Summary
ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) の欠乏を生成されます。
Abstract
CRISPR/Cas9 技術が多くの細胞の種類が今のところ、遺伝子デリバリーのゲノム工学を加速し、安定した遺伝子の改変は、NK 細胞の挑戦されています。たとえば、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの伝達の使用 transgene 配信実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスにより NK 細胞を遺伝子組み換えの限られた収量結果になったCas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を使用してプライマリおよび拡張の NK 細胞を人間のゲノムの編集を DNA 法をご紹介します。このメソッドは、NK 細胞における HPRT1 遺伝子 TGFBR2と効率的なノックアウトをできました。RT-PCR のデータを示した遺伝子発現レベルが大幅に低下、代表的な細胞製品の細胞毒性の試金は RNP 変更 NK 細胞 TGFβ により少なく敏感になったことを提案しました。遺伝子組み換え細胞ことができる照射 mbIL21 発現刺激による拡張されたポスト エレクトロポレーション フィーダー細胞。
Introduction
がん免疫療法は、近年進められています。遺伝子組み換えキメラ抗原受容体 (車) T 細胞は、癌免疫療法に正常に展開設計の免疫細胞の優れた例です。これらの細胞は最近に対する治療薬として FDA によって承認された CD19 + B 細胞悪性腫瘍、しかし、成功のいくつかの対象抗原を軸受の病気に限られているところし、免疫の脱出によって故障しやすいがこのような限られた抗原のレパートリーを対象とします。さらに、車の T 細胞は移植片対宿主病同種 T 細胞によって引き起こされるの危険のため自己の T 細胞の使用に注目されています。対照的に、NK 細胞は、抗原非依存性に腫瘍ターゲットを殺すことやがん免疫療法6,7,8,9の良い候補になる GvHD が発生しません。
CRISPR/Cas9 技術は、エンジニア リングの免疫細胞で最近使用されていますが、遺伝子組み換えプラスミドを持つ NK 細胞をリプログラミング常に挑戦されています。これは実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスと遺伝子組み換え NK 細胞4の限定生産を引き起こすレンチ ウイルス、レトロ ウイルスの伝達など DNA 依存的遺伝子配信の難しさによるずっと,9。
多くの自然免疫系細胞、病原体関連分子パターンの受容体の高レベルを表現レチノイン酸誘導性遺伝子私(リグ-私)、外来 DNA の高められた認識を有効にします。遺伝子組み換え10の DNA ベースのメソッドを使用する場合、これらの経路の抑制が NK 細胞の情報伝達効率を有効に。
プライマリと拡張のヒト NK 細胞 Cas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を利用の編集無料の DNA ゲノムを使用する方法をご紹介します。Cas9/結合組換え Cas9 蛋白質複合体 crRNA と tracerRNA から成る合成の単一ガイド RNA との複合体の 3 つのコンポーネントで構成されます。これらの Cas9/結合機能性錯体としての配信のための外国の DNA 依存性アプローチと比較して高効率なゲノムのターゲットを切断が可能です。また、Cas9/結合セルからの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのターゲットをオフの効果を減らす可能性があります。したがって、彼らは、ノックアウト、またはノックを相同組換え6、7の DNA と組み合わせた場合を生成する使用できます。Cas9/結合のエレクトロポレーションを示した NK 細胞で遺伝子組み換えの前の制約を克服する簡単で比較的効率的な方法です。
TGFβ は、主要な免疫サイトカイン、活性化、NK 細胞の機能を阻害します。TGFβ 経路をターゲットで免疫細胞の機能を高めることができると言われています。我々 は TGFβ11.にバインドする TGBR2 外部ドメインをエンコーディング地域を対象と代表の結果は、この遺伝子の発現レベルが大幅に低下を示し、さらに変更された NK 細胞なる TGFβ に耐性を示します。さらに、変更されたセルに保持の生存率、増殖能拡張ポスト エレクトロポレーション照射フィーダー細胞.を使用することは、したがって、次のメソッドがいずれかの NK 細胞を遺伝子操作する有望なアプローチさらに臨床や研究の目的。
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Protocol
