Summary
ホモとスイカと組織採取、データ生成、およびデータ解析の応答性マイクロ Rna の調査のためのメソッドに加えて、ひょうたんの同種および異種接ぎ木を効率的に作るための詳しいプロトコルをご紹介します。
Abstract
マイクロ Rna (Mirna) は内因性小さい非コード Rna 約 20-24 nt、工場開発と適応の重要な役割を果たすことが知られています。移植するときに、特定の Mirna の表現を変更ことを示す蓄積証拠がある一般農家で作物生物的・非生物的ストレス耐性を改善するために使用される農業の練習。ひょうたんは、スイカを含む、後者のための最も広く使用されている台木のいずれかをレンダリングする多く他主要のウリと比較して本質的に気候弾力性のある作物です。高スループット シーケンス技術の最近の進歩は、低温馴化の miRNAs と共台の利点は、彼らの貢献を検討する絶好の機会を提供しています。しかし、適切な実験手順はこの目的のための前提条件です。ここでは、ホモ ・寒さの影響を受けやすいスイカと組織採取、データ生成、およびデータ解析のメソッドに加えて、冷え性のひょうたんの同種および異種接ぎ木を効率的に生成するための詳細なプロトコルを提案する.提示方法、また他の植物移植システム、熱、乾燥、塩分などの種々 の環境ストレス下の miRNA 規制を尋問するに役立ちます。
Introduction
移植くらい採用されている農業技術として作物生産と生物的・非生物的ストレス1,2,3への耐性を向上させる。ことができますエリート台木 heterografting システムで植物の水および栄養素の吸収を高めるため、土壌病原体への抵抗を強化し、金属毒性4、5、強化されたグラフトを与える可能性がありますの負の影響を制限成長活力と環境ストレス耐性が向上します。多くの場合、heterografting はまた改良されたフルーツの味と健康関連化合物6、7の増加のコンテンツにつながる、園芸植物の果実品質を影響します。台木と穂木の植物ホルモン、Rna、ペプチド、タンパク質の長距離転送が機構は、成長と開発のサイオン植物8,9 のリプログラミングを調節することであることがわかった ,10。移植は、長距離シグナル伝達と環境適応11に関連して交通機関の研究で広く使用されています。移植実験は、明確な組織や血管の sap と活性化または信号伝送12のための分子ターゲットの抑制を受信送信される分子検出のため特に強力です。
非コード Rna、RNA が細胞で重要な調節機能を発揮の大きなクラスは、非生物的ストレス13に植物への適応を促進する役割を果たすと報告されています。Mirna が小さい非コード Rna 約 20-24 内因性 nt 研究は植物の活動のさまざまな側面の miRNAs の規制の役割を明らかにした、生長、横ルート形成14,,1516養分吸収、硫酸代謝、恒常性17、およびレスポンスを生物的・非生物的ストレス18。最近では、Mirna とそのターゲット遺伝子発現 heterografted キュウリ苗19ストレス耐塩性に関連していた。ブドウの intervariety の移植、遺伝子依存性20miRNA 式乾燥ストレスに対する応答が見つかりました。
急速な発展と高スループット シーケンス技術のコストの減少は、miRNA の規則農業植物の研究のための絶好の機会を提供しています。スイカ (スイカ地ばい栽培における[について]Mansf.)、世界全域で栽培される重要な cucurbit 作物は低温に敏感であります。ひょうたん (ラゲナリア ヒョウタン[モリーナ] (37) つる割り病.) はより弾力性のある気候 cucurbit スイカを接木する農家で一般的です。現在の研究の主な目的は標準、効率、および同種および異種接ぎ木スイカ (スイカ地ばい栽培における[について] の間を作るための便利な方法を確立するにはMansf。)ひょうたん (ラゲナリア ヒョウタン[モリーナ] (37) つる割り病)。このプロトコルも、詳細な実験手法および分析的手続の次の移植、miRNA の表現の規制を検討 heterografting の利点の基になるメカニズムを明らかにするために便利です。
本研究で使用される植物材料は、スイカの品種とひょうたん在来種もあります。スイカの品種は低温に感受性が高収率で商業品種です。ひょうたん在来種は低温21の優秀な耐性のため、ひょうたん、キュウリ、スイカの接木の人気の台木です。
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Protocol
1. 種子滅菌・発芽
- 表面の殺菌のための水の温度は 40 ° C に落ちるまで、時折かくはん 58 ° C で水で満たされた 500 mL ビーカーにひょうたん種子を浸す
- 一方、ナイロン バッグと、それを殺菌する泥炭土壌の 3 kg を入れてオートクレーブで 120 ° 20 分 C/0.5 MPa。
- 4-5 h ない攪拌しながらより多くのひょうたん種子を浸漬してください。
- 水では、部屋の温度に達すると、種子 2 x の - 蒸留水で 3 x をすすいでください。
- 余分な水気を切ってガーゼ袋で暗闇の中で成長室 28 ° C で発芽する種子を許可します。
- 発芽後滅菌泥炭土を詰めたプラスチック鉢 (直径 6 cm) に種をまきます。
- ひょうたんの苗は、2 つの平面的な子葉を開発している、手順 1.1-1.3 スイカ種子を繰り返します。
メモ: この時間管理は、成功術、穂木及び台木のサイズを一致を確認します。
2. 実生と接木
