Summary
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er den mest almindelige leukæmi i den vestlige verden. NFAT transkriptionsfaktorer er vigtige regulatorer af udvikling og aktivering i talrige celletyper. Vi præsenterer her, en protokol til brug af kromatin immunoprecipitation (ChIP) i humane CLL celler til at identificere nye mål gener af NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er karakteriseret ved udvidelse af maligne B celle kloner og repræsenterer den mest almindelige leukæmi i de vestlige lande. Fleste CLL patienter vise en indolent løbet af sygdommen samt en anergic Fænotypen af deres leukæmiceller, henviser til en B-celle receptoren ikke reagerer på eksterne stimulation. Vi har for nylig vist, at transkriptionsfaktor NFAT2 er en afgørende regulator af anergy i CLL. En stor udfordring i analysen af rollen, som en transkriptionsfaktor i forskellige sygdomme er identifikation af dets særlige mål gener. Dette er af stor betydning for belysning af patogenetisk mekanismer og potentielle terapeutiske indgreb. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknik til at påvise protein-DNA interaktioner og kan derfor anvendes til at identificere direkte mål gener af transkriptionsfaktorer i pattedyrsceller. Her, blev ChIP brugt til at identificere LCK som et direkte mål gen af NFAT2 i CLL menneskeceller. DNA og tilknyttede proteiner er crosslinked ved hjælp af formaldehyd og efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i DNA fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp). Tværbundet DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er derefter selektivt immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af en αNFAT2 antistof. Efter rensning, er tilknyttede DNA fragmenter fundet via kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berigelse repræsenterer områder af genomet, som er ramt af NFAT2 i vivo. Passende klipning af DNA og udvælgelsen af de påkrævede antistof er særligt afgørende for vellykket anvendelse af denne metode. Denne protokol er ideel til demonstration af direkte samspillet mellem NFAT2 med target gener. Dens store begrænsning er svært at ansætte ChIP i storstilet assays analysere target gener af flere transkriptionsfaktorer i intakt organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) repræsenterer den mest almindelige leukæmi hos voksne i de vestlige lande, udstiller forskellige ophobning af CD19, CD23 og CD5 at udtrykke modne B-celler1. De fleste patienter udviser en indolent sygdomsforløb, som ikke kræver særlig behandling i mange år. Derimod viser nogle patienter hurtig progression kræver øjeblikkelig terapeutiske indgreb med immun-kemoterapi eller andre målrettede behandlinger2,3. Nukleare faktor af aktiverede T-celler (NFAT) er en familie af transskriptionsfaktorer kontrollerende forskellige udviklingsmæssige og aktivering processer i talrige celle typer4,5,6. Vi har for nylig vist overekspression og konstitutionelle aktivering af NFAT2 i CLL celler fra patienter med indolent sygdom7. Her, regulerer det en tilstand til B-celle receptoren stimulation kaldet anergy7. For at vise, at NFAT2 binder sig til lymfocyt-specifikke protein tyrosin kinase (LCK) promotor og regulerer LCK udtryk i menneskets CLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay blev (ChIP) udviklet og ansat.
Chippen er en af de flere teknikker til at undersøge rollen af transkriptionsfaktorer i gen expression8. Genekspression er stramt orkestreret i en meget kompliceret måde af flere tilsynsmyndigheder med transskriptionsfaktorer at tage en uerstattelig rolle i denne proces9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer regulering genekspression i rumlige og tidsmæssige sammenhæng er blevet påvist i talrige arter (f.eks. til udvikling og differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fejl i de indviklede kontrolmekanismer, der involverer transskriptionsfaktorer kan føre til en række forskellige patologiske processer, herunder kræft19,20. Derfor, identifikation af transkriptionsfaktorer og deres respektive mål kunne tilbyde nye terapeutiske muligheder21,22. For at undersøge dette spændende felt fås flere metoder som ChIP, elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA), forskellige DNA pull-down assays og reporter-assays8,11,12, 23 , 24.
