Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.
Gösterilmek yöntemin amacı, ilk kez, yeni doğan thymi in vivo boyuna gerçek zamanlı thymocytes´ dinamiği içinde bir bozukluklarına izleme için isogenic yetişkin mice ön göz odasına nakli göstermektir timus kesimi. Ekimi mikroskobu (LSM) kornea ile tarama Lazer vivo içinde noninvaziv tekrarlanan düşsel vasıl hücresel çözümleme düzeyi sağlar. Önemlisi, yaklaşım modelleri görüntüleme önceki intravital T hücre olgunlaşma için aynı hayvan sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kayıtları için olasılığı ekler. Sistem Şeffaflık aşılı çevrenin makroskopik hızlı implante dokusunun izleme izin ek avantajları ve erişilebilirlik için izin implant için ek olarak sistemik tedaviler yerelleştirilmiş. Doku hacmi olmak ana sınırlama lob kırpma için talepleri göz odasının azaltılmış uzayda sığar. Organ bütünlük timus loblar olgun T-hücre üretimi için işlevsel olması için daha önce gösterilen şekillerindeki dissekan tarafından kaplamış. Otoimmünite, immün yetmezlik ve merkezi dayanıklılık içeren tıbben timus fonksiyonu ile ilgili sorular bir ortamın sorguya çekmek için potansiyel olarak uygun bir tekniktir; mechanistically kötü tanımlanmış kalır süreçleri. Thymocyte geçiş, farklılaşma ve seçim rehberlik mekanizmaları ince diseksiyon gelişmekte olan T hücreleri hedefleme roman tedavi stratejileri için götürür.
İntrathymic T-hücre farklılaşma ve T-hücre subpopulation seçimini temel süreçleri geliştirme ve bakım hücre-aracılı bağışıklık omurgalıların1için oluşturur. Bu işlem sıkı bir şekilde organize olaylar ataları kan dolaşımına, hücre çoğalması ve geçiş alımı, zar proteinleri ve büyük programlanmış hücre ölümü alt kümeleri için fark ifade dahil olmak üzere karmaşık bir dizi içerir seçimi. Sonuç olgun T-hücreleri yabancı antijenleri geniş bir spektrum için reaktif öz-peptidler, simge durumuna küçültülmüş yanıt görüntülerken sürümüdür periferik lenfoid organlar bireysel2,3kolonileşmesi hangi sonuna kadar. Anormal thymocyte seçim αβTCR repertuar otoimmün hastalık veya esas olarak kusurları olumlu ya da olumsuz habercisi seçimi, işlemler sırasında sırasıyla türetmek bağışıklık dengesizlik4 yol açar.
Timositleri timus genelinde yönlü geçiş T-hücre olgunlaşma tüm aşamalarında içsel ve birden çok uyaranlara kemokinler, yapışkan-dahil olmak üzere, bir dizi eşzamanlı veya sıralı olarak öngörülen ve hücre dışı matriks (ECM) de-yapışkan protein etkileşimleri3,5. Ex vivo çalışmalar ortaya koymuştur iken iki çalışma sabit dokuların tanımlanmış timik microenvironments5,6, thymocyte göçmen yardımlar için ifade kalıpları ile ilgili kritik bilgi yaygın hale timositleri organ iki histolojik olarak ayrı alanda göç davranışlarını: yavaş Stokastik hareketleri korteks ve medulla7,8,9,10 hızlı, sınırlı hareketliliği , 11 , 12 , 13. artan göç oranları timik pozitif seçim13 ile ilişkilendirmek ve negatif seçim timus yolculuk kinetik uygun belirler hipotezi destekleyen gezinme davranışını ile ilişkili timositleri olgunlaşma. Kendi alaka rağmen thymocyte-stromal hücre etkileşimleri topoloji ve thymocyte hareketliliği arasında organ microenvironments T hücre olgunlaşma sırasında dinamikleri kötü tanımlanmış kalır.
Bugüne kadar gerçekleştirilen en ex vivo çalışmalar fetal eklemek veya timik organ kültürler14,15, dokusu dilimlerin veya nerede thymocyte hareketleri iki fotonlu lazer tarama tarafından görüntülenmiştir sağlam timik lob explants reaggregate mikroskobu (TPLSM)8, intravital bir görüntüleme tekniği mesafe çalışma ve doku uygun olarak 1 mm derinliği görüntüleme sınırlandırılmış maksimum16inceledi. Genişletilmiş kuluçka kez form 3D-yapılarına bağlıdır zahmetli timik organ kültürler aksine, timik dilim tekniği hem de belirli alt kümelerine sağlam timik lob yaklaşım kontrol izni getirilmesi önceden etiketli timositleri yerel doku Mimarlık ortamı içine. Ancak, kan akışı olduğundan yok bu modellerinde, onlar ataları (TSPs) timus parankimi veya olgun T-hücrelerinin timik egression dinamikleri yerleşme timus işe alım sürecinin eğitimi için açıkça sınırlıdır.
Vivo modelleri timik T-hücre olgunlaşma Fizyoloji farelerde incelenmesi için Greftler parçaları veya ya böbrek kapsül17 veya intradermally18içine yerleştirilen tüm organ loblar içerir. Bu seçenekler dokusunun sistemik fonksiyonel engraftment sorguya çekmek için onların yardımcı olsa da, timik Greftler derin içinde hayvan veya opak doku katmanları tarafından kapalı konumunu kullanımları vivo içinde implantlar tarafından incelenmesi için kısıtlar TPLSM.
Gözün ön odası kornea katman saydamlığını sayesinde aşılı herhangi bir doku doğrudan izlenmesi için kolayca erişilebilir bir alan sağlar. Avantajı, Iris tarafından kurulan odası Bankası kan damarları ve otonomik sinir uçları, olanaklı kılmak hızlı revaskülarizasyon ve greft19,20reinnervation zengindir. Dr Caicedo başarıyla anatomik bu alanı bakım ve son21pankreas adacıkları boyuna incelenmesi için kullandı. İşte, bu strateji sadece yerel organ yapısı içinde timositleri dynamics eğitim için geçerli bir yaklaşımı kabul ettiğiniz anlamına gelir, ama aynı zamanda benzersiz olarak vivo içinde yaratıcı işe alım çalışmanın boyuna kayıtları genişletmek için izin verir göstermektedir ve Olgun T-hücre egression adımda fare.
T-hücre olgunlaşma sürecinin bireysel bağışıklık yetkinlik4 için önemi ve öncü hücre dinamikleri üzerinde timus2,3tarafından üretilen olgun T-hücreleri tahmin ediliyor etkisi nedeniyle yoğun çabaları yatırım seçimli-e doğru klasik sabit doku anlık görüntü yaklaşım geliştirmek için.
Dokusu dilimlerin ve diğer explants doku mimari monolayers veya toplama timik organ kültürler<sup…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser NIH hibe R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) ve R21ES025673 (AC) ve en iyi/2015/043 grant tarafından desteklenmiştir (Consellería de Educació, cultura ben esport, Generalitat valenciana, Valencia, İspanya) (EO). Yazarlar gönderilen takım Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, İspanya ve Alberto Hernandez Centro de Investigación Principe Felipe, Valencia, İspanya için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür.
Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
Vannas scissors | WPI | 503371 | |
Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
Scalpel | WPI | 500353 | |
40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |