Summary
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.
Abstract
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מאופיין על-ידי ההרחבה של תא B ממאיר שיבוטים ומייצג הלוקמיה הנפוץ במדינות המערב. רוב החולים CLL הצג מסלול indolent של המחלה, כמו גם של פנוטיפ anergic של תאים לוקמיה שלהם, בהתייחסו קולטן תא B להגיב גירויים חיצוניים. אנחנו לאחרונה הראו כי הגורם שעתוק NFAT2 מווסת מכריע של anergy ב- CLL. האתגר העיקרי בניתוח של התפקיד של פקטור שעתוק במחלות שונות הוא הזיהוי של הגנים שלו ביעד מסוים. זה משמעות רבה עבור הבהרה של מנגנונים pathogenetic והתערבויות טיפוליות אפשריות. כרומטין immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה קלאסית להפגין אינטראקציות חלבון-DNA ו, לכן, ניתן להשתמש לזיהוי גנים היעד הישיר של גורמי שעתוק בתאי יונקים. כאן, שבב שימש כדי לזהות LCK גן היעד הישיר של NFAT2 בתאי CLL אדם. ה-DNA, חלבונים הקשורים תפור באמצעות פורמלין, לאחר מכן לכסנתם על ידי sonication לחלקים הדנ א של 200-500 בסיסי זוגות (bp). שברי DNA צולבים המשויך NFAT2 נארזים בצורה סלקטיבית immunoprecipitated של שאריות תאים באמצעות נוגדן αNFAT2. לאחר טיהור, שברי DNA המשויך מזוהים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). רצפי DNA עם העשרה ניכר מייצגים אזורים בגנום אשר מיועדים על-ידי NFAT2 ויוו. ההטיה המתאימה של ה-DNA, הבחירה של הנוגדן נדרש מכריעים במיוחד עבור היישום המוצלח של שיטה זו. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור ההדגמה של אינטראקציות ישיר של NFAT2 עם גנים היעד. הגבלה העיקרי שלה הוא הקושי להעסיק. את השבב של מבחני בקנה מידה גדול לנתח את הגנים היעד של מספר גורמי שעתוק אורגניזמים שלמים.
Introduction
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מייצג הלוקמיה הנפוץ ביותר אצל מבוגרים במדינות המערב, מפגין ברורים הצטברות CD19 CD23, CD5 לבטא בוגרת B תאים1. רוב המטופלים התערוכה קורס מחלת indolent, אשר לא מחייבים טיפול מיוחד במשך שנים רבות. לעומת זאת, חלק מהחולים מראים התקדמות מהירה המחייבים התערבויות טיפוליות מיידית עם החיסון-כימותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים,2,3. גרעיני גורם של תאי T מופעל (NFAT) היא משפחה של גורמי שעתוק השליטה התפתחותיים שונים ותהליכים הפעלה5,4,סוגי תאים רבים6. אנחנו לאחרונה הפגינו ביטוי והפעלה החוקתי של NFAT2 בתאי CLL מחולים עם מחלת indolent7. . כאן, זה מסדיר מצב לא להגיב כדי גירוי קולטן תא B נקרא anergy7. כדי להדגים NFAT2 נקשר חלבון ספציפי לימפוציט טירוזין קינאז (מזל) האמרגן ומסדיר LCK ביטוי בתאי CLL אדם, וזמינותו immunoprecipitation כרומטין ספציפי (ChIP) פיתח, המועסקים.