For at demonstrere, at en bestemt transkriptionsfaktor interagerer med specifikke områder af genomet er in vivo ChIP en ideel teknik25. Til dette formål, er DNA og tilknyttede proteiner i levende celler krydskædet, ved hjælp af UV-bestråling eller formaldehyd (krydsbundet ChIP, XChIP). Dette trin er udeladt at opnå bedre DNA og protein opsving i den såkaldte native ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser er efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp) og immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af et specifikt antistof mod transkriptionsfaktor af interesse. De tilknyttede DNA fragmenter er derefter renset og karakteriseret ved PCR, kloning af molekylære og sekventering. Alternative teknikker bruge microarrays (ChIP-on-Chip) eller næste generation sequencing (ChIP-Seq) til at analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP blev først indført af Gilmour og Lis i 1984, hvornår de brugte UV lys til kovalent cross-link DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. På celle lysis og immunoprecipitation af bakterielle RNA polymerase, blev specifikke sonder i kendte gener brugt til at tilknytte i vivo fordelingen og tæthed af RNA-polymerase. Metoden blev efterfølgende brugt af samme efterforskerne for at analysere fordelingen af eukaryote RNA polymerase II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysen blev yderligere raffineres af Varshavsky og kolleger, der først bruges formaldehyd cross-linking for at studere sammenslutningen af Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Den NChIP tilgang, der bærer fordelen ved en bedre DNA og protein opsving på grund af naturligt intakt epitoper og derfor større antistof specificitet, blev første gang beskrevet af Hebbes og kolleger i 198831.
Fordel af ChIP i forhold til andre teknikker til at analysere DNA-protein interaktioner er faktisk, at den faktiske samspil af en transkriptionsfaktor kan være undersøgte i vivo og ingen sonder eller kunstige betingelser skabt af buffere eller geler er ansat8,11,12. Ved at kombinere ChIP med næste generation sequencing, kan blive identificeret flere mål samtidig.
Store begrænsninger af denne teknik er den begrænsede anvendelighed for storstilet assays i intakt organismer25. Analyse af differential gen expression mønstre kan også være udfordrende ved hjælp af ChIP teknikker, hvis de respektive proteiner udtrykkes kun på lavt niveau eller under smalle tidsvinduer. En anden potentielt begrænsende faktor er tilgængeligheden af en passende antistof velegnet til ChIP11.
ChIP protokollen præsenteres her kan være ansat i vivo identifikation af target gener af en transkriptionsfaktor ved kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet at identificere nye mål gener af NFAT2 i CLL. ChIP blev valgt på grund af dets potentiale til at direkte vise bindingen af NFAT2 til regionerne promotor af forskellige mål gener under naturlige forhold i CLL patienten menneskeceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter udført med humant materiale blev godkendt af den etiske komité i universitetet i Tübingen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der har bidraget prøver til denne undersøgelse.
1. isolering og Stimulation af Jurkat celler
Bemærk: For at optimere protokollen, bruge linjen Jurkat celle, som er kendt for at udtrykke de høje niveauer af NFAT2. Alle trin er udført under en laminar flow hætte.
- Forberede 50 mL af RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin ved opvarmning til 37 ° C i et vandbad.
- Kultur Jurkat celler for 1-2 d i en celle kultur kolbe på 37 ° C og 5% CO2 i 20 mL af RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin til en massefylde på ca 2 x 106 celler/mL (celler tælles med Trypan blå farvning og en Neubauer afdeling under mikroskop) og høste dem ved centrifugering i 5 min på 200 x g.
- Fjern supernatanten med en pipette og resuspend celler i 10 mL af RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin. Efterfølgende, tælle celler med en konventionel trypan blå farvning og en Neubauer kammer under mikroskop.
- Centrifugeres celler fra trin 1.3 i 5 min på 200 x g og Fjern supernatanten ved aspiration. Derefter resuspend celler med en tæthed på 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin og overførsel 1 mL i en ny konventionel 5 mL tube med pipettering.
- Stimulere cellerne ved at tilføje 32.4 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) og 1 µM ionomycin. Derefter inkuberes celler i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2 med låg af røret åbnet (for at undgå kontaminering, en forsegling film gennemtrængelig for air kan bruges).
2. isolering og Stimulation af primære CLL celler fra menneskelige patienter
Bemærk: Patientprøver var erhvervet og stimuleret som tidligere beskrevet7. Alle trin er udført under en laminar flow hætte.
- Forberede det nødvendige at udgyde blod fra patienter og udføre en tæthed gradient adskillelse udstyr: 21-G nåle, tourniquet, NH4-heparin-blod samling sprøjter (fx S-monovettes), 1 x PBS og tæthed gradient medium (tæthed 1.077 g/mL) .
- Ved venepunktur, trække blodet fra CLL patienter (ca. 40 mL blod per patient) i sprøjter. Derefter overføre blod i 50 mL konisk rør. Vasker sprøjten med 10 mL PBS og pool blod-PBS-suspension i 50 mL rør (justere antallet af rør til mængden af blod).
- Forberede 15 mL af den tæthed gradient medium i en frisk 50 mL konisk slange. Efterfølgende lag 35 mL blod-PBS-suspension omhyggeligt på tæthed gradient medium. Til dette formål, holde røret i en flad vinkel og langsomt afpipetteres blod-PBS-suspension mod bunden af 50 mL konisk tube. Som flere af blod-PBS-suspension akkumulere i 50 mL konisk tube, øge vinklen af røret op til en ret vinkel. Gentag dette trin efter mængden af blod-PBS-suspension.
- Udføre centrifugering ved 560 x g i 20 min. (uden bremser), derefter udtrække fasen mononukleære celler, som indeholder perifert blod mononukleære celler (PBMC). At gøre det, indsamle de hvide interphase tæthed gradient adskillelse med 5 mL serologisk pipette og overføre det til en ny 50 mL konisk slange.
- Fyld cellesuspension til 50 mL med PBS og centrifugeres i 5 min på 360 x g. Fjern supernatanten ved aspiration. Gentag dette trin med centrifugering for 5 min. ved 275 x g. Derefter, pool celler af en patient i 5-10 mL PBS i en 50 mL konisk slange.
- Tælle celler som beskrevet i punkt 1.3.
Bemærk: Det kommer an på andelen af CLL celler i de isolerede PBMC, hvis cellerne kan bruges direkte til denne procedure eller en B-celle isolation skal gennemføres, fx via magnetiske celle sortering (MLA). B-celle isolation anbefales, men kan udelades, hvis andelen af CLL celler er over 95% af samlede lymfocytter (bestemmes via flowcytometri). Blod af CLL patienter er fast og mængden efter fabrikantens anvisninger. Derefter en farvning med CD19-FITC og CD5-PE antistoffer er udført efter fabrikantens anvisninger og cellerne analyseres via flowcytometri. En eksemplarisk patient er vist i figur 1, hvor andelen af CLL celler er 89.03%. Således har en B-celle isolation skal udføres i denne patientgruppe. Andelen af fysiologiske B-celler er ubetydelig (3,72% i eksemplet). - Cellerne vaskes med 10 mL af pre varmede (37 ° C) RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat og 50 mM β-mercaptoethanol i 5 min på 200 x g og Fjern supernatanten ved aspiration.
- Justere celler til 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat og 50 mM β-mercaptoethanol (37 ° C) og fyld 1 mL af cellesuspension ind i et 5 mL rør.
Bemærk: ß-mercaptoethanol er ansat til at modvirker oxidativt stress. - Stimulere cellerne ved at tilføje 32.4 nM PMA og 1 µM ionomycin. Derefter inkuberes celler i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2 med låg af røret åbnet (for at undgå kontaminering, en forsegling film gennemtrængelig for air kan bruges).
Bemærk: For at mindske stress cellerne kan være udhvilet i 1 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i inkubator før 16t stimulation.
3. fiksering, celle Lysis og kromatin klipning
Bemærk: Patientprøver og Jurkat celler er fast og mængden med en kommercielt tilgængelig ChIP kit ifølge producentens anvisninger med ændringer som beskrevet tidligere7. Fiksering er udført under en laminar flow hætte.
- Forberede en 1,5 mL rør med 1 mL 37% formaldehyd, et 1,5 mL rør med 1 mL af 1,25 M Glycin, 5 mL tube med 4 mL 1 x PBS og en kasse med is til fiksering af cellerne.
- Efter stimulation af celler til den respektive inkubationstiden taktfast 1,5 eller 2.9, spin 5 mL rør på 200 x g i 5 min og resuspend celler i 500 µL af PBS i 5 mL rør.
- Tilføje 340 µM formaldehyd (13,5 µL af 37% formaldehyd) til cellerne. Inkuber suspension for 2,5 min (Jurkat celler) eller 5 min (patient eksempel) ved stuetemperatur efter korte blanding af omhyggeligt pipettering op og ned.
Bemærk: Langvarig fiksering tid er nødvendig for primærelementer at sikre optimal klipning. - Tilføj 125 mM glycin (57 µL af 1,25 M Glycin) for at stoppe optagelsen og inkuberes i en anden 5 min. sætte celler på is straks derefter, og der centrifugeres 500 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved aspiration.
- Cellerne vaskes to gange med 1 mL iskold PBS på 200 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten hver gang ved aspiration.
