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Biology

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口を継続的に記録が可能です。

Abstract

提示されているメソッドの目的は、最初の時間のため、新生児 thymi生体内で縦のリアルタイム モニタ リング、血管内 thymocytes´ ダイナミクスの同質の成体マウスの前眼房への移植を表示するは胸腺のセグメント。次の移植、レーザー顕微鏡 (LSM) 角膜は、携帯電話の解像度レベルでの繰り返し非侵襲的イメージング体内をことができます。重要なは、アプローチに追加しますイメージング モデル以前の生体の T 細胞の成熟に連続前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口の録音の可能性同じ動物。システムの付加的な利点は、移植組織の巨視的急速な監視を許可する接木部透明性と全身トリートメントに加え、インプラントへのアクセシビリティがローカライズされました。組織のボリュームをされている主な制限するは葉のトリミングを要求する目の商工会議所の省スペースに収まります。オルガンの整合性は、成熟した T 細胞の生産で機能する以前にパターンで胸腺ローブを解剖によって最大化されます。技術は可能性のある自己免疫疾患、免疫不全、中枢性トレランス; を含む胸腺機能に関連する医学的に関連の質問の環境調査に適していますプロセス定義が不十分な機械論的に残っています。胸腺細胞の移動、分化と選択を導くメカニズムの細かい解剖は、新規治療戦略開発 T 細胞をターゲットにつながるはずです。

Introduction

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胸腺内 T 細胞分化と T 細胞亜集団の選択は、開発と脊椎動物1の細胞性免疫能の維持のため重要なプロセスを構成します。このプロセスは、複雑な一連の血流や細胞増殖の移行から前駆細胞の募集、サブセットの大規模なプログラム細胞死および膜タンパク質の発現を含むしっかりと組織のイベント選択します。結果は最小化された自己のペプチッド、レスポンスを表示しながら、成熟 T 細胞に外国の抗原の広いスペクトル反応のリリースを最後まで個々2,3の末梢リンパ器官を植民地化します。ΑβTCR レパートリーの迷入胸腺選択は、自己免疫疾患や免疫のアンバランス4主に正または負の前駆体選択の過程それぞれ欠陥から派生したに します。

胸腺で胸腺細胞の方向性の移行は T 細胞の成熟のすべての段階に組み込み、ケモカイン、接着剤を含む複数の刺激、同時またはシーケンシャルのシリーズとして構想・解消接着細胞外マトリックス (ECM)蛋白質の相互作用の35。固定組織の研究が表示される定義された胸腺微小5,6、渡り鳥のキューの胸腺細胞の表現のパターンに関する重要な情報ex vivoの研究は 2 つを明らかにした流行胸腺細胞器官の 2 つの組織の領域の移住性の動作: 遅い確率的な運動皮質と髄質7,8,9,10高速、限られた運動,11,12,13。 胸腺の肯定的な選択13と渡り鳥の増加率の相関と負の淘汰は胸腺旅の速度が適切なを決定すること仮説を支えるクロールの動作に関連付けられています。胸腺細胞の成熟。その妥当性にもかかわらず胸腺間質細胞の相互作用のトポロジおよび T 細胞の成熟に伴う臓器微小で胸腺細胞運動のダイナミクスは不明確なままです。

ほとんどは、前のヴィヴォの日付に対して研究胎児または胸腺器官培養14,15、切片または胸腺細胞の動きが 2 光子レーザーのスキャンによって可視化してそのまま胸腺葉外植片を再集約顕微鏡 (TPLSM)8、制限最大作動距離および組織に従い 1 mm の深さのイメージングと生体イメージング技術は、16を検討しました。胸腺スライス技術と特定のサブセットのままの胸腺葉アプローチ許可制御導入の両方であらかじめラベル 3 D 構造を形成する長期の潜伏時間に依存する骨の折れる胸腺器官培養と対照をなしてネイティブの組織アーキテクチャ環境に胸腺細胞。ただし、血流があるので欠席これらのモデルで胸腺胸腺実質または成熟 T 細胞の胸腺の egression のダイナ ミックス (Tsp) 前駆細胞をセトリングの採用プロセスを研究するため明確に限定されます。