השבב הוא אחד מספר טכניקות כדי לחקור את התפקיד של גורמי שעתוק גנים ביטוי8. ביטוי גנים הוא הדוק בניצוחו בצורה מאוד מורכב הרגולטורים מספר עם גורמי שעתוק לוקח תפקיד מיוחד במינו זה תהליך9,10,11,12. זוהו גורמי שעתוק ויסות בביטוי הגן בהקשר יכולות רבות מינים (למשל, עבור פיתוח ובידול)13,14,15, 16,17,18. שגיאות במנגנוני הבקרה מורכבים המערבים גורמי שעתוק יכול להוביל מגוון תהליכים פיפטות כולל סרטן19,20. לפיכך, זיהוי גורמי שעתוק, המטרות המתאימות שלהם עשויים להציע הרומן השדרות טיפולית21,22. כדי לחקור את שדה מסקרן זה מספר שיטות זמינים כמו שבב, ניידות electrophoretic assay shift (EMSA), מבחני נפתחים דנ א שונים כתב-מבחני8,11,12, 23 , 24.
כדי להדגים כי גורם שעתוק מסוימים אינטראקציה עם אזורים ספציפיים בגנום ויוו, השבב הוא טכניקה אידיאלית25. למטרה זו, ה-DNA, חלבונים הקשורים בתאים חיים הם קישורים צולבים באמצעות הקרנת UV או פורמלין (שבב צולבים, XChIP). שלב זה מושמט להשיג DNA יותר ושחזור חלבון כביכול יליד שבב (NChIP)26. מתחמי ה-DNA-חלבון מוטים לאחר מכן על ידי sonication לחלקים של 200-500 בסיסים (bp) immunoprecipitated תא הלבלב באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד גורם שעתוק עניין. שברי DNA המשויך מכן מטוהרים, המאופיינת PCR שיבוט מולקולרי, רצף. טכניקות חלופיות להשתמש מיקרו-מערכים (שבב על שבב) או רצף הדור הבא (צ'יפ-Seq) כדי לנתח את immunoprecipitated ה-DNA.
שבב הוצג לראשונה על ידי גילמור, ליס ב-1984 כאשר הם בשימוש UV אור כדי covalently קישור DNA וכרוך בכריכת חלבונים חיים חיידקים27. בעת פירוק התא, immunoprecipitation של חיידקי RNA פולימראז, הגששים ספציפי של גנים ידועים שימשו כדי למפות את התפלגות ויוו ואת צפיפות של RNA פולימראז. השיטה שימש לאחר מכן על ידי החוקרים אותו כדי לנתח את חלוקת האיקריוטים RNA פולימראז II על חום הלם חלבון גנים דרוזופילה28. וזמינותו XChIP היה מעודן יותר מאת ורשבסקי ועמיתים הנפוץ פורמלדהיד cross-linking ללמוד השיוך של היסטון H4 חום הלם חלבון גנים29,30. הגישה NChIP, אשר נושאת את היתרון של החלמה טובה יותר DNA וחלבון עקב epitopes באופן טבעי ללא פגע, לכן, להגדיר נוגדן, תוארה לראשונה על ידי Hebbes ועמיתיו בשנת 198831.
היתרון של שבב לעומת טכניקות אחרות לניתוח אינטראקציות חלבון-דנ א היא, למעשה, האינטראקציה בפועל של פקטור שעתוק ניתן ובדוקים ויוו טראקיס או מלאכותי שנוצר על-ידי אנשים רגילים או ג'לים התנאים מועסק8,11,12. על ידי שילוב שבב עם הדור הבא רצפי, מטרות מרובות ניתן לזהות בו זמנית.
מגבלות הגדולות של טכניקה זו הם שלה תחולה מוגבלת כדי מבחני בקנה מידה גדול אורגניזמים שלמים25. ניתוח דפוסי ביטוי גנים דיפרנציאלי יכול להיות גם מאתגר באמצעות טכניקות צ'יפ אם החלבונים בהתאמה באים לידי ביטוי רק ברמות נמוכות או תוך זמן קצר של windows. עוד פוטנציאל מגביל הוא הזמינות של נוגדן המתאים עבור השבב11.