Bemærk: Efter fiksering, protokollen kan stoppes midlertidigt. Fast celler skal opbevares ved-80 ° C. For at teste, hvis epitop antistof beregnet til brug i følgende protokol ikke er maskeret via fiksering, kan supplerende prøver anvendes til analyse via gelelektroforese SDS-PAGE og Western blot. Disse trin udføres med 100 µg protein ifølge producentens anvisninger. Alle αNFAT2 antistoffer bruges på en fortynding af 1:1000, GAPDH antistof i en fortynding på 1: 10000. Et eksemplarisk billede af faste prøver fra Jurkat celler med passende og upassende antistoffer er vist i figur 2. - Resuspenderes celle i 5 mL af kommercielt tilgængelige lysisbuffer 1 af pipettering op og ned. Derefter placere prøverne på isen på en shaker og Inkuber dem i 10 min. mens ryste.
Bemærk: Før lysis, cellerne kan blive opløst for 10 s i flydende kvælstof. Dette er nyttigt for Jurkat celler, men bør undgås i primære patientprøver. Opløsning, skal du lægge 5 mL rør for 5 s i 5-10 mL flydende kvælstof i en særlig beholder. Bære sikkerhedsbriller og egnede beskyttelseshandsker. - Efterfølgende, centrifugeres rør ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten omhyggeligt af pipettering.
- Homogeniseres celler i 5 mL af kommercielt tilgængelige lysisbuffer 2 af pipettering op og ned og inkuberes i 10 min. på køl mens ryste. Derefter centrifugeres rør ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten omhyggeligt af pipettering.
- Resuspenderes celle i 500 µL (Jurkat celler) eller 140 µL (patientprøver) for klipning buffer 1 indeholdende 1 x protease inhibitor (5 µL eller 1,4 µL, henholdsvis), og der inkuberes blandingen i 10 min på is.
- For kromatin klipning, overføre 140 µL af cellesuspension fra trin 3,9 til sonikator rør (undgå producerer luftbobler og Gentag dette trin, hvis nødvendigt på grund af prøve volumen). Sted rør i den fokuserede ultra-sonikator ved en temperatur på 7 ° C og shear for 10 min (cellelinje) eller 7,5 min. (patientprøver) med en gennemsnitlig hændelse magt 9.375 W at opnå 200-500 bp DNA fragmenter.
- Endelig, centrifugeres ved 15700 x g i 10 min. ved 4 ° C i den lille centrifuge og indsamle supernatanten i en ny 1,5 mL tube.
- For at teste for passende fragment størrelser, analysere 20 µL af den afrevne kromatin via gel-elektroforese i 1,5% TBE-agarosegel. Et eksemplarisk billede af afrevne kromatin fra Jurkat celler i gode og dårlige kvalitet er vist i figur 3. På dette punkt kan i protokollen være potentielt midlertidigt. Afrevne kromatin bør opbevares ved-80 ° C.
4. kromatin Immunoprecipitation
Bemærk: Kromatin immunoprecipitation blev udført med en kommercielt tilgængelig ChIP kit ifølge producentens anvisninger med ændringer7.
- Beregne antallet af immunoprecipitations (70 µL (Jurkat celler) eller 15 µL (patientprøver) af afrevne kromatin plus et antistof) og forberede 20 µL af protein A belagte perler per nedbør i en 1,5 mL tube. Vaske perlerne i 40 µL 1 x ChIP buffer 1 pr. udfældning af pipettering op og ned, lad perlerne hvile i et magnetisk rack for 1 min og Fjern supernatanten ved pipettering. Udføre dette trin fire gange i alt. Til sidst, resuspend perlerne i det oprindelige bind med 1 x ChIP buffer 1.
- For immunoprecipitation, sig selv, skal du bruge 10 µg αNFAT2 antistof (7A6) til at fange NFAT2 med sine bundne target sekvenser. Bruge 2,5 µg en kanin IgG antistof (DA1E) som en IgG-kontrol. Forberede reaktioner i frisk 1,5 mL rør, som angivet i tabel 1.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge et monoklonalt antistof med høj affinitet hvis epitop ikke er maskeret under fiksering til denne protokol. Polyklonale antistoffer indføre et ekstra niveau af variation gør det betydeligt sværere at korrekt fortolke de modtagne resultater. - Inkuber blanding fra trin 4.2 natten over ved 4 ° C på et roterende hjul på 6 rpm.
- På næste dag spin rør for 5 s på 7.000 x g i den lille centrifuge, inkuberes dem i en magnetisk rack for 1 min og Fjern supernatanten ved aspiration. Vaske perlerne én gang med hver af vask buffere 1, 2, 3 og 4 fortløbende.
- At gøre det, resuspend perlerne i 350 µL af wash buffer og Inkuber dem i 5 min. ved 4 ° C på et roterende hjul på 6 rpm.