In vivoモデル マウスにおける胸腺 T 細胞の成熟の生理学の研究のためには、全体の器官葉腎カプセル17または掻き18内に配置またはフラグメントの移植が含まれます。動物の奥深くまたは不透明な組織の層で覆われている胸腺移植片の位置が体内でインプラントの検査のための使用を制限がこれらのオプションは、組織の機能生着全身を尋問する彼らの有用性を示したTPLSM。

目の前房は角膜のレイヤーの透明度のおかげで、移植組織の直接監視の簡単にアクセスできるスペースを提供します。利点の虹彩によって形成されたチャンバのベースは血管や自律神経終末、急激な血行再建術と移植19,20の神経再生を有効にするが豊富です。博士カイセードがメンテナンスおよび過去21膵島の縦断的研究のためこの解剖学的領域を使用して正常に。ここで、紹介はこの戦略だけでなくネイティブ器官の構造内の胸腺細胞のダイナミクスを研究するための有効なアプローチを構成するも一意に前駆募集の研究に縦の録音は、生体内で拡張することができますが、マウス成熟 T 細胞 egression の手順。

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Protocol

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機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の IACUC ガイドラインに従ってすべての実験を承認しました。

1. 分離と新生児 Thymi のトリミング

  1. すべての試薬・ オートクレーブまたは滅菌条件の確保、その他の方法で機器を準備します。
  2. 、汚染を最小限に抑えるには、層流フードの下ですべての手術を実行します。
  3. ドナー マウスを安楽死させる前に滅菌の prechilled 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) x で 60 mm 滅菌皿を埋める、氷の上に置きます。それは、洗浄し、移植前にドナーから摘出した thymi を格納する使用されます。
  4. 倫理的なガイドラインに従い、斬首で新生児ドナー マウスを安楽死させるのに進んでください。
  5. 背直立位置とスプレーで無菌の吸収紙タオルの上にマウスを置くし、後で拭く、70% エタノールでマウスの腹部。
  6. 下腹部のレベルで表面的な V 字切開することによって胸腔内を公開解剖はさみ次の約 0.5-1 の開口部を残して腹側正中線ストレート 10 cm のペアで皮膚をカットして cm 胸のレベルで。胸腔内を公開する胸の各側面上の皮膚を折る。
  7. 横隔膜と前方の胸腔内で上縦隔にアクセスするはさみの同じタイプの胸部を作る 2 つの深い 0.5-1 cm 横切開します。胸腺は、中心部のすぐ上の 2 つの薄い葉として表示されます。
  8. 胸腺と完全な臓器を抽出するために垂直方向にプルの下にカーブタイプ鉗子のセットを配置します。鉗子のペアで胸部のフォールドを防止します。必要な場合は、慎重に、臓器を抽出する前にカプセルを中断することがなく臓器を囲む結合組織をバラバラにする微細鉗子を使用します。
    注: この手順は、切り裂くスコープの使用によって促進されます。
  9. 冷滅菌 1 × PBS (pH 7.4) 以前 60 mm 滅菌皿に表示され、メスと結合の地峡をカット胸腺ローブを区切るために孤立した胸腺が水没します。お皿からカプセルを損なうことがなく任意の残骸を削除します。Thymi が公開される時間を最小限に抑えるためにインプラントの前にタイムの葉をトリミングします。
    注: 両方の目にインプラントを受け取るとき、それぞれ孤立した新生児胸腺は最大 3 つのホスト マウス幅約 1 mm の六つのセグメントをレンダリング通常されます。
  10. 各ドナー マウス手順 1.4 1.9 を繰り返します。Thymi が公開される時間を最小限に抑えるため、一度に 1 つの胸腺を分離します。

