरुआत और अंत को परिभाषित । 5 µm के z-चरण आकार का उपयोग करें । सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से फोकल विमानों की संख्या की गणना करेगा ।
    5. प्रत्येक z-स्टैक के प्राप्ति के लिए समय अंतराल (सामान्यतया १.५ से 2 सेकंड) चुनें और निरंतर इमेजिंग के लिए रोके जाने तक विकल्प प्राप्त करें चुनें.
  9. आरंभ करने के लिए प्रारंभ बटन दबाएँ.
  10. छवि एक ही जानवर से अलग समय पर भ्रष्टाचारियों बार दोहरा कदम 3.1-3.9 ।
    नोट: यदि पशु दोनों आंखों पर भ्रष्टाचार रखती है, या तो आंख से रिकॉर्डिंग कदम 3.2-3.9 माउस सिर की ईमानदार स्थिति पक्ष स्विचन के बाद दोहरा द्वारा लिया जा सकता है ।

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Representative Results

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नवजात चूहों से थाइमस को बी-6 से पृथक किया गया . तटरक्षक-टीजी (सीएजी-DsRed * MST) 1Nagy/बीआयएस चूहों के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित (कदम 1.1-1.9) । इन ट्रांसजेनिक चूहों में चिकन बीटा actin प्रवर्तक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन वैरिएंट DsRed की अभिव्यक्ति का निर्देशन करता है । cytomegalovirus (सीएमवी) के प्रभाव के तहत MST तत्काल जल्दी बढ़ाने प्रत्यारोपण की ट्रैकिंग की सुविधा ।

ऊतक अस्वीकृति को रोकने के लिए, जीनोटाइप के साथ isogenic व्यक्तियों: C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30Scha/जे मेजबान के रूप में चयनित किया गया । इन ट्रांसजेनिक चूहों में, मानव ubiquitin सी प्रवर्तक सभी ऊतकों में संवर्धित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति का निर्देशन प्राप्तकर्ता और दाता ऊतक के बीच एक स्पष्ट भेदभाव के लिए अनुमति देता है । मानव ubiquitin सी प्रवर्तक की क्रिया कुछ टेम कोशिका प्रकारों में विभेदक GFP अभिव्यक्ति प्रतिमानों की ओर ले जाती है. विशेष रूप से, टी कोशिकाओं CD19+B220+ बी कोशिकाओं या अन्य परिधीय रक्त कोशिकाओं है जो मात्रात्मक संवेदनशील तकनीकों जैसे प्रवाह cytometry, बिना किसी भी उनकी पहचान की सुविधा हो सकती से एक 2 गुना उच्च GFP अभिव्यक्ति का स्तर मौजूद अतिरिक्त लेबलिंग के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, इन चूहों में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति वयस्क जानवरों में मनाया जाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सभी भ्रूण चरणों में है और यह एक सेल प्रकार वंश मार्कर स्थिरता देने के भीतर वर्दी है ।

चित्र 1a में दिखाए गए थाइमस ट्रिमिंग के लिए पैटर्न कार्यात्मक थाइमस के पिछले विवरण अनुवर्ती गुर्दे capsula23में प्रत्यारोपित टुकड़े । यह ट्रिमिंग प्रक्रिया ऊतक की कुल मात्रा की कमी के लिए अनुमति देता है जबकि अंग के कार्यात्मक ऊतकवैज्ञानिक बुनियादी इकाइयों के संरक्षण प्रत्यारोपित किया (प्रांतस्था, मज्जा और cortico-दिमाग़ी जंक्शन (CMJ) रक्त वाहिकाओं) । नवजात थाइमस के बीच आकार में उल्लेखनीय अंतर (आंकड़ा 1a, बाएँ) और एक सप्ताह पुराने चूहों से थाइमस (आंकड़ा 1a, दाएँ) ट्रिमिंग के लिए खाते में लिया जाना चाहिए, के रूप में अंतरिक्ष के लिए माउस के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपण फिट उपलब्ध आंख प्रतिबंधित है । यहाँ प्रस्तुत परिणामों में नवजातों से प्राप्त प्रत्यारोपण ही शामिल है. चित्रा 1b एक thymic एक GFP माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपित खंड के एक macroscopic छवि से पता चलता है, पशु दृष्टि की रक्षा के लिए समायोजित । कॉर्निया के संदर्भ में प्रत्यारोपण के ऊतकवैज्ञानिक विवरण (GFP आरएफपी प्रत्यारोपण के निकट ऊतक) अनुपूरक वीडियो 1में फोकल छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण में देखा जा सकता है । आईरिस को engraftment वीडियो 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है ।