- Derefter, dreje rør for 5 s på 7000 x g i den lille centrifuge. Derefter placere dem i 1 minut i en magnetisk rack, Fjern supernatanten og tilføje den næste wash buffer.
- Efter den sidste vask trin, Fjern supernatanten ved pipettering, tage op perler i 100 µL af eluering buffer 1 og Inkuber dem i 30 min. på et roterende hjul på 6 rpm.
- Spin rør kort (5 s på 7000 x g i den lille centrifuge) og placere dem i en magnetisk rack for 1 min.
- Derefter overføre supernatanten ved pipettering til en ny 1,5 mL tube og tilføje 4 µL af eluering buffer 2.
- Hvis du vil oprette kontrolelementet input, mix 1 µL af den afrevne kromatin med 99 µL af eluering buffer 1 og 4 µL af eluering buffer 2 (i denne opsætning, der er tre reagensglas pr. patient: et input kontrol, en IgG-kontrol og en αNFAT2 prøve).
- Inkuber prøver for 4 h ved 65 ° C og 1300 rpm i en 1,5 mL tube shaker. Tilsæt 100 µL af 100% isopropanol, vortex og spin prøver for 5 s på 7000 x g i den lille centrifuge.
- Resuspend de tilgængelige magnetiske perler af grundigt vortexing, tilføje 10 µL af perlerne til hver prøve og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur på en roterende hjul på 6 rpm.
- Efter inkubation, spin rør for 5 s på 7000 x g i små centrifugeres og placere dem i 1 minut i en magnetisk rack. Fjern supernatanten ved aspiration.
- Resuspend perlerne i 100 µL af wash buffer 1. Invertere rør for at blande og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur på en roterende hjul på 6 rpm.
- Spin rør for 5 s på 7000 x g i den lille centrifuge, placere dem i 1 minut i en magnetisk rack og Fjern supernatanten ved pipettering. Gentag trin 4.13-4.14 med vaskebuffer 2.
- Efterfølgende fjerne wash buffer ved aspiration, resuspend perlerne i 55 µL af eluering buffer og Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur på den roterende hjul på 6 rpm at eluere udfældet DNA. Endelig, spin rør for 5 s på 7000 x g i den lille centrifuge, placere dem i 1 minut i en magnetisk rack og overføre supernatanten til nye 1,5 mL rør.
Bemærk: Her i protokollen kan være potentielt midlertidigt. Eluted DNA skal derefter opbevares ved-20 ° C.
5. påvisning af NFAT target gener i CLL celler.
- Gennemføre qRT-PCR reaktionen i duplikat for hver prøve, som angivet i tabel 2.
Bemærk: Til påvisning af target gener en kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) udføres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig qRT-PCR blanding med en Real-time PCR instrument. - Brug hvid 96-brønd reaktion plader til reaktionerne og RT-PCR-instrument. Cykling betingelserne er som følger: 95 ° C til 30 s, [95 ° C til 5 s, 60 ° C i 30 s] x 40 cyklusser.
Bemærk: En seriel fortynding af input (ufortyndet eller fortyndet 1:10, 1: 100 og 1:1000 i nukleasen-gratis vand) bruges til at beregne den relative berigelse. I Jurkat celler, blev IL-2 brugt som en positiv kontrol32. CD40L, velkendte mål for NFAT2 i B-celler, blev brugt som positiv kontrol i CLL celler og LCK som et eksempel for en roman target-gen af NFAT2 CLL33,34. Primere for CD40L, IL-2 og LCK promotor-regionen er beskrevet i tabellen med specifikke reagenser og udstyr.
6. normalisering og dataanalyse
Bemærk: Relative berigelse for regionerne promotor af interesse (IL-2, CD40L eller LCK) beregnes ved hjælp af kontrolelementet IgG til normalisering.
- Første, fastslå Ct (tærskel cyklus) værdier for input seriel fortynding, IL-2, CD40L og LCK promotor-regionen via evalueringssoftware fra qRT-PCR data.
- Definere en standardkurve for koncentrationer via seriel fortynding af input. Med denne standardkurven beregnes koncentrationen til IL-2, CD40L og regionen LCK promotor for hver to eksemplarer af hver prøve.
- Næste, beregne middelværdien af dubletter. Angiv derefter IgG immunoprecipitation prøven som en reference. Definerer den relative berigelse for denne prøve som 1,0 og sammenligne andre prøven (fra NFAT2 immunoprecipitation) på denne reference.