2. 胸腺目の前房内注入

  1. 移植前にタグし、各受信者のマウスの重量を量る。
  2. 受信者のマウスを麻酔する isofluorane 蒸気の 1-2% 間の用量を使用します。手術の手順を開始する前に次のつま先ピンチを反射の不在によって適切な anesthetization を確認します。
  3. 胸腺のセグメントの移植と手順に従います。
    1. その 1 つ目が向いているので、切り裂くスコープのレンズに直接さらされるよう側側臥位でマウスを配置します。
    2. 消費税冷 1x PBS (pH 7.4) で横になっている孤立した胸腺ローブの 1 つ-の部分にインプラントの最大 1 mm 幅で 60 mm ディッシュをいっぱい。胸腺皮質と髄質が各セグメントに含まれていることを確保するためジグザグ パターンに従います。図 1 aに示したガイドラインによるとトリミングの vannas はさみを使用します。
      注: 胸腺のトリミングは、組織の生着を最適化するためにインプラントの前にされるべきであります。
    3. 外科領域に対応する角膜のベースから、解剖はさみの先端を導入することができますように、外部角膜層に小さな切開を作成する 40 mm G18 針のヒントをご紹介します。
    4. 再シールしないようにしっかりと角膜の開口部を押しながら vannas はさみを使って角膜のベースの周りに直接切開の側面 5 〜 10 ミリメートルを作る。フラット端が鉗子を使用して、組織の損傷を避けるために。
    5. カットの角膜上皮を把握し、胸腺セグメント開口部を押しながらフラット エンド鉗子のペアで角膜を保持することによって開口部を公開します。操作が完了するまで組織の乾燥を防ぐために必要に応じて滅菌 1 × PBS (pH 7.4) または人工涙液で目を濡れています。
    6. Eye´s 関数を維持するために生徒に対して横方向位置に導入された組織のセグメントをスライドに眼の表面に軽く押します。移植がいじめによるイメージングと後部の干渉を防ぐために開く目と反対の位置にあることを確認します。
    7. フラット鉗子の援助を押してしっかりとの約 3-5 秒、お互い自己シールを促進するために角膜の開口部の 2 つの側面。手術では、すべてのステープル処理や縫製は必要ありません。
  4. 両方の目に、移植を行う場合は、直接手順 2.3.2-2.3.7 を繰り返す解剖顕微鏡のレンズに 2 番目の目を公開し反対側をマウスを裏返します。
  5. 手術が完了した後は、熱ランプを prewarmed 空ケージにマウスを返します。
  6. その各移植マウスは他の動物と共有ケージにそれを配置する前に完全なモビリティと意識を取り戻すかどうかを確認します。これは通常手術後 1 時間以内の場所をかかります。
  7. 移植時に、必要に応じて鎮痛剤を持つマウスを治療し、1.6 mg/mL の飲料水中の濃度でアセトアミノフェンとマウスを提供します。
  8. 各受信者のマウス手順 2.2 2.9 を繰り返します。
  9. 潜在的な健康の合併症を検出する注入の目の出現と同様、術後の動物の活動を監視します。