चित्रा 1C और 1 डी क्रमशः उज्ज्वल क्षेत्र और एक ही क्षेत्र है जो एक डबल macroscopic ऊतक विकास और निरंतरता के अध्ययन में पेचीदगी का पालन के लिए सेवा कर सकते है की प्रतिदीप्ति छवियों को दर्शाते हैं । चित्रा 1C भी प्रत्यारोपित ऊतक जो विशिष्ट रूप से समय के साथ अंग रक्त की आपूर्ति पर निर्भर थाइमस फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए अनुमति चाहिए की vascularization दिखाता है ।

डाला thymic अंशों का vascularization 72h पश्चात् प्रत्यारोपण के भीतर घटित हुआ. तीव्र vascularization प्रक्रिया आईरिस में पाया रक्त वाहिकाओं की बड़ी मात्रा और cytokine उत्पादन में थाइमस की समृद्धि के साथ अच्छे समझौते में है । ये विशेषताएँ सम्मिलित thymi की तेज़ engraftment सक्षम करते हैं. प्रत्यारोपण के vascularization 2 वीडियोमें सचित्र है, मेजबान व्यक्ति के आईरिस ´ के साथ thymic रक्त वाहिकाओं के engraftment दिखा रहा है (GFP प्रत्यारोपण के लिए आसंन ऊतक), इसलिए, पुष्टि की है कि यहां प्रस्तुत मॉडल, वास्तव में, के लिए अनुमति देता है सूक्ष्म स्तर पर संवहनीय थाइमस की इनवेसिव सतत monitorization । अंतर्जात थाइमस या थाइमस पहले अलग शारीरिक स्थानों में प्रत्यारोपित कल्पना करने के लिए LSM का उपयोग ऊतक अस्पष्टता और 1 मिमी से अधिक के ऊतकों की मोटाई द्वारा प्रतिबंधित है । आंख के पूर्वकाल कक्ष सूक्ष्म स्तर पर प्रत्यारोपित ऊतकों के अवलोकन की सुविधा जीव को एक "खिड़की" के रूप में माना जाता है ।

यहां, यह दिखाया गया है कि हमारे समूह द्वारा विकसित मॉडल रक्त धार (वीडियो 2) प्रत्यारोपित थाइमस (संभवतः progenitors) में से कोशिकाओं के स्थानांतरगमन के दृश्य की अनुमति देता है; GFP जनक कोशिकाओं के संपर्कों की ट्रैकिंग उपकला और stromal thymic निवासी कोशिकाओं के साथ thymic प्रत्यारोपण में आने के लिए (आरएफपी-लेबल) विभेद और चयन प्रक्रियाओं के दौरान (वीडियो 3 और 4) और भी, निकास के लिए कोशिकाओं की (शायद परिपक्व टी कोशिकाओं) रक्त वाहिकाओं में (वीडियो 5) ।

दृष्टिकोण हम वर्णन इस प्रकार का प्रतिनिधित्व "सिद्धांत का सबूत", ७२ के बीच लिया रिकॉर्डिंग के आधार पर एच और एक महीने के बाद छह तीन स्वतंत्र नवजात दानदाताओं से खंडों के साथ प्रत्यारोपण व्यक्तियों से प्रत्यारोपण, एक जानवर मॉडल के लिए कि समय के साथ इनवेसिव प्रक्रियाओं द्वारा एक संवहनी thymic टुकड़ा में thymocyte परिपक्वता के vivo वास्तविक समय ट्रैकिंग में परमिट, और इस तरह के रूप में, प्रोटोकॉल आगे शोधन की आवश्यकता हो सकती है. इस मॉडल को आगे ट्रांसजेनिक पशुओं का उपयोग कर बाहर काम किया जा सकता है लेबल thymocyte आणविक मार्करों बंदरगाह, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट संलयन उत्पादों के रूप में, इस प्रकार टी के प्रत्यक्ष दृश्य-सेल परिपक्वता मध्यवर्ती अनुमति । सिस्टम विवादों को हल करने और अंय के बीच thymocyte विभेद और चयन की घटनाओं से जुड़े incognitas जवाब मदद कर सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. दाता नवजात thymic पालियों के अनुभाग और चूहों आंख के पूर्वकाल चैंबर में प्रत्यारोपण । (एक) नवजात (बाएं) और एक सप्ताह के बाद प्रसव (दाएं) thymi छवियां । नवजात थाइमस पर डैश लाइनें एक दाता से प्रत्यारोपण की अधिकतम संख्या का अनुमान करने के लिए चूहों के पूर्वकाल नेत्र कक्ष में प्रत्यारोपण के लिए वर्गों को तैयार करने के लिए गाइड का प्रतिनिधित्व करते हैं । () नव प्रत्यारोपित थाइमस दिखा प्रतिनिधि छवि । () भ्रष्टाचार, संवहनी थाइमस 2 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के प्रतिनिधि छवि । () पर दिखाए गए थाइमस भ्रष्टाचार की प्रतिदीप्ति छवि (). स्केल बार (1 मिमी) दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. engraftment (ग्रीन) में थाइमस सेगमेंट (red) के विस्तार को दिखाती हुई फोकल इमेज । छवि एक खुर्दबीन के साथ प्राप्त की, निंनलिखित सेटिंग्स का उपयोग: ४८८ और ५६१ एनएम उत्तेजना/500 और ५७५ एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, 512x512 पिक्सेल संकल्प और लंबे समय से काम कर दूरी के साथ 40X सूई उद्देश्य । स्केल बार (४० µm) दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1 । thymic भ्रष्टाचार के फोकल इमेजिंग के लिए सेटअप 3d एकल फोटॉन प्रतिदीप्ति लेजर फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । () Heatpad, stereotaxic headholder और गैस मास्क विवरण. () LSM के लिए थाइमस भ्रष्टाचार धारण माउस की स्थापना की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1. vivo इमेजिंग में थाइमस प्रत्यारोपण के माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2. thymic पैरेन्काइमा (आरएफपी) में रक्त प्रवाह (GFP) से संभवतः थाइमस बसने progenitors (टीएसपी) की भर्ती । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 3
वीडियो 3. Stochastic मूवमेंट ऑफ thymocytes (अर्ली thymic progenitors or ETPs) इन द प्रांतस्था. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 4
वीडियो 4. thymic stromal कोशिकाओं (आरएफपी) के साथ thymocytes (GFP) की बातचीत या तो cTECs (cortical thymic उपकला कोशिकाओं) या mTECs (दिमाग़ी thymic उपकला कोशिकाओं). कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 5
वीडियो 5. संभावित परिपक्व टी कोशिकाओं के वास्तविक समय निकास इमेजिंग । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplementary Video
अनुपूरक वीडियो 1.3 डी-vivo में थाइमस प्रत्यारोपण के माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में इमेजिंगकृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

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व्यक्तिगत प्रतिरक्षा क्षमता4 के लिए टी सेल परिपक्वता प्रक्रिया के महत्व और परिपक्व टी-थाइमस द्वारा उत्पादित कोशिकाओं पर अग्रदूत सेल गतिशीलता के माना प्रभाव के कारण2,3, व्यापक प्रयासों का निवेश किया गया है शास्त्रीय निश्चित ऊतक स्नैपशॉट दृष्टिकोण के लिए विकल्प विकसित करने के लिए ।

हालांकि ऊतक स्लाइस और अंय explants स्पष्ट रूप से monolayers या कुल thymic अंग संस्कृतियों14,15, vasculature के लिए एक कनेक्शन के अभाव से ऊतक वास्तुकला reproducing में बेहतर कर रहे है उनके उपयोग के लिए अध्ययन सीमा प्रवेश या टीएसपी के कदम (रक्त वाहिका endothelial कोशिकाओं बाधा भर में progenitors के translocation) और बाहर निकलें (परिपक्व टी कोशिकाओं के translocation में रक्त वाहिका endothelial कोशिकाओं बैरियर भर) अंग से । के रूप में यह कल्पना की है कि टी सेल संपर्कों की गतिशीलता thymic stromal कोशिकाओं सहित अंय कोशिकाओं के साथ, और प्रांतस्था के भीतर microenvironments भर में उनके गतिशीलता और मज्जा उनके विभेद की स्थिति और उपजनसंख्या की प्रक्रिया निर्धारित चयन (सकारात्मक और नकारात्मक)2,3,4,5, और के बाद से इन प्रक्रियाओं टीएसपी और परिपक्व टी सेल निकास घटनाओं पर निर्भर हो सकता है, एक मॉडल है कि व्यक्तिगत ´ एस रक्त प्रवाह के लिए कनेक्शन शामिल प्रणाली वांछनीय होगा ।