- Endelig, beregne den relative berigelse ved at dividere koncentrationen af prøverne af koncentrationen af IgG reference.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en eksemplarisk flow flowcytometri analyse af en CLL patienten udført efter farvning med FITC CD19 og CD5-PE antistoffer. Figur 1a viser gating af lymfocytter, der repræsenterer størstedelen af celler i blodet hos CLL patienter. Figur 1b viser andelen af CD19+/CD5+ CLL celler, der udgør 89.03% af lymfocytter i dette eksempel. Andelen af CD19+/CD5- B-celler er 3,72% i de respektive patienten.
Figur 2 viser eksempler på antistof ydeevne i Jurkat celler fast til forskellige tidsperioder som vurderet af SDS-PAGE og Western Blot. Forskellige antistoffer fra forskellige producenter blev analyseret. Figur 2a viser udførelsen af αNFAT2-antistof (klon 7A6) fra forskellige producenter fundet med en grøn fluorescerende anti-mus antistof. Antistof af fabrikanten 1 viste binding til sin epitop uden fiksation (band A) og selv når Jurkat celler blev fastsat til 2,5 min eller 5 min (band B eller C, henholdsvis). Den αNFAT2-antistof (klon 7A6) fra producenten 2, på den anden side viste en svagere ydelse selv i Jurkat celler ikke fast (band D). Efter fiksering opnåede antistof af denne producent endnu svagere resultater (bands E (2,5 min fiksering) og F (5 min fiksering)). Figur 2b viser udførelsen af αNFAT2-antistof (klon D15F1) fra en anden producent opdaget med et rødt fluorescerende antistof, anti-kanin. Dette antistof optrådte også svagt i ikke fastspændte prøver (band A) og fraværet af et band angiver maskering af dets epitop af fiksering (bands B (2,5 min fiksering) og C (5 min fiksering)).
Figur 3 viser eksempler på vredne kromatin fra Jurkat celler fremstillet efter forskellige fiksering og klipning gange af god og dårlig kvalitet, som bedømt af gel elektroforese. Bands A og B (0 min fiksation eller 2,5 min fiksering, henholdsvis) Vis god kvalitet forskydes kromatin, som er karakteriseret ved en DNA fragment størrelse på 200-500 bp, der kan blive opdaget på en agarosegel som en typisk smear. Afrevne kromatin af dårlig kvalitet, på den anden side kan genkendes af fuldstændig eller næsten fuldstændig fravær af den forventede DNA smear (band C) samt en smøre i en større eller mindre end forventet fragment størrelsesområde (bands D-F). Den fuldstændige mangel på smøre angiver brugen af utilstrækkelig mængder starter materiale. Påvisning af små DNA fragmenter tips til overdreven DNA klipning (band E) mens større DNA fragmenter antydning til utilstrækkelig klipning.
Figur 4 viser resultaterne af en typisk eksperiment med Jurkat celler. LCK blev analyseret som en potentielt NFAT2 mål. IL-2 , som er et veldefineret mål gen af NFAT2 i T-celler blev anvendt som positiv kontrol. En IgG-kontrol antistof blev udnyttet til normalisering. Figur 4a viser et eksperiment med optimale resultater dokumenteret af betydelig berigelse af IL-2 positiv kontrol. Fra dette eksperiment, kan det konkluderes, at der er en stor berigelse af LCK sekvenser i det udfældede DNA viser at LCK er en direkte NFAT2 mål i Jurkat celler. Figur 4b viser et eksperiment udført med dårlig kvalitet DNA på grund af manglende fiksation eller en suboptimal klipning procedure forårsager en lav grad af berigelse i IL-2 positiv kontrol.
Figur 5 viser resultaterne af et eksperiment udført med primære CLL menneskeceller. CD40L , som er en kendt NFAT2 målet i B celler fungerede som positiv kontrol og LCK blev analyseret som eksperimentelle mål. Fig. 5a viser et eksperiment med en betydelig grad af berigelse af CD40L DNA i den positive kontrol. Fra den endnu stærkere berigelse af LCK DNA, kan det konkluderes, at LCK er også en direkte NFAT2 mål i primære CLL menneskeceller. Figur 5b viser et eksperiment udført med dårlig kvalitet DNA mest sandsynligt på grund af utilstrækkelig klipning. Ingen væsentlig berigelse af CD40L DNA kunne påvises i den positive kontrol rendering eksperimentelle data meningsløs.