3 D 単一光子蛍光共焦点顕微鏡を用いた注入 Thymi の 3 共焦点イメージング

  1. Isofluorane 蒸気の 1-2% 間の線量を使用して受信者のマウスを麻酔します。イメージの作成手順を開始する前に次のつま先ピンチを反射の不在によって適切な anesthetization を確保します。
  2. その 1 つ目が向いているので側側臥位での固定ステージ顕微鏡プラットフォームにマウスを配置します。熱パッドは、記録中にマウスの一定の体温を確保するため顕微鏡プラットフォームに配置されます。
    注: 詳細については補足の図 1を参照してください。
  3. 脳定位固定装置 headholder にマウスの頭を挿入し、胸腺移植を持って目に対物レンズの直接アクセスを許可する側の位置にマウスの頭を抑えるノブを調整します。
  4. マウス鼻をプロシージャ全体で麻酔した動物を維持する防毒マスクに配置します。これは、必要に応じて isofluorane 蒸気の調整が可能します。
  5. 録音中に目のまぶたの取り消しを回避しながら安定化しやすく、角膜の縁に付すポリエチレン チューブで覆われて彼らのヒントを持っているピンセットのペアに目を押しながらまぶたを引いて、UST 2 ユニバーサル ジョイント。この配置は頭と目が安定した固定が可能前述22として、目の血流の中断することがなく柔軟性を提供しています。
    注:補足図 1 b Cは、完全なアセンブリを表示します。
  6. 角膜とレンズの間浸漬液としてマウスの目に対物レンズを配置する前に滅菌生理食塩水や人工涙を数滴を追加します。
    注: 追加滴は顕微鏡パスを維持し目の乾燥を防ぐための手順の必要性に分配されます。
  7. まず低倍率 (5 X) を使用して、顕微鏡分野で胸腺を探します。長作動距離を持つ目標を浸漬より高い解像度 (10、20、40 X) 水液浸に切り替えます。LSM の生成や最小限のレーザー パワーを適用することで胸腺のインプラントの漂白を回避し、可能な限り、スキャン時間を短縮します。これは顕微鏡の共振型スキャナーを使用して実現されます。
    注: 共焦点顕微鏡を用いてが共鳴スキャン ミラー 25 フレーム/秒の画像を収集することが備わっています。他のブランドはある共鳴スキャナーで独自の顕微鏡です。
  8. 顕微鏡のソフトウェアを使用して集録モードを選択し、共振型スキャナー モードを開始します。XYZT 画像モードを選択し、取得設定を次のように。
    1. アルゴン レーザーをオンにして蛍光励起の 30% に電力を調整します。
    2. 励起レーザー ラインを選択し、発光波長の異なるの音響光スプリッター (AOBS) 制御を設定します。さらに、後方散乱を検出して組織構造を描く、同時に反射検出を使用します。
      注: 励起 (GFP と RFP) のための色のセットを選択すると、直接試料の上にこれらの励振線とそれらの間の放射を送信するは自動的に、AOBS はプログラムします。GFP および RFP は、例えば、励起光 488 周りの狭い反射バンドを使用我々 nm と 561 nm、それぞれ。これはレーザー パワーと集録時間の必要性を減らす放出される蛍光の光子のコレクションのための広いバンドを残します。反射モードで、AOBS は蛍光発光検出のために使用されるものから任意の波長で反射光を画像に 50/50 ビームスプリッターとして使用されます。
    3. 選択した波長で放出を収集、512 × 512 ピクセルの解像度を選択し、必要に応じて利得レベルを調整するLiveボタンを押して、イメージングを開始 (典型的な利得は約 600 V)。
    4. 胸腺のインプラントの上に焦点を当て、先頭と z スタックの末尾を定義、開始を選択し、最後の移植胸腺に集中することができますし、終了を選択面に移動します。5 μ m の z ステップ サイズを使用します。ソフトウェアは、共焦点平面の数を自動的に計算されます。
    5. 各 z スタック (通常 2 秒に 1.5) の獲得のための時間間隔を選択し、連続イメージングのために停止するまでを取得オプションを選択します。
  9. 初期化開始ボタンを押します。
  10. 3.1 3.9 の手順を繰り返すことによって、同じ動物から異なる時間に繰り返しグラフトをイメージします。
    注: 動物は、両方の目に移植を保持している場合どちらの目からの録音はマウスの頭の直立位置側の切り替え後 3.2 3.9 の手順を繰り返すことによって撮影することができます。