健康なドナー バフィー コート素材としてから中央オハイオ州地域米国赤十字社が得られました。この研究は、制度検討委員会の全国小児病院によって免除の研究に決定されました。
1. ヒト NK 細胞精製と拡大
- バフィー コート12から PBMCs を分離します。
- レイヤー Ficoll Paque の 15 mL のバフィー コート サンプルの 35 mL。
- ブレーキなし 20 分間 400 × g で遠心し、インターフェイスから、PBMC を収集します。
- PBS の少なくとも等しいボリュームを追加することによって回復した PBMCs を 3 回洗浄、400 × g で 5 分間遠心分離し、PBC を吸引洗浄します。NK 細胞は RosettesSep13でこの段階で分離することができます。
- 照射 10 x 106 mbIL21-表現で刺激することによって NK 細胞を展開し 0、7、および 14 日フィーダー細胞。メディアを置き換えて 10% を含む新鮮な RPMI 1 %fbs グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシンおよび全体のメディア ボリューム一日おきの IL-2 の 100 IU/mL。
2. gRNA 設計と選択
- 対象に、オンライン ツール、例えばNCBI、アンサンブルを使用して特定のゲノム遺伝子座を選択します。
例を示します。
説明/コントロール: 成長因子 β 受容体 2 (TGFBRR2) の変換外部ドメイン
レコードを表示: PF08917
InterPro を表示: IPR015013
位置: 49 157 aa
目標とされたシーケンス: エクソン TGFBR2 遺伝子 (ENSG00000163513) の 4 - 設計、gRNAs を http://crispr.mit.edu、'Benchling' など CRISPR デザイン web ツールを使用します。
- 手順 2.1で選ばれた DNA シーケンスに入力します。ターゲット ゲノムとして人間 (hg 19) を選択します。CRISPR ガイド (PAM 並びに続いて 20 ヌクレオチド: NGG) 以前に入力シーケンスからスキャンされます。また、選択したゲノム全体オフのターゲット候補を示します。
- 彼らのターゲットに、ターゲットをオフ率に基づいて、最高のスコアを持つ最高の 3 gRNAs を選択します。たとえば、表 1は、対象とするエクソン 4 遺伝子 TGFBR2 の CRISPR デザイン web ツールによって提案された設計 CRISPR Rna を示します。
- 合成シーケンス固有の crRNAs として CRISPR Rna を注文します。
- 保存、注文、crRNA と部分的な相同性を介して対話する RNA (tracrRNA) を transactivating します。
3. デザイン削除プライマーのスクリーニング
- T7E1 突然変異の試金のための gRNA 胸の谷間サイトにまたがるプライマーを設計します。
- SgRNA ターゲット ・ サイトでの小さな挿入・削除 (オクターリピート) のように、予測された胸の谷間サイトから使用プライマー、少なくとも 100 bp は、1.5% の agarose のゲルの突然変異試験を次に表示されます。TGFBR2 外部ドメインを増幅するプライマーを表 2に示します。
4. 人間のプライマリおよび拡張された NK 細胞の情報伝達
注: NK に Cas9/結合要素の伝達は、4 D システムを次のように使用してエレクトロポレーションによって行われます。
-
セル準備
- NK 細胞のため、4 日間 100 IU/mL IL-2 の存在下で RPMI 培地で新鮮単離の NK 細胞をインキュベートし、日 5 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。
- NK 細胞の拡張のため、日 0 1:1 の比率で照射フィーダー細胞と細胞を刺激し、一日 5、6 または 7 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。
- エレクトロポレーションの日 8 ml エレクトロポレーションと加湿の 37 ° C、5% CO2インキュベーターで事前 incubate フラスコ細胞の IL-2 の 100 IU/mL を含む新鮮な RPMI の T25 フラスコを準備します。
注:解凍されたセルまたは 2ndや 3rdの刺激を受けた細胞は、前述の回復後にいつでも electroporated をすることができます。 - 3-4 × 106細胞伝達ミックスの 26 μ L の条件あたりを取る。
注:エレクトロポレーション ソリューションの NK 細胞の非常に高濃度では、伝達率を向上させます。 - 3 回通常 RNase 活性を含むすべての FBS を削除する PBS のセルを洗浄します。8 分の 300 x g でそれぞれの時間をそれらを回しなさい。