Figur 1: eksemplarisk Flow flowcytometri analyse af CLL patienter. a prøver af CLL patienter blev analyseret via flowcytometri efter farvning med FITC CD19 og CD5-PE antistoffer og lymfocytter var gated. b efterfølgende, at andelen af CD19+/CD5+ CLL celler og CD19+/CD5- B-celler blev fastsat. Her, CD19+/CD5+ CLL celler 89.03% af lymfocytter, mens CD19+/CD5- B-cellerne repræsenterer 3,72% af lymfocytter. En eksemplarisk patient er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på antistof ydeevne i fast Jurkat celler vurderes af SDS-PAGE og Western-skamplet. (a) Jurkat celler blev fastsat til 0 min (bands A og D), 2,5 min (bands B og E), eller 5 min (C og F) og αNFAT2-antistof (klon 7A6) fra forskellige producenter (bands A-C = producent 1, bands D-F = producent 2) blev sammenlignet. Antistof af fabrikanten 1 viste en bedre samlede resultater, bindende med højere affinitet selv til faste prøver (Sammenlign bands A-C og bands D-F). (b) αNFAT2-antistof (klon D15F1) fra en anden producent blev brugt. Dette antistof viste kun en dårlig præstation i ikke fastspændte prøver (band A) og epitop var maskeret efter fiksering. Derfor kan ingen binding af antistoffet påvises efter fiksering (bands B og C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempler på kromatin af god og dårlig klipning kvalitet fra Jurkat celler vurderes af gelelektroforese. Jurkat cellerne var fast og forskydes til forskellige tidsperioder. Fiksering var gjort for 0 min (bands A og D), 2,5 min (bands B og E), eller 5 min (C og F). Klipning blev udført enten i 10 min (bands A-C) eller 20 min (bands D-F). Kromatin af god klipning kvalitet er karakteriseret ved en DNA fragment størrelse på 200-500 bp, der kan blive opdaget som en smøre i de respektive region (bands A og B). Kromatin af dårlig kvalitet kan genkendes enten ved en fuldstændig eller næsten fuldstændig fravær af DNA smøre på grund af en utilstrækkelig mængde af start anvendte materiale (band C) eller af en smøre i et mindre eller større størrelse region på grund af upassende klipning betingelser ( bands D-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ChIP i Jurkat celler vurderes af qRT-PCR. (a) NFAT2 binder til LCK og IL-2 initiativtager i Jurkat celler. Den relative berigelse af LCK og IL-2 promotor regioner fældet med NFAT2 antistof er vist som analyseret af qRT-PCR. Tre uafhængige ChIP-eksperimenter er vist som betyder ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). b DNA fra prøver med dårlig kvalitet afrevne kromatin blev brugt. Ingen relevante bindingen af NFAT2 til target sekvenser der kunne påvises. Et tilsvarende billede kan påvises, hvis der var ingen bindingsperiode eller inkubationstiden med NFAT2 antistof var utilstrækkelig. Tre uafhængige ChIP-eksperimenter er vist som betyder ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ChIP af primære CLL menneskeceller vurderet af qRT-PCR. (a) NFAT2 bindes specifikt til LCK og CD40L initiativtagerne i primære CLL menneskeceller fra patienter med en indolent løbet af sygdommen. Diagrammet viser den relative berigelse af LCK og CD40L promotor regioner fældet med NFAT2 antistof som analyseret af qRT-PCR. Tre uafhængige ChIP-eksperimenter er vist som betyder ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). b DNA fra patientprøver med dårlig kvalitet afrevne kromatin blev brugt. Ingen binding af NFAT2 til de respektive mål sekvenser kunne observeres. Tre uafhængige ChIP-eksperimenter er vist som betyder ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001) venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| varen | volumen (µL) pr. IP |
| 5% BSA | 6 |
| 100 x protease hæmmer | 3 |
| 5 x ChIP buffer 1 | 56 |
| afrevne kromatin | x (15 µL eller 70 µL) |
| Protein A belagt magnetiske perler | 20 |
| ChIP seq grade vand | 185-x-y |
| antistof (αNFAT2 eller IgG-kontrol) | y (1,09 µL eller 1 µL) |
| i alt | 270 |
Tabel 1: tidsplan for pipettering kromatin immunoprecipitation. Kromatin immunoprecipitation blev udført ved at udarbejde reaktionerne, som angivet i tabellen.