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Representative Results

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新生児マウス胸腺がB6 から分離されました。Cg Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jasマウスこのプロトコル (手順 1.1 1.9) で説明されているようです。これらのトランスジェニック マウスにおける鶏 β アクチン プロモーターは赤色蛍光タンパク質変形した DsRed 発現を指示します。インプラントの追跡を促進する早い即時エンハンサー サイトメガロ ウイルス (CMV) の影響の下で MST。

拒絶反応を遺伝子型と同質の個人を防ぐために: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/Jは、ホストとして選ばれました。これらのトランスジェニック マウスにおける人間ユビキチン C プロモーターは受信者とドナー組織の間の明確な差別化を可能にするすべての組織に強化された緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現を指示します。人間ユビキチン C プロモーターのアクションは、特定の造血幹細胞の種類で差分の GFP 発現パターンに します。特に、T 細胞は CD19 よりレベル 2 倍より高い GFP 発現を提示+B220+ B 細胞かなど定量的な敏感な技術によってそれらの識別を促進するかもしれない他の末梢血細胞フローサイトメトリー、なし追加の分類のため必要があります。さらに、大人の動物だけでなく、すべての胚の段階でこれらのマウスにおける蛍光発現が観察される、マーカーの安定性を付与するセル型系統に統一されました。

図 1 aに示されている胸腺トリミングのパターン23腎被膜移植胸腺機能フラグメントの前の説明に従います。このトリミングの手順は (皮質、髄質と皮質髄質ジャンクション (CMJ) 血管) の器官の機能組織学的基本単位を維持しながら注入する組織の総量削減のためことができます。、トリミング用アカウントにスペースに合わせて利用可能なマウスの房内でインプラントする際に 1 週間の古いマウス (図 1 a、右側) から (図 1 a、左) 新生児胸腺と胸腺のサイズに顕著な違いが講ずべき目は、制限されています。ここで示した結果は、新生児のみから得られるインプラントを含まれます。図 1 bは、収容動物の視覚を維持するために、GFP マウス眼の前房内注入胸腺セグメントの巨視的なイメージを示しています。補助ビデオ 1共焦点画像の 3 D 再構成における角膜 (GFP 組織 RFP インプラントに隣接して) 参考インプラントの組織学的詳細を観察できます。虹彩に生着をビデオ 1図 2に示します。

明視野がそれぞれ説明図 11 Dとダブル巨視的ために役立つ可能性があります同じ領域の蛍光画像の組織の成長と研究の継続で退縮のフォロー アップ。図 1は、時間に沿って臓器の血液供給に依存している胸腺の生理学を勉強して、一意にする必要があります移植組織の血管新生も示しています。

72 時間後インプラントの挿入された胸腺フラグメントの新生血管が発生。急激な血管新生作用は、血管、虹彩およびサイトカイン産生における胸腺の豊かさの大量の良い契約。これらの特性は、挿入された thymi の高速生着を有効にします。インプラントの血管新生に示しますビデオ 2、胸腺の血管のホストの iris´ に生着を個々 に表示 (GFP 組織 RFP インプラントに隣接する)、したがって、今回紹介したモデルは、実際には、ことを確認します。顕微鏡レベルでの血管の胸腺の非侵襲的連続 monitorization。内因性胸腺や以前別の解剖学的位置に移植胸腺視覚化する LSM の使用は、組織の不透明度および組織の厚さ 1 mm 以上で制限されます。目の前房は、顕微鏡レベルで移植組織の観察を促進する生物への「窓」として考慮されます。

ここでは、私たちのグループによって開発されたモデルで血の急流 (動画 2) から細胞移植胸腺 (おそらく前駆細胞); に輪廻の可視化できますが表示されます。胸腺上皮と間質の居住者と胸腺のインプラントに GFP 前駆細胞着信の連絡先の追跡のためのセル (RFP ラベル) (動画 34) の分化と選択プロセス中に、また、出口の細胞血管 (動画 5) に (おそらく成熟 T 細胞)。

このように述べるアプローチを表す「原理の証明」、録音から 6 人は 3 つの独立した新生児のドナーからのセグメントと移植後インプラント 72 h と 1 ヶ月間撮影基に、動物のモデルは、ずっと時間の非侵襲的手順により胸腺細胞成熟血管胸腺フラグメントの実時間追跡を体内を許可など、プロトコルでは改良をさらに必要な場合があり、。このモデルは、T 細胞の成熟の中間体の直接可視化が可能、蛍光の融合製品ラベル胸腺細胞分子マーカーなどを抱いてトランスジェニック動物の活用をさらに働いてこと。システムは、可能性があります論争を解決し、incognitas リンク胸腺リンパ球の分化と選択する他のイベントに応答します。

Figure 1
図 1。マウス眼房内にドナー新生児胸腺ローブと移植のセクショニング。(A) 新生児 (左) と 1 週間出産後 (右) thymi 画像。新生児胸腺に線分を表すガイド 1 人のドナーから移植の最大の数を推定するためにマウスの前眼房への移植のためのセクションを準備します。(B) 代表的な画像表示を新しく移植胸腺。(C) 代表的な画像の移植、胸腺 2 週間後インプラントを血管柄付き。(D) (C) に示すように胸腺移植の蛍光イメージ。スケール バーには、(1 mm) が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。共焦点画像 (緑) アイリスの胸腺セグメント (レッド) 生着の詳細を表示します。次の設定を使用して、顕微鏡で得られた画像: 488 と 561 nm 励起/500 575 nm の発光波長、512 × 512 ピクセルの解像度と長作動距離を持つ目的を浸漬 × 40。スケール バーを表示 (40 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplementary Figure 1
補足図 1。3 D の単一光子蛍光を用いた胸腺移植の共焦点レーザー顕微鏡のセットアップ レーザー共焦点顕微鏡。(A) Heatpad、脳定位固定装置 headholder およびガスマスクの詳細。(B) は、LSM の胸腺移植を押しマウスを設定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Video 1
ビデオ 1。マウス眼房内でインプラントの胸腺のin vivoイメージングしますしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Video 2
ビデオ 2。想定胸腺胸腺の柔組織 (RFP) に血流 (GFP) から (TSP) 前駆細胞をセトリングの募集しますしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Video 3
動画 3.(初期の胸腺前駆細胞または ETPs) の胸腺皮質の確率的な動きしますしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Video 4
動画 4.(GFP) 胸腺胸腺間質細胞 (RFP) との相互作用、Ctec (皮質胸腺上皮細胞) または mTECs (髄質胸腺上皮細胞).してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Video 5
ビデオ 5。潜在的な成熟した T 細胞のリアルタイム出力イメージングしますしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Supplementary Video
補助ビデオ 1 3 d生体内イメージング胸腺のインプラント マウス眼房内。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

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個々 の免疫能力4 T 細胞の成熟過程の重要性と成熟 T 細胞胸腺2,3プロデュースの前駆細胞の動態の推定の影響のため多大な努力に投資されています。古典的な組織を固定する選択肢を開発するアプローチをスナップショットしました。

研究での使用組織スライスとその他の植が明らかに単分子膜または集計の胸腺器官培養14,15より組織アーキテクチャの再現に優れた、vasculature への接続がない場合に制限、エントリまたは小さじ (血管内皮細胞の境界を越えた前駆細胞の転流) と出口 (血管内皮細胞のバリアを越えて成熟 T 細胞の転流) の臓器からの手順。同様に T 細胞のダイナミクスが他の細胞と接触、仮定、胸腺間質細胞と大脳皮質と髄質内にある微小でその運動を含む決定の分化状態と亜種のプロセス選択 (正と負)2,3,45とこれらのプロセス可能性があります TSP と成熟した T 細胞出口イベントに依存しているので、individual´s への接続を含むモデル血流システムは望ましいでしょう。