- 日 (ライト) の間に 28 ° C で、夜の間に 22 の ° C の (暗い) 温度に維持 16 h 光/8-h 暗いサイクル、成長室で苗を生産します。午後遅くに水 1 日 x を追加することによって、苗に水を引きます。
- ひょうたん (台木) の苗は、1 つの真葉期とスイカ (サイオン) の子葉が浮上している (まだ平坦化) するとき、同種および異種接ぎ木をするカット移植法22を使用します。
- スイカ苗の胚軸、子葉の下の 2-3 cm カットし、真のすぐ上のサイトでひょうたんの苗の上部の葉します。
- つまようじを使用して、トリミングされたひょうたんの苗の上部に穴をあけます。トリミングされたスイカ苗を同種および異種接ぎ木をするひょうたんの苗の穴に挿入します。
- ステップ 2.2 に示されるように移植するのに同様の方法を使用します。
注: ヒトと heterografting の組み合わせは作られて同時に常に (図 1) が、この場合、結果は、次の: スイカ/ひょうたん (WB, 共台)、スイカ ・ スイカ (WW、同種)、ひょうたん/bottleひょうたん (BB、同種)。
図 1: 移植の組み合わせと接木の植物構造の図。WB = スイカ/ボトルひょうたん heterografting;WW = スイカ/スイカ homografting;BB = ひょうたん/ボトルひょうたんホモ接木;WB S = サイオン葉、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた;WB-R、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた台木葉を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. postgrafting、風邪の治療管理、サンプリング
- 比較的高い湿度を維持し、7 d 16 h 光/8-h 明暗周期、日 (ライト) の間に 28 ° C、22 ° C の間に温度を維持する環境条件下でのそれらを維持する透明ポリエチレン袋で接ぎ木苗を enwrap、夜 (暗い)。
- 7 日目に透明なポリエチレンの袋を発見します。植物は同じの下で 7-10 日の追加条件を成長させ。
- 健康的な均一な苗を低温処理 (強調) 用と制御 (非強調) の 2 つのグループに分割します。管理グループのため寒さを強調したグループの間、さらに 48 時間同じ成長室 (28 ° C) に苗を残して、手順の説明に従って、明/暗条件での 6 ° c の一定温度で成長室に苗を転送2.1。
- 移植 (図 1) から、穂木と台木の葉をサンプルします。すぐに液体窒素でサンプルを凍結し、使用するまで-70 ° C で保存します。
4. ライブラリの作製と高スループット シーケンス
- 凍結試料を液体窒素で 2 mL の微量遠心チューブに転送します。
- 組織を含む各管にステンレス製ビーズ (直径 5 mm) を追加します。
- 30 のビーズ工場ホモジナイザーを用いた微粉末に組織をホモジナイズしてください s。
- 移植の組み合わせごとに 10 苗から粉砕の等しい量 (0.1 g) を取るし、10 mL の遠心管にそれらをミックスします。Guanidium 塩酸塩試薬 (資材表) を組織重量に対応するメーカーの提案に基づいての適切な量を追加します。
- ゲノム DNA 汚染削除 RNA 無料 DNase I 37 ° C 1 時間で 150 U/mL。
- 合計を決定する RNA の整合性を確保するマイクロキャピ ラリー電気泳動システムの RNA 量数 > 7.0。
注: 凛 > 7.0 は、RNA サンプルの高い整合性します。 - 製造元の指示に従って商業キット (資材表) を使用して小さな RNA ライブラリを準備します。サンプルあたりの総 RNA の 1 μ g を使用開始します。
- ライブラリ正規化試薬、製造元のガイドラインに従ってアダプターを解凍します。5 'と 3' のアダプター分子 Rna を縛ると溶出し、それらを浄化します。その後、逆転写、5 ' 3' 製造元のガイドラインに従う低分子 Rna の結紮と。
- 製造元のプロトコルに従って PCR 増幅を実行します。マイクロキャピ ラリー電気泳動を用いた cDNA ライブラリの量と質を評価します。
- RIN ようにマイクロキャピ ラリー電気泳動システムの RNA ライブラリの 1 μ L を読み込む > 7.0。
- 高スループット シーケンス楽器23を他の場所で説明されているように小さな RNA ライブラリをシーケンスします。
5. miRNA とターゲット遺伝子予測
- 移植の組み合わせごとに質の悪いシーケンスを削除し、生の読み取りからアダプター シーケンスをトリミング オープン ソース UEA スルナ ワークベンチ 2.4 植物版24を使用します。18 より小さいシーケンスを破棄 nt または 32 を超える nt。
- 認識し、rRNA、tRNA、snoRNA、および他の目的の読み取りを削除するオープン ソース Rfam 11.0 データベースへ高品質の「クリーン」シーケンスを比較します。
- 短鎖リード シーケンス配置ツール25を使用して参照ゲノムに残りの読み取りを合わせます。この手順では、不一致は許可されません。
注: スイカ「97103」ゲノム アセンブリ26は、サイオンから読み取りを配置に使用された V1 とひょうたん"HZ"ゲノム アセンブリ V127台木からの読み取りに使用されました。 - オープン ソースの miRBase 22.028で知られている成熟 Mirna に対して残りの読み取りを比較します。相同性の高い既知の miRNAs の読み取りは、保存されている miRNAs に分類されます。