פרוטוקול שבב המובאת כאן יכול להיות מועסק לצורך זיהוי ויוו של היעד גנים של פקטור שעתוק מאת PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). באופן ספציפי, המטרה היא לזהות היעד הרומן גנים של NFAT2 ב CLL. שבב נבחר בגלל הפוטנציאל להדגים ישירות את הכריכה של NFAT2 אל מחוזות מקדם מטרה שונים גנים בתנאים טבעיים בתאי החולה CLL אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים שנערכו עם חומר אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת טיבינגן, ממנו כל המטופלים אשר תרמו דגימות מחקר זה הושג בכתב הסכמה מדעת.
1. בידוד ותאי גירוי של Jurkat
הערה: כדי למטב את הפרוטוקול, השתמש בשורת תא Jurkat אשר ידוע לבטא רמות גבוהות של NFAT2. כל הצעדים מבוצעים תחת תא למינארי.
- להכין 50 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין מאת מהרהרת היא 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- תרבות Jurkat תאים עבור 1-2 d בבקבוקון התרבות התא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב- 20 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין על צפיפות של 2 x 106 תאים למ"ל (תאים ייספרו עם Trypan כתמים כחולים ו- a תא נויבאואר תחת המיקרוסקופ) ולמסוק בהם על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב x 200 גרם.
- הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר מכן, לספור את התאים לבין קונבנציונלי trypan blue של צביעת תא נויבאואר מתחת למיקרוסקופ.
- Centrifuge התאים מהשלב 1.3 עבור 5 דקות ב x 200 גרם ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. לאחר מכן, resuspend את התאים על צפיפות של 2 x 107 תאים למ"ל בשנת 1640 RPMI בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, העברת מ 1 ל צינור קונבנציונאלי מ ל pipetting.
- לגרות את התאים על-ידי הוספת 32.4 nM phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ionomycin 1 מיקרומטר. ואז דגירה את התאים עבור h 16-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עם המכסה של הצינור נפתח (כדי למנוע זיהום, סרט איטום חדיר לאוויר יכול לשמש).
2. בידוד וגירוי של תאים CLL העיקרי מחולים אנושי
הערה: החולה היו רכשה ודוגמאות מגורה כפי שתואר לעיל7. כל הצעדים מבוצעים תחת תא למינארי.
- להכין את הציוד הנדרש דם מחולים וכדי לבצע הפרדה הדרגתיות צפיפות: 21-G מחטים, עורקים, NH4-הפרין-דם אוסף מזרקים (למשל, S-monovettes), 1 x PBS, צפיפות בינונית הדרגתי (צפיפות 1.077 g/mL) .
- על venipuncture, לקחת הדם מחולים CLL (ca. 40 מ"ל דם לחולה) לתוך תארגן את הדברים. ואז להעביר את הדם צינורות חרוט 50 מ. רוחצים את המזרק עם 10 מ"ל PBS את מאגר הדם-PBS-התליה צינורות 50 מ ל (לכוונן את מספר צינורות לנפח של דם).
- להכין 15 מ"ל של המדיום הדרגתיות צפיפות צינור חרוטי מ"ל. לאחר מכן, שכבת 35 מ של הדם-PBS-התליה בקפידה על המדיום הדרגתיות צפיפות. לענין זה, להחזיק את הצינור ב זווית שטוחה, לאט pipette הדם-PBS-התליה הקיר התחתון של צינור חרוטי 50 מ. כפי יותר של הדם-PBS-ההשעיה היא צבירת בצינור חרוט 50 מ ל, להגדיל את הזווית של הצינור עד זווית ישרה. חזור על שלב זה על פי נפח הדם-PBS-התליה.
- לבצע צנטריפוגה ב x 560 גרם במשך 20 דקות (ללא בלם), ולאחר מכן לחלץ את שלב התא תאי אשר מכיל תאי תאי הדם ההיקפיים (PBMCs). כדי לעשות זאת, לאסוף את לאטמוספרה לבן ההפרדה הדרגתיות צפיפות עם פיפטה סרולוגית 5 מ ל להעביר אותו צינור חרוטי 50 מ.