胸腺の皮および腎臓のカプセル インプラントこのアップグレード17,18を可能にします。しかし、彼らは TPLSM による体内インプラントの深い位置または上記の移植組織の不透明な層の存在するためのイメージングに課せられた制限と侵襲的方法を構成します。マウス前眼室内には、縦方向に「ウィンドウ」21,22として以前の適応血管胸腺内 T 細胞を追跡するサイトはいくつかの利点を提供していますいくつかの組織のパフォーマンスを監視対他の移植戦略。一側の手術は、縫合も不要、ホスト動物の迅速な回復につながるので簡単です。偶然にも腎カプセル インプラント、同じ動物から繰り返し録音を可能にするため、インプラントの観察他の側に追加手術は必要ではありません。さらに、目の特定の解剖学的特徴は、全身だけでなく、またローカル注入の組織上の規制の入力を簡単に調節するようにします。前述のように、このアプローチでは、物質は目に局所的に適用または、前房内に挿入できます。また、胸腺に直接物質またはセルを導入簡単にオプションを表します (すなわち、前駆細胞や成熟中間前のヴィヴォラベルに対して)、伝統的に非常に複雑な手順をされている。25胸腺の解剖学的位置24,ののため.さらに、前房内の灌流は前述インプラント26の他のタイプを示す蛍光インジケーターと拡散で房の交換またはグラフトの読み込みを許可します。

忠実に胸腺生理学研究を可能にするアプローチは、蛍光に分類されたリンパ球のマーカーを表現する遺伝子組換えメダカの生体イメージングによって提供されます。めだかの開発中に、多くのメダカ系統の人生を通しての透明度はこの生物を21生体内細胞の動態を監視のために有利になります。めだか (29%)18 mouse´s (95%)13, しかし、これらの 2 つの生物の運動速度の違いに加えて参考にみられる運動性胸腺細胞の数が少ないと最小の脊椎動物を寒さに血を示唆している、適応免疫系より高い脊椎動物 T 細胞の成熟のイベントの特定の機械論的動態を明らかに限られている可能性があります。

胸腺移植のサイトとしてマウス眼房内の使用の制限の 1 つはスペースの制限です。長期的な研究は、したがって、侵害、可能性が;拡大成長の可能性と新生児または萌芽期ティッシュのために特にこの意味で、明らかな組織拡大拡大マウス眼 (データは示されていない)、最初の週後インプラント後は、新生児のインプラントまで目の整合性を危険にさらすしていないようが、2 ヶ月後インプラントの状態する必要があります。それにもかかわらず、それが (目商工会議所、腎被膜または真皮) インプラントの組織環境 implant´s の成長に影響を与えるおよび/または血管新生のためのアプローチの妥当性を確立する前に定義されているかどうかを評価する目的のはずアプリケーション。

胸腺のフラグメントの前房内への通路は一部に時折つながりますように角膜に必要な大規模な切開はこのレベルで (データは表示されません)、いじめ、癒しのプロセスに関連付けられている線維化の程度に関連するほとんどの場合。いじめが発生した場合、最小限に干渉下流イメージング手順プロトコルの手順 2.3.6 に注意が求められます。水平レベルで切開を加えるとインプラントもいじめは、動物光景パフォーマンスに大きく影響する必要があります。

組織胸腺目室に収まるようにトリミングの必要性は、器官の解剖学的整合性の変更を必要としないその他の解剖学的部位と比較する場合不利になることが表示されます。それにもかかわらず、腎臓のカプセルのアプローチが、皮質と髄質に示す図 1が T 細胞を再構成することができます、完全に機能する同様な解剖ガイドラインによって得られる両方を含む胸腺の断片を示しています。介した免疫免疫不全 thymeless ホスト18。これは胸腺セグメントのこのタイプのままの機能的特徴を支持して主張しています。また、プロトコル分離の胸腺は、寒さ (ステップ 1.9) で保たれなければならないストレスをここで説明、トリミング直前にインプラント (ステップ 2.3.2) 組織の生着の最適化に向けて冷たい虚血およびティッシュの露出を最小限に抑える。