Intradermal और गुर्दे कैप्सूल थाइमस के प्रत्यारोपण इस उन्नयन के लिए अनुमति दें17,18. हालांकि, वे शरीर या भ्रष्टाचार के ऊपर ऊतक के अपारदर्शी परतों की उपस्थिति के भीतर प्रत्यारोपण की गहरी स्थिति के कारण TPLSM द्वारा इमेजिंग करने के लिए लगाया सीमाओं के साथ इनवेसिव तरीकों का गठन । माउस पूर्वकाल नेत्र चैंबर के अनुकूलन, पहले एक "खिड़की"21,22 के रूप में इस्तेमाल किया longitudinally कई ऊतकों के प्रदर्शन की निगरानी, एक साइट के रूप में टी ट्रैक करने के लिए एक संवहनी थाइमस के भीतर कोशिकाओं कई लाभ प्रदान करता है बनाम अंय ट्रांसप्लांटेशन रणनीतियों । एक तरफ, शल्य चिकित्सा सरल है, क्योंकि कोई टांके की आवश्यकता है, मेजबान जानवरों की तेजी से वसूली के लिए अग्रणी । दूसरी तरफ, प्रत्यारोपण के अवलोकन के रूप में यह गुर्दा कैप्सूल प्रत्यारोपण के लिए होता है एक अतिरिक्त सर्जरी की आवश्यकता नहीं है, एक ही जानवर से दोहराया रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, आंख की विशेष संरचनात्मक विशेषताओं को आसानी से प्रत्यारोपित ऊतक पर विनियामक निविष्टियां न केवल प्रणालीबद्ध बल्कि स्थानीय रूप से भी नियमन करने की अनुमति देते हैं । के रूप में पहले से वर्णित है, इस दृष्टिकोण के साथ, पदार्थ आंख पर लागू किया जा सकता है सामयिक या पूर्वकाल नेत्र कक्ष में इंजेक्शन । यह भी एक आसान करने के लिए पदार्थ या कोशिकाओं थाइमस में सीधे परिचय विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है (यानी, progenitors या परिपक्वता पूर्व vivo और adoptively हस्तांतरित लेबल मध्यवर्ती), जो परंपरागत रूप से एक बहुत जटिल प्रक्रिया किया गया है कारण थाइमस शारीरिक स्थान२४,२५। इसके अलावा, पूर्वकाल चैंबर के छिड़काव जलीय हास्य या फ्लोरोसेंट संकेतकों के साथ प्रसार द्वारा भ्रष्टाचार के लदान के आदान प्रदान की अनुमति देता है, के रूप में पहले से26प्रत्यारोपण के अंय प्रकार के लिए दिखाया गया है ।

दृष्टिकोण है कि अधिक ईमानदारी से थाइमस फिजियोलॉजी के अध्ययन की अनुमति देता है ट्रांसजेनिक medaka मछली के intravital इमेजिंग द्वारा प्रदान की जाती है फ्लोरोसेंट लिम्फोसाइट मार्करों लेबल व्यक्त । विकास के दौरान medaka की पारदर्शिता और कई medaka उपभेदों में जीवन भर में इस जीव को vivo21में सेलुलर गतिशीलता की निगरानी के लिए लाभप्रद बनाता है । medaka में मनाया thymocytes की कम संख्या (29%)18 माउस ´ s के संदर्भ में (९५%)13, इन दो जीवों के बीच गतिशीलता दरों में अंतर के अलावा, तथापि, पता चलता है कि ठंड रक्त के साथ सबसे छोटी हड्डीवाला एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली उच्च हड्डीवाला टी सेल परिपक्वता की घटनाओं के विशेष यंत्रवत कैनेटीक्स खुलासा करने में सीमित हो सकता है ।

थाइमस ट्रांसप्लांटेशन के लिए साइट के रूप में माउस नेत्र के पूर्वकाल चैंबर के उपयोग की एक सीमा अंतरिक्ष प्रतिबंध है । दीर्घकालिक अध्ययन हो सकता है, इसलिए, समझौता; विशेष रूप से नवजात या भ्रूण के ऊतकों के लिए बढ़े हुए विकास की क्षमता । इस अर्थ में, हम राज्य चाहिए कि हालांकि नवजात पहले सप्ताह के बाद स्पष्ट ऊतक विस्तार के साथ प्रस्तुत प्रत्यारोपण माउस आंख में प्रत्यारोपण (नहीं दिखाया गया डेटा), इज़ाफ़ा दो महीने के बाद प्रत्यारोपण करने के लिए जोखिम पर आंख की अखंडता डाल करने के लिए प्रतीत नहीं हुआ । फिर भी, यह मूल्यांकन करने के लिए ब्याज की होना चाहिए कि प्रत्यारोपण के ऊतक पर्यावरण (नेत्र चैंबर, गुर्दे कैप्सूल या dermis) प्रभावित प्रत्यारोपण ´ एस वृद्धि और/या vascularization दृष्टिकोण की पर्याप्तता से पहले निर्धारित करने के लिए स्थापित किया जा सकता अनुप्रयोगों.