- ゲノム シーケンスと知られている miRNA 前駆体を一致するように失敗するシーケンスを比較します。MIREAP29アルゴリズムを使用すると、既定の設定の下で潜在的な新規 Mirna を検出します。
6. 発現と遺伝子の Ontology 解析
- 自分の読み取りの数に基づいて Mirna の発現レベルを比較します。Mirna のP-値 (フィッシャーの正確なテスト) < 0.05 と絶対ログ2値 > 2 が発現すると考えられています。
- アンチセンス オリゴヌクレオチド ターゲット サイトの選択ツール (TargetFinder)30を使用すると、既定のパラメーターの下で発現の miRNAs に潜在的な相補的な Mrna (miRNA ターゲット遺伝子) を予測します。
- 遺伝子の ontology を使用 (行く) P下パターンを濃縮分析ツール31 miRNA ターゲット遺伝子オントロジー (GO) を明らかにするための統計的な有意性 0.05 の値のしきい値。
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Representative Results
図 2: 常温、冷強調条件様々 な移植の表現型。(、) このパネルとして表示されますホモ ・ heterografted 苗室温コントロール。(b) このパネルは、低温処理の 48 時間後ホモ ・ heterografted 苗を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
組織移植のための 98% の高い成功 (サバイバル) 率を得た記述されているメソッドを使用して。常温、冷強調条件様々 な移植の表現型は、図 2のとおりです。風邪治療の 48 時間後 homografted スイカの植物は homografted ひょうたん植物やスイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木より活発な増殖中予乾の若い葉で明らかな発育を示した。最も低い真の葉が被害を受けた homografted ひょうたん植物をも上回る同種および異種接ぎ木の葉の損傷の症状は認められなかった。これらの結果は、低温耐性を付与に同種および異種接ぎ木の利点を明確に示します。
8 つのライブラリの小さな RNA シーケンス 2 億 5800 万 raw 読み取りの合計をもたらした。品質管理 (QC) 後、約 3000 万一意のシーケンスに対応する 1 億 4600 万の読み取りの合計があった (表 1) を保持します。10 知られている 313 小説 Mirna など 323 の miRNAs は、ひょうたんから予測したし、20 既知および 802 新規 miRNAs は 24 の watermelon.sRNAs から予測されたこのクリーン スルナ シーケンスのセットに基づいて、すべて接ぎ木では sRNAs の最大のクラス成って nt部屋の温度や寒さを強調した状態 (図 3) にかかわらず、組み合わせ。
| 治療 | コード | 違います。読み取り | スルナ | |
| 合計 | ユニークです | |||
| WW CK | 生 | 30612962 | ||
| きれい | 19727501 | 3858868 | ||
| ゲノムにマッピング | 19059359 | 3777952 | ||
| BB CK | 生 | 30845546 | ||
| CK | きれい | 16832061 | 3787866 | |
| ゲノムにマッピング | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | 生 | 39492123 | ||
| きれい | 26783053 | 6319473 | ||
| ゲノムにマッピング | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | 生 | 23763619 | ||
| きれい | 10187791 | 1784447 | ||
| ゲノムにマッピング | 8946929 | 1537867 | ||
| WW CL | 生 | 27557577 | ||
| きれい | 17879038 | 3336242 | ||
| ゲノムにマッピング | 17153763 | 3259960 | ||
| BB CL | 生 | 29780991 | ||
| きれい | 13342206 | 3235570 | ||
| 冷 | ゲノムにマッピング | 12949972 | 3164329 | |
| WB CL S | 生 | 45708415 | ||
| きれい | 23071845 | 4310276 | ||
| ゲノムにマッピング | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | 生 | 30585408 | ||
| きれい | 19029266 | 3541729 | ||
| ゲノムにマッピング | 17364239 | 3196106 | ||
表 1: さまざまな移植常温または低温処理の下で小さい RNAs の統計情報です。