注:ない Cas9/結合と 1 つのコントロールと 2 つの gRNAs (gRNA1 gRNA2、gRNA1 gRNA3、gRNA2 + gRNA3) の組み合わせ Ca/結合が 1 つの gRNA (gRNA1、gRNA2、gRNA3) として 7 エレクトロポレーション条件を検討してください。
-
CrRNA:tracerRNA を形成する複雑な/
- 1 x 200 μ M の最終濃度にテ ・ ソリューションでは、crRNAs (gRNA1、gRNA2、および gRNA3)、tracerRNA を再懸濁します。200 μ M tracerRNA表 3に示すように各 200 μ M gRNA のミックス 2.2 μ L。
- 95 ° C、5 分でサンプルを加熱、室温 (15-25 ° C) にベンチの上に冷却すること。ストアは、Rna と crRNA を再停止される: tracerRNA/複合体後で使用のための-20 ° C で。
-
RNP 複合体を形成します。
注:時間を節約する形成 RNP の洗濯物の中に複雑なステップ 4.1.5 。- 単一 crRNA:tracrRNA 二重反応は、表 4の例で示すように、36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼを薄くしなさい。
- CrRNA:tracrRNA デュプレックスの組み合わせの伝達の希釈 36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼの例で示すように、テーブル 5 。
- ピペット チップ、30 以上を旋回しながらゆっくりと crRNA:tracrRNA 二重に Cas9 エンドヌクレアーゼを追加 1 分に s。
- 15 〜 20 分のための部屋の温度で混合物を孵化させなさい。インキュベーション後の混合物を使用する準備ができていない場合、は、使用するまで氷の混合物を保ちます。
-
エレクトロポレーション
- エレクトロポレーション ソリューション P3 に全体の補足を追加し、部屋の温度でそれを維持します。
- P3 主な 4 D エレクトロポレーション ソリューションの 20 μ l ( 4.1.5 のステップからの 3-4 × 106細胞) 細胞ペレットを再懸濁します。ピペッティングしながら気泡を避けるため。
注: セル P3 ソリューションで長い間放置してはなりません。 - すぐに細胞懸濁液に RNP 複合 (ステップ 4.3) の 5 μ L を追加します。
- Cas9/結合/セルに 100 μ M Cas9 エレクトロポレーション エンハンサーの 1 μ L ミックスを追加します。
- エレクトロポレーション短冊 20 μ Cas9/結合/セル ミックスを転送します。
- サンプルがストリップの底をカバーすることを確認するストリップを軽くたたきます。
- 4 D エレクトロポレーション システムを起動し、 EN 138プログラムを選択します。
5. ポスト伝達
- 細胞のストリップで 3 分間休憩をしましょう。
- キュヴェットへ事前釣合い文化メディア 80 μ L を追加し、そっとフラスコにサンプルを転送します。
- 導入後、48 時間は、スクリーニング遺伝子の削除の 5 × 105細胞からゲノム DNA を抽出します。
- ステップ 3.2 Taq DNA ポリメラーゼのキットで設計したプライマーを使用して興味の遺伝子を増幅します。
- PCR 増幅 heteroduplexes T7EI の消化を形成し、37 ° C で T7EI 酵素で 30-60 分間インキュベート製品
注:アッセイは、スクリーニングとは、高速、簡単なを提供します T7EI は、測量アッセイを用いたに比べて電気泳動結果をクリーンアップします。ただし、このメソッドの削除と挿入を検出できません < Cas9 結合実験14(NHEJ) の活動に参加する非相同末端によって生成された 2 拠点。 - 1.5% の消化の DNA を実行 30-45 分、110 V で agarose のゲル 15 分ごとを視覚化するゲル。
- MbIL21 発現と細胞の残りの部分を刺激する 1:1 の比率でフィーダー細胞。
- 刺激後 5 日間は、qPCR を使用して遺伝子発現レベルの RNA を抽出します。
- 以前に報告された12としてカルセイン アッセイを実施します。簡単に言えば、カルセイン AM (例では、3 μ g/mL/1,000,000 DAOY 細胞を用いて) を用いた標的細胞をロードします。NK 細胞の細胞毒性の試金に備える IL2 で一晩休んで (100 IU/mL) プラスまたはマイナス 10 ng/mL 水溶性 TGFβ。NK 細胞は、一晩で休んでいた同じサイトカイン カルセインの試金を実施します。
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Representative Results
エレクトロポレーション効率