बड़े कॉर्निया पर आवश्यक चीरा पूर्वकाल नेत्र कक्ष के लिए thymic टुकड़ा के पारित होने की अनुमति देने के लिए इस स्तर पर कुछ hazing के लिए कभी-कभार होता है (डेटा नहीं दिखाया गया है), सबसे अधिक होने की संभावना चिकित्सा प्रक्रिया से जुड़े फाइब्रोसिस के कुछ डिग्री करने के लिए संबंधित । ध्यान प्रोटोकॉल के कदम 2.3.6 पर मांग की है सुनिश्चित करें कि यदि hazing होता है ंयूनतम बहाव इमेजिंग चरणों के साथ हस्तक्षेप करेगा । चीरा एक पार्श्व स्तर पर किया जाता है के रूप में, न तो प्रत्यारोपण और न ही hazing काफी जानवरों की दृष्टि प्रदर्शन को प्रभावित करना चाहिए.

थाइमस को नेत्र कक्ष में फ़िट करने के लिए ट्रिम करने योग्य ऊतक की आवश्यकता के लिए एक नुकसान अगर अंय शारीरिक साइटों है कि अंग की शारीरिक अखंडता को बदलने की आवश्यकता नहीं है की तुलना में प्रतीत होता है । फिर भी, गुर्दे कैप्सूल दृष्टिकोण से पता चला है कि थाइमस युक्त के टुकड़े, दोनों, प्रांतस्था और मज्जा 1 चित्रामें दिखाया उन लोगों के लिए इसी तरह के विच्छेदन दिशा निर्देशों के द्वारा प्राप्त, पूरी तरह कार्यात्मक बन के रूप में वे टी सेल का पुनर्गठन कर सकते हैं immunodeficient में मध्यस्थ प्रतिरक्षा अजवायन के रूप में18मेजबान । यह थाइमस क्षेत्रों के इस प्रकार के बरकरार कार्यात्मक लक्षण के पक्ष में तर्क है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहां वर्णित जोर दिया है कि अलग थाइमस ठंड में रखा जाना चाहिए (१.९ कदम) और केवल प्रत्यारोपण से पहले छंटनी (कदम 2.3.2) के लिए ठंडा ischemia और ऊतक engraftment के अनुकूलन की दिशा में ऊतक जोखिम कम ।

दृष्टिकोण की एक अतिरिक्त संभावित सीमा आंख और रक्त प्लाज्मा के पूर्वकाल कक्ष में जलीय हास्य के बीच संरचना मतभेदों में रहता है, मुद्दा है कि जब इस शारीरिक स्थान पर किए गए टिप्पणियों की व्याख्या को ध्यान में रखा जाना चाहिए . अंय ऊतकों के साथ पिछले अध्ययन, तथापि, स्थानीय नेत्र पर्यावरण22द्वारा सामांय भ्रष्टाचार समारोह पर कोई स्पष्ट प्रभाव की सूचना नहीं है । हालांकि यहां प्रस्तुत मॉडल के साथ अनुभव कुछ व्यक्तियों (n = 6 और n = 3 प्राप्तकर्ताओं और दाताओं के लिए, क्रमशः) वर्तमान में करने के लिए प्रतिबंधित है, हम किसी भी प्रमुख thymic प्रत्यारोपण के मामले में प्रत्यारोपण साइट से जुड़े परिवर्तन का पालन नहीं किया व्यक्तियों को भी ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक सबूत के सिद्धांत का गठन thymocyte गतिशीलता के intravital अनुदैर्ध्य इमेजिंग के अध्ययन के लिए माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में thymic ऊतक प्रत्यारोपित द्वारा । असुरक्षित प्राप्तकर्ताओं के चयन के कारण, प्रणाली भ्रष्टाचार के प्रणालीगत समारोह में पूछताछ की अनुमति नहीं दी । भविष्य के अध्ययनों से इस दृष्टिकोण पर निर्माण कर सकते है विभिंन दाताओं और/या प्राप्तकर्ताओं और/या विकिरण और अस्थि मज्जा (बीएम) ट्रांसप्लांटेशन विशेष अध्ययन डिजाइन के अनुसार के लिए मेजबान के अधीन । उदाहरण के लिए, SCID के विकल्प (गंभीर संयुक्त इम्यूनो) प्राप्तकर्ताओं के रूप में चूहों अंतर्जात टी कोशिकाओं के हस्तक्षेप को समाप्त, और ट्रांसजेनिक चूहों दाताओं के विकल्प (thymic प्रत्यारोपण और/टी सेल मार्करों पेश, डीसी मार्करों, thymic stromal सेल मार्करों, आदि, व्यक्तिगत रूप से या संयोजनों में प्रत्यक्ष vivo सेलुलर उपआबादी की ट्रैकिंग की अनुमति चाहिए । वैकल्पिक रूप से, चूहों के पूर्वकाल नेत्र कक्ष में कोशिकाओं की उपआबादी ट्रैक किया जा सकता है, के रूप में पहले से वर्णित, vivo प्रतिदीप्ति cytolabeling26 में द्वारा ।

यहां प्रस्तुत मॉडल का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह अध्ययन जनक और परिपक्व टी कोशिकाओं से translocation और रक्त वाहिकाओं की ओर के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, यह निर्धारित करने के लिए प्रासंगिक होना चाहिए अगर तेजी से प्राप्त vascularization थाइमस के बाद पूर्वकाल नेत्र कक्ष recapitulates अंतर्जात vasculature में प्रत्यारोपित किया जा रहा है । इस संभावना के पक्ष में, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि पूर्वकाल माउस कक्ष में neovascularization को भ्रष्टाचार18,20 के बजाय प्राप्तकर्ता द्वारा तय किया जा रहा है और इसलिए आईरिस vasculature के लिए कनेक्शन अंतर्जात थाइमस cortico-दिमाग़ी जंक्शन (CMJ) डोमेन की अखंडता की रक्षा करनी चाहिए ।

एक अतिरिक्त लाभ तथ्य यह है कि प्रणाली दो स्वतंत्र प्रत्यारोपण (दो पूर्वकाल नेत्र मंडलों) समान व्यक्तिगत पृष्ठभूमि पर (एक एकल मेजबान) के मूल्यांकन की अनुमति देता है से आता है । ऊतकों के संयोजन की आवश्यकता के अध्ययन भी यह इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए लाभप्रद मिल सकता है ।

के रूप में थाइमस स्व-प्रतिरक्षित और प्रतिरक्षा की कमी विकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, इस दृष्टिकोण के लिए संभावित सवालों के असंख्य पते इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, प्रणाली थाइमस पेचीदगी की प्रगति के लिए इंट्रा अंग इमेजिंग के अलावा macroscopic की अनुमति चाहिए । यह भी प्रत्यारोपण सहिष्णुता की घटनाओं और प्रतिरक्षा संक्रमण से संबंधित रोग का अध्ययन करने के लिए सेवा कर सकते हैं । यह संभावना है कि thymocyte परिपक्वता शासी तंत्र के ठीक विच्छेदन अतिरिक्त चिकित्सीय टी कोशिकाओं के विकास को लक्षित रणनीतियों के डिजाइन के लिए नए सुराग प्रदान करेगा ।

थाइमस का प्रत्यारोपण आंख के पूर्वकाल कक्ष में नवजात थाइमस अलगाव और या तो आंख में प्रत्यारोपण के साथ प्रत्येक मेजबान व्यक्ति के लिए trimming सहित कम से ४५ मिनट, लेता है । vivo इमेजिंग रिकॉर्डिंग में 1 से 5 ज, मॉनिटर सुविधाओं के आधार पर की आवश्यकता होती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH पलाश R56DK084321 (AC) ने सपोर्ट किया था, R01DK084321 (एसी), R01DK111538 (एसी), R01DK113093 (एसी), और R21ES025673 (एसी), और द्वारा सर्वश्रेष्ठ/2015/043 अनुदान (Consellería de Educació, cultura मैं esport, Generalitat valenciana, वालेंसिया, स्पेन) (ईओ) । लेखक अल्बर्टो de Hernandez Centro Investigación, वालेंसिया, स्पेन में Universidad Católica de वालेंसिया San विसेंट Mártir, वालेंसिया, स्पेन और Príncipe फेलिप पर भेजा टीम धंयवाद वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

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References

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लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा आंख के पूर्वकाल चैंबर में Vivo ट्रैकिंग Thymocytes <em>में</em> वास्तविक समय
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Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

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