- למלא התא-התליה עד 50 מ"ל PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 360 גר'. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. חזור על שלב זה עם צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 275 גרם. לאחר מכן, בריכת התאים של מטופל אחד ב- 5-10 מ של PBS צינור חרוטי 50 מ.
- לספור את התאים כמתואר ב- 1.3.
הערה: זה תלוי הפרופורציה של תאים CLL PBMCs מבודדים, אם התאים יכול לשמש ישירות עבור הליך זה או בידוד תא B צריך להתנהל, למשל, באמצעות תא מגנטי מיון (מקינטוש). הבידוד תא B מומלץ אבל יכול להיות מושמט אם היחס של תאים CLL היא מעל 95% של סך לימפוציטים (שנקבע באמצעות cytometry זרימה). דם של CLL מטופלים קבועים, lysed על פי הוראות היצרן. לאחר מכן מכתים עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE תתבצע בהתאם להוראות היצרן, התאים הם ניתחו ויה cytometry זרימה. מטופל למופת אחד מוצג באיור 1, שבו היחס של תאים CLL הוא 89.03%. לפיכך, בידוד תא B יש לבצע אצל החולה הזאת. חלקם של תאי B פיזיולוגיים הוא זניח (3.72 צד % בדוגמה). - לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של טרום ומחוממת (37 ° C) RPMI 1640 שיושלם עם FCS 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 100 מ מ, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מ מ β-mercaptoethanol עבור 5 דקות ב 200 x גרם ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- התאם את התאים כדי 2 x 107 תאים למ"ל בשנת 1640 RPMI בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 100 מ מ, 1 מ מ נתרן פירובט ו-50 מ"מ β-mercaptoethanol (37 מעלות צלזיוס), מילוי 1 מ"ל של התליה תא לתוך צינור 5 מ.
הערה: ß-mercaptoethanol הוא מועסק כדי לנטרל סטרס חמצוני. - לגרות את התאים על-ידי הוספת 32.4 nM PMA ו ionomycin 1 מיקרומטר. ואז דגירה את התאים עבור h 16-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עם המכסה של הצינור נפתח (כדי למנוע זיהום, סרט איטום חדיר לאוויר יכול לשמש).
הערה: כדי להפחית את רמת הסטרס התאים יכולים להיות נחנו h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה לפני ה 16 של גירוי.
3. קיבוע, פירוק תאים וכרומטין הטיה
הערה: דגימות החולה ותאים Jurkat קבוע, lysed עם ערכת השבבים זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן עם שינויים כפי שתואר לעיל7. הקיבעון מתבצע תחת תא למינארי.
- היכונו צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד, צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 1.25 מ' גליצין, שפופרת 5 מ עם 4 מ של 1 x PBS קופסה עם קרח הקיבעון של התאים.
- לאחר גירוי של התאים עבור זמן הדגירה בהתאמה בשלב 1.5 או 2.9, לסובב את הצינורות 5 מ"ל ב x 200 גרם במשך 5 דקות, resuspend תאי µL 500 ל- PBS את החצוצרות שלה מ.
- הוסף מיקרומטר 340 פורמלדהיד (13.5 µL של 37% פורמלדהיד) לתאים. לאחר ערבוב קצר על ידי בקפידה pipetting למעלה ולמטה דגירה המתלה למשך 2.5 דקות (תאי Jurkat) או 5 דקות (החולה מדגם) בטמפרטורת החדר.
הערה: קיבוע ממושך זמן נדרש עבור ראשי תאים להבטיח הטיה אופטימלית. - להוסיף 125 מילימטר גליצין (57 µL של 1.25 מ' גליצין) לעצור את הקיבעון של תקופת דגירה של עוד 5 דק את התאים על קרח מייד לאחריו, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה.