Cas9/結合へのエレクトロポレーションを最適化するため、我々 は NK 細胞に GFP を対象とした siRNA とプラスミドの伝達で 16 の異なるプログラムをテストしました。流れの cytometry の試金を認めたEN 138細胞生存率および伝達効率 (35% ライブ GFP 陽性細胞) (図 1 ・図 2) 両方の粒子の割合が最も高い。興味深いことに、Cas9/結合エレクトロポレーションのこのプログラムを使用して効率は高い TGFBR2 mRNA 発現レベル (図 5) で 60% 削減しました。さらに、遺伝子組み換えの NK 細胞が成長して 30 日間、凍結保存 (データは示されていない) に展開します。
突然変異試験
Cas9/結合 gRNA2、gRNA1 + gRNA2 と gRNA3 を含む成功の TGFBR2 外部ドメイン遺伝子ノックアウトが単独で gRNA1 を任意の T7E1 検出オクターリピート (図 3) していません。さらに、図 4は、人間 HPRT1 (ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1)拡張されたヒト NK 細胞商業的使用でのノックアウトを提供 gRNAs 正常に示します。バンド密度測定によると gRNA1 + gRNA2 を使用して比例塩基料金結果 34% バンド TGFBR2 変更 NK 細胞、gRNA3 25%、HPRT 遺伝子の 81% は NK 細胞を変更されました。
レベルの遺伝子発現アッセイ
結果の代表としては、図 5は、mRNA TGFBR2 外部ドメイン、RT-PCR 法を用いて生産に及ぼす Cas9/結合 (gRNA1 + gRNA2) の効果を示します。グラフからわかるように、目標とされた遺伝子の mRNA 発現レベルは有意に減少しました。
細胞毒性
Cas9/結合変更 TGFβ1、DAOY 細胞と共培養細胞で gRNA1 + gRNA2、gRNA2 および gRNA3 をインキュベート後、図 6に見られるように変更されたセルは、一晩メディアで IL-2 があった制御グループと比較すると自分の細胞毒性レベルの任意の有意な減少を示さなかった。この結果は、TGFβ1 や TGFβ1 の耐性を変更されたセルになったショーの存在下で細胞毒性職務を変更 Cas9/結合セルに保持を示しています。
図 1.これらの数字は、EN 138 プログラムを使用して NK 細胞での gfp siRNA とプラスミド DNA の電気穿孔法の有効性を示します。ご覧のとおり、NK 細胞生存率は 77.5% と 35% の生きているセルの GFP 陽性であったです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2 。この図は、生存率および 16 プログラム(DN 100)テスト エレクトロポレーション最適化のための別の効率を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.支出(、) NK で TGFBR2 ノックアウトの Cas9/結合を介した細胞(b) T7E1 突然変異試験によって測定されました。T7E1 酵素を認識し、一致していない DNA を切断します。それぞれの小さなバンド (青い矢印) は、塩基を運ぶ消化の DNA のフラグメントを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4 。Cas9/結合 - を介した T7E1 突然変異試験によって測定される拡張の NK 細胞の HPRT 中断。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5 。CRISPR 内 TGFBR2 外部ドメインの mRNA 発現レベル変更 Cas9/結合 (gRNA1 + gRNA2) によって導入された NK 細胞 RT-PCR 法を用いています。GAPDH は内因性制御遺伝子として使われました。RNA 含量が減少を示します TGFBR2 遺伝子の中断 (± SEM を意味する P 値 < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6. a.Cas9/結合の代表的なサンプルを使用して細胞毒性アッセイを変更 (gRNA1 + gRNA2、gRNA2、および gRNA3) の NK 細胞ショー、TGFβ1 の細胞の一晩インキュベート減らない大幅 DAOY 細胞を溶解する能力を。b.変更された NK 細胞 (gRNA2 および gRNA3) 非変更された NK 細胞、Cas9/RNP と比較すると、TGFβ1 に敏感 (± SEM を意味する)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| gRNA 号 | gRNA シーケンス | 合成 crRNA として注文 | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/ | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/ | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ | |||||