図 3: さまざまな移植で、スルナのサイズ分布を読み取ります。(、) このパネルに表示されます、スルナのサイズ分布をコントロールまたは冷たい条件の下で同種および異種接ぎ木で読み取ります。(b) このパネルは、コントロールまたは低温条件下で移植を読み取り、スルナのサイズ分布を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
風邪治療の 48 h、30 と 268 の miRNAs したアップとダウンレギュ レート、それぞれ、同種および異種接ぎ木の穂木の葉で。これは、台木の葉で結果に鋭い対照、31 されのみ 12 miRNAs アップとダウンレギュ レート、それぞれ (図 4)。西瓜/スイカ移植で 64 と 83 の miRNAs あったをダウンレギュ レート、.ひょうたん/ボトルひょうたん移植でこれらの数が 30、28。どうやら、heterografting は miRNA の表現の深遠なリプログラミングを発生します。40 の生物学的プロセスに分類されると、同種および異種接ぎ木の穂木 78 の濃縮行く条件を識別発現の miRNAs の推定標的遺伝子の移動濃縮分析細胞成分と分子機能に 36 に 2(図 5)。我々 はいくつか知られている囲碁用語/経路キチンの異化プロセス関連インスタンスのために、生物的・非生物的ストレス耐性とシグナル伝達を発見した (行く: 0006030、行く: 0006032)、エチレン活性化シグナル伝達経路 (行く: 0009873)、ポリアミン生合成 (行く: 0006596) とタンパク質リン酸化によるシグナル伝達 (行く: 0009755)、関与していた。組み合わせることで、その標的遺伝子の転写の豊富さをチューニングすることによって、miRNAs のダウンレギュレーションが強化された耐寒性の基礎となる重要なメカニズムを表すことが示唆されました。スイカ/ボトルひょうたん移植、移植の利点を形成する miRNA のパターンに重要な影響が、共台自体。
図 4: さまざまな移植に寒冷ストレスへの応答のアップとダウンレギュ レート miRNAs のパターンの比較。WB S = サイオン葉、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた;WB-R = 台木葉、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた;WW = スイカ/スイカ移植;BB ボトルひょうたん/ボトルひょうたん移植を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 寒冷ストレス負荷時に同種および異種接ぎ木の葉濃縮サイオン発現 miRNAs の推定標的遺伝子の解析を行っています。WB CL S = 風邪の治療の下でスイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木の穂木葉WB CK S = 室温でスイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木の穂木の葉。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでヒトや同種および異種接ぎ木スイカとひょうたんを作る高効率で再現性のある方法で詳しく述べる。特定の機器を必要としない、このメソッドは、操作が非常に簡単で、通常移植の非常に高い生存率を持っています。メソッドは、スイカ、キュウリ、カボチャのように他のウリの移植にも使用できます。
台木と穂木の相対的なサイズ (歳)、成功したグラフト (プロトコルの手順 2.2) をさせることが重要であることに注意する価値があります。我々 は、サイオンと比較して、使用台木が大きすぎて場合接木連合よりフォームにので難しかった御曹司の幹はややくり観察。私たちの以前のプロテオーム データの31に基づき、自己接ぎ木穂木及び台木の接ぎ木自己コントロールとして含めることが強く推奨される (プロトコルの手順 2.3) ために接続し、傷害を移植の衝撃を大きく除去ことができます。
このプロトコルでは、heterografting システムの miRNAs の存在度を調査するために詳細な実験手法と具体的な実験手順を提供するも。このメソッドはまたローカルおよび長距離の miRNA の調節のメカニズムを明らかにする他の植物移植システムの研究に有用であります。代表結果、穂木だけローカル miRNAs または低温度に応答した台木の表現の変更を報告します。蓄積レポートは、表現型の変化を移植関連で長距離小さな RNA 伝送の関与を強調しています。移植と高スループット データ解析法を組み合わせた、ここでは、提示されたプロトコルは、穂木と台木の miRNA 伝送解析の使用もできます。ローカルの miRNAs から差別化転送される miRNAs の原理参照ゲノムをシーケンス類似性に基づいています (すなわち台木のゲノムは、台木から移転するとという御曹司に於いての miRNA とその逆)。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。小さな RNA シーケンス データは GenBank 加入番号 SRP136842 の下に堆積されています。
Acknowledgments
この仕事はの国民プログラム、キー科学プロジェクトの育種 (2016 C 02051)、浙江省、浙江省 (2017 C 32027) の公益研究プロジェクト中国の国家自然科学基金 (31772191) によって支えられました。(P.X.) に一流の若い専門家のサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