| varen | volumen (µL) pr. qRT-PCR |
| immunoprecipitated DNA | 9 |
| qRT-PCR Mix | 10 |
| primer frem (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| primer omvendt (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| i alt | 20 |
Tabel 2: tidsplan for pipettering qRT-PCR. QRT-PCR blev udført ved at udarbejde reaktionerne, som angivet i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin for at udføre en vellykket ChIP assay er udvælgelsen af en passende antistof og optimering af kromatin klipning proces25. Udvælgelsen af αNFAT2 antistof viste sig for at være særligt udfordrende under udviklingen af denne protokol. Mens der er flere αNFAT2 antistoffer kommercielt tilgængelige, og fleste af disse virker fint for western blotting og andre programmer, var klon 7A6 den eneste antistof, som med held kan anvendes til ChIP7. Selv angiveligt udstillet identiske 7A6 antistoffer fra forskellige producenter betydelige forskelle med hensyn til deres performance i ChIP. En stor udfordring er den potentielle afbrydelse af target protein epitoper af fiksering processen, der bruges i XChIP protokoller25.
Kromatin klipning procedure er også afgørende for at opnå passende resultater i XChIP. En fragment størrelse på 200-500 bp fandtes vurderet ved agarosegelelektroforese gelelektroforese for at være optimale i denne NFAT2 ChIP protokol7. Upassende klipning forhold resulterer i en mangel på DNA starter materiale eller DNA fragmenter af større eller mindre størrelse typisk føre til suboptimale resultater, når du udfører denne analyse. Suboptimal klipning blev også observeret ved brug af frosne og rethawed PBMC. derfor, optøning af PBMC resulterede i et lavere udbytte af DNA fra celler samt en stigning i overdreven klipning af DNA-fragmenter.
Tilgængeligheden af en bred vifte af ChIP kits og ChIP-grade antistoffer er udfordrende, men tilbyder også muligheden for at bruge teknikken i en bred sammenhæng. Således, en mangfoldighed af transkriptionsfaktorer kan undersøges i forskellige celletyper. For eksempel, er andre medlemmer af familien NFAT (NFAT1 og NFAT4) blevet undersøgt for nylig ved hjælp af ChIP35,36,37.
ChIP kit bruges her skulle også ændres, så de passer til vores behov. Først, tidspunktet for fiksering var justeret at undgå maskering af epitop genkendes ved den anvendte antistof og give optimale klipning. Mængden af buffere anvendes til lysis og klipning blev også ændret for at reducere tab af celler i forskellige vaske trin. Derudover var klipning betingelserne optimeret for at få DNA fragmenter i intervallet 200-500 bp. Protease-hæmmer og IgG-kontrol antistof blev udvekslet med andre kommercielt tilgængelige reagenser, som de viste sig for at være sammenlignelige og mere omkostningseffektiv. Det skridt, der involverer Flyselskabet fra producenten var udeladt da det blandede sig med udfældning af DNA. I sidste ende, blev mængden af buffer, der bruges til elueres DNA tilpasset for at give en tilstrækkelig mængde til at blive brugt i qRT-PCR.
Der er flere andre kits til rådighed fra forskellige virksomheder og der er også mulighed for at udføre ChIP uden et kit. Men test og etablering er meget udfordrende, da der er mange faktorer at blive betragtet som kompatibilitet af analyseret celler og proteiner med forskellige fiksering og klipning metoder. De nævnte kit blev brugt som det var veletableret i vores laboratorium.
En væsentlig begrænsning af denne metode er dens begrænset anvendelighed til de omfattende undersøgelser i intakt modelorganismer fordi passende antistoffer skal være identificeret eller genereret for hver enkelte transkriptionsfaktor. Analyse af gener, der udtrykkes kun på lavt niveau, i et lille antal celler eller under et begrænset tidsvindue kan også være udfordrende ved hjælp af ChIP.
ChIP er guldstandarden til at demonstrere en direkte interaktion med en given transkriptionsfaktor med dens respektive mål gener i intakt eukaryote celler25, er der en række andre teknikker til at undersøge interaktion mellem proteiner og DNA . EMSA er en nyttig metode til at registrere lav-overflod DNA-bindende proteiner i cellen lystates24. Det kan også bruges til at karakterisere bindende affinitet af et bestemt protein gennem en systematisk DNA sonden mutationsmønstre analyse. En stor fordel af EMSA i forhold til ChIP er, at det er generelt væsentligt mindre tidskrævende at etablere de respektive assay. DNA pull-down assays, mikrotiterplade opsamling og registrering af assays og reporter assays er andre teknikker til at analysere protein-DNA interaktioner23.
Nyere udvikling har gjort det muligt at anvende ChIP assay genome-wide tilgange ved kombination med microarray teknologi (ChIP-on-chip)38,39,40 eller næste generation sequencing (ChIP-Seq )41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af DFG give MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe give 111134 (begge tildeles M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for fremragende teknisk bistand).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).