הערה: לאחר הקיבעון, הפרוטוקול ניתן להשהות. תאים קבוע צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° c כדי לבדוק, אם epitope של הנוגדן התכוונה להשתמש בפרוטוקול הבא לא מוסווה באמצעות קיבעון, דוגמאות נוספות יכול לשמש לצורך ניתוח דרך עמוד מרחביות בג'ל תספיג. פעולות אלה מבוצעות עם 100 µg של חלבון על פי הוראות היצרן. לכל הנוגדנים αNFAT2 משמשים לדילול 1:1000, הנוגדן GAPDH לדילול 1:10000. דמות המופת של קבוע דגימות תאים Jurkat עם נוגדנים המתאימים ולא הולמים מוצג באיור2. - Resuspend בגדר תא ב 5 מ של פירוק זמינים מסחרית מאגר 1 על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר מכן, מניחים את הדוגמאות על הקרח על מטרף, דגירה להם 10 דקות תוך כדי טלטול.
הערה: לפני פירוק, התאים יכולים להיות התפוררה 10 s בחנקן נוזלי. זה שימושי עבור תאים Jurkat אך להימנע בדגימות החולה העיקרי. על התפוררות, מקום הצינורות מ ל 5 s ב- 5-10 מ של חנקן נוזלי במיכל ספציפיים. ללבוש בטיחות משקפיים וכפפות בבטיחות. - לאחר מכן, centrifuge הצינורות ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.
- Homogenize התאים 5 מ של מאגר זמין מסחרית פירוק 2 על-ידי pipetting למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 10 דקות על הקרח תוך טלטול. לאחר מכן centrifuge הצינורות ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.
- Resuspend בגדר תא ב- 500 µL (תאי Jurkat) או µL 140 (דוגמאות החולה) של הטיית מאגר 1 המכיל 1 x מעכב פרוטאז (5 µL או 1.4 µL, בהתאמה) דגירה את התערובת למשך 10 דקות על קרח.
- עבור כרומטין הגז, להעביר µL 140 של התא-התליה מהשלב 3.9 לתוך צינורות sonicator (למנוע בהפקת בועות אוויר, חזור על צעד זה במידת הצורך עקב נפח דגימה). מקום הצינורות האולטרה-sonicator ממוקד בטמפרטורה של 7 ° C ו הטיה 10 דקות (תאים בטור) או 7.5 דקות (דוגמאות החולה) עם כוח התקרית הממוצע של 9.375 W כדי לקבל 200-500 bp שברי DNA.
- לבסוף, צנטריפוגה ב x 15700 g 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה קטנה ולאסוף את תגובת שיקוע צינור 1.5 mL החדש.
- כדי לבדוק גודל המקטע המתאימה, לנתח µL 20 של כרומטין הוטו דרך בג'ל ב- 1.5% TBE agarose ג'ל. דמות המופת של כרומטין הוטו מתאי Jurkat של טוב ורע איכות מוצג באיור3. בשלב זה, הפרוטוקול ניתן באופן פוטנציאלי להשהות. כרומטין הוטו צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° c
4. כרומטין Immunoprecipitation
הערה: immunoprecipitation כרומטין בוצעה עם ערכת השבבים זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן עם שינויים7.
- לחשב את מספר immunoprecipitations (70 µL (תאי Jurkat) או µL 15 (דוגמאות החולה) של כרומטין הוטו בתוספת נוגדן אחד) והכן 20 µL של חלבון A מצופה חרוזים לכל המשקעים צינור 1.5 מ. לשטוף את החרוזים ב 40 µL 1 x מאגר שבב 1 לכל המשקעים על-ידי pipetting למעלה ולמטה, תן את החרוזים לנוח על מתלה מגנטי עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. לבצע שלב זה ארבע פעמים בסך הכל. בסופו של דבר, resuspend את החרוזים באמצעי האחסון המקורי עם מאגר שבב 1 x 1.
- עבור immunoprecipitation עצמה, השתמש µg 10 של הנוגדן αNFAT2 (7A6) כדי ללכוד NFAT2 עם רצפי מאוגד היעד שלה. השתמש µg 2.5 של נוגדנים IgG הארנב (DA1E) כפקד של IgG. הכינו את התגובות mL 1.5 טריים צינורות כמצוין בטבלה1.