表 1。3 つには、合成 crRNA として TGFBR2 外部ドメインのエクソン 4 を対象とする gRNAs が設計されています。
| TGFBR 2 外部ドメイン プライマー FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 外部ドメイン プライマー REV | 5 GGG CCT ギャグ AAT CTG 猫ったー 3 |
表 2。TGFBR2 外部ドメイン遺伝子を増幅するプライマー
| コンポーネント | 量 (uL) |
| 200 μ M crRNA | 2.2 |
| 200 μ M トレーサー RNA | 2.2 |
| IDTE バッファー | 5.6 |
| 最終製品 | 10 |
表 3。フォーム、crRNA:tracerRNA/200 μ M Rna を用いる複雑な
| コンポーネント | 量 (μ L) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA (ステップ 4.2) から二重 | 2 (200 pmol) |
| Alt R Cas9 エンドヌクレアーゼ (61 μ M 株式) | 2 |
| 総容積 | 5 ul |
表 4。単一 crRNA:tracrRNA 二重反応、36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼを薄くしなさい。
| コンポーネント | 量 (μ L) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA 双方向 (例: gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA 双方向 (例: gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt R Cas9 エンドヌクレアーゼ | 2 |
| 総容積 | 5 Μ L |
表 5。CrRNA:tracrRNA デュプレックスの組み合わせ伝達 36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼを薄くしなさい。
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Discussion
4,9NK 細胞の DNA 依存した変更にチャレンジしております。我々 は、したがって、直接総合的前もって形成されたリボ核タンパク質 (結合) 複合体と Cas9 タンパク質精製タンパク質としてに導入プライマリおよび拡張された NK 細胞8。このメソッドを使用すると、キャップを排除するために実行できましたが、尾行と他の転写と翻訳プロセス開始 RNA ポリメラーゼ II は、DNA 依存性伝達方法に関連付けられている NK 細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。
さらに、報告されたメソッドはここで Cas9/結合、アクティブなエレクトロポレーションの直後、すぐに、ターゲット上の増加、現在のプロトコルにオフターゲット効果を減少して品質が低下として使用浄化された Cas9 タンパク質複合体5,6,7,16. 興味の他の遺伝子に適用可能である別の重要なステップが紹介されていますまたはへと高効率で Cas9/RNP を変換する新しいエレクトロポレーション アプローチを最適化します。このメソッドは、市販より大きいエレクトロポレーション キュベット (データは示されていない) を使用して NK 細胞の多数の変更のスケール アップがあります。
要約すると、上記の記述法を用いた癌免疫療法の人間プライマリおよび拡張された NK 細胞を遺伝的変更に Cas9/結合を使用できます。TGFBR2 外部ドメイン遺伝子の正常なノックアウトは、TGFβ1 耐性11になるこれらの変更された NK 細胞につながることも示した。
相同組換え3,18,19によって部位特異的遺伝子の挿入を有効にテンプレート DNA (当然のことながら recombinogenic アデノ随伴ウイルス (AAV) ドナー ベクトル) などのソースと RNP 配信を組み合わせること.
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Disclosures
DAL は、提供しています/宅配治療や黒曜石治療、Intellia 治療薬、メルク研究所 Miltenyi バイオテックのコンサルタントを務めてし、資本/リーダーシップは、CytoSen 治療。
Acknowledgments
原稿を編集で彼の親切な助けのブライアン ・ トゥッリウス ・を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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