目および血血しょう、この解剖学的位置で通訳の観測が行われたときに留めておかれる必要がある問題の前房に房水の組成の違いにアプローチの追加の潜在的な制限が存在します。.他の組織に先行研究ただし、ローカル目環境22通常移植機能への明らかな影響を不詳が。ここで示したモデルの経験は少数の個人に制限されています (N = 6, N = 3 受信者とドナーのためのそれぞれ) 現在、インプラントのいずれかで胸腺のインプラントの場合サイトに関連付けられているすべての主要な変更は見られなかった、個人どちらか。

ここで提示されたプロトコルは、マウスの眼球の前房に胸腺組織をはめ込むことによって胸腺細胞ダイナミクスの生体の縦断的イメージングの研究の証拠の原則を構成します。システムの免疫受信者の選択、移植の全身の機能を質問が許可しませんでした。今後の研究がこのアプローチで構築するホストを照射して特定の研究デザインによると (BM) 骨髄移植にかけることによっておよび/または異なるドナーと受信者を選択することによって。たとえば、受信者として SCID (厳しい結合された免疫不全) マウスの選択除去する内因性の T 細胞の干渉 (胸腺インプラントや BM) トランスジェニック マウス ドナーの選択提示 DC マーカー、胸腺 T 細胞マーカーと間質細胞マーカー、.、個別にまたは組み合わせで直接体内細胞の追跡を許可する必要があります。また、前述したように、生体内蛍光 cytolabeling26マウスの前房内の細胞の集団が追跡される可能性が。

ここで提示したモデルの主要な利点の 1 つは、前駆細胞および成熟 T 細胞転流および血管に向かって勉強できるということです。したがって、それは決定後房内に注入されている胸腺の急速に得られた血管新生が内因性血管を繰り返すかどうかに関連する必要があります。この可能性を支持して特筆すべきはマウスの前室で血管新生が受信者と虹彩の血管系への接続ではなく移植18,20によって決定されるみたい内因性胸腺皮質髄質ジャンクション (CMJ) ドメインの整合性を維持する必要があります。

付加的な利点は、同じ個々 の背景 (単一のホスト) のシステムにより、2 つの独立したインプラント (2 前眼室) の評価という事実から来ています。組織の組み合わせを必要とする研究もありますこのシステムに有利であります。

胸腺では、自己免疫疾患および免疫欠損病態に重要な役割を果たしているとは、無数の潜在的な質問に対処するこのアプローチを使用できます。特に、システムで胸腺退縮の進行の内臓器画像に加えて巨視的許可する必要があります。また、移植トレランス イベントや免疫不全関連感染症を研究するに役立つかもしれない。胸腺細胞の成熟を支配するメカニズムの細かい解剖が追加の治療戦略開発 T 細胞をターゲットのデザインに新たな手がかりを提供するそうです。

目の前房に胸腺移植はどちらの目で 45 分未満、新生児胸腺の分離を含む、各ホストのトリミングがインプラントと個々 にかかります。In vivoイメージング録画監視機能によって、1 〜 5 時間が必要です。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は NIH 助成金 R56DK084321 (AC)、R01DK084321 (AC)、R01DK111538 (AC)、R01DK113093 (AC)、R21ES025673 (AC) とベスト/2015/043 グラント サポートされている (Consellería ・ デ ・ Educació、文化会館私 esport、ジャナラリター バレンシア, バレンシア, スペイン) (EO)。サンペドロマルティル山脈バレンシア バレンシア ・ カトリカ大学サン ・ ビセンテ、スペイン、ビデオ撮影・編集のセントロ ・ デ ・危惧プリンシペ フェリペ、バレンシア、スペインでアルベルト ・ エルナンデスに送信チームを著者に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

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References

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<em>生体内で</em>の実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞
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Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

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