הערה: חשוב להשתמש נוגדן חד שבטי עם זיקה גבוהה של מי epitope מוסווה לא במהלך קיבוע עבור פרוטוקול זה. נוגדנים polyclonal מציגים רמה נוספת של וריאציה באופן משמעותי יותר מאשר בפלומה לפרש כראוי את התוצאות שהתקבלו. - דגירה התערובת מהשלב 4.2 בן לילה ב 4 ° C על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
- הבא יום ספין הצינורות עבור 5 s ב 7,000 x g בצנטריפוגה קטן, דגירה אותם בארון תקשורת מגנטי עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם כל אחד המאגרים שטיפת 1, 2, 3 ו- 4 ברציפות.
- כדי לעשות זאת, resuspend את החרוזים ב 350 µL שטיפת המאגר, דגירה אותם למשך 5 דקות ב 4 ° C על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
- לאחר מכן, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן. . ואז, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי, להסיר את תגובת שיקוע והוסף המאגר שטיפת הבא.
- לאחר השלב האחרון כביסה, להסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting, תופסים את החרוזים ב 100 µL מאגר • תנאי 1, דגירה אותם למשך 30 דקות על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
- לסובב את הצינורות זמן קצר (5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן) ומניחים אותם על מתלה מגנטי עבור 1 דקות.
- ואז להעביר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting אל צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 4 µL מאגר • תנאי 2.
- כדי ליצור את הפקד קלט, לערבב 1 µL של כרומטין הוטו עם 99 µL של µL מאגר 1 ו- 4 • תנאי מאגר • תנאי 2 (תוכנית התקנה זו, ישנם שלושה צינורות לכל מטופל: קלט אחד IgG אחד-שליטה ובקרה, דוגמא αNFAT2 אחת).
- דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 65 ° C ו- 1300 סל ד ב שייקר צינור 1.5 מ. להוסיף 100 µL 100% אלכוהול איזופרופיל, מערבולת, ספין הדגימות עבור 5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן.
- Resuspend את החרוזים מגנטי זמין על-ידי ביסודיות vortexing, להוסיף 10 µL של החרוזים בכל דגימה, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
- לאחר הדגירה, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב x 7000 g הקטן צנטריפוגה. ומניחים אותם על 1 דקות במתלה מגנטי. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- Resuspend את החרוזים ב 100 µL שטיפת מאגר 1. היפוך הצינורות כדי לערבב תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
- לסובב את הצינורות עבור 5 s ב 7000 x g בצנטריפוגה קטן, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. חזור על השלבים 4.13-4.14 עם שטיפת מאגר 2.
- לאחר מכן, להסיר את המאגר שטיפת על ידי השאיפה, resuspend את החרוזים ב µL 55 • תנאי המאגר, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר על ההגה מסתובב 6 סל ד כדי elute את ה-DNA precipitated. לבסוף, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב 7000 x g בצנטריפוגה קטן, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי ולהעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות 1.5 mL החדש.
הערה: כאן הפרוטוקול ניתן באופן פוטנציאלי להשהות. ה-DNA eluted ואז צריך להיות מאוחסן ב-20 ° C.
5. זיהוי גנים היעד NFAT תאים CLL.
- לנהל את התגובה לרביעיית-PCR של כפילויות עבור כל דגימה כמצוין בטבלה מס ' 2.
הערה: איתור היעד גנים PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) מתבצע באמצעות שילוב לרביעיית זמינים מסחרית-PCR עם מכשיר PCR בזמן אמת. - השתמש לבן 96-ובכן התגובה צלחות התגובות לבין הכלי RT-PCR. התנאים אופניים הם כדלקמן: 95 ° C ל 30 s, [95 ° C 5 s, 60 ° C ל 30 s] x 40 מחזורי.
הערה: לדילול טורי של הקלט (מדולל או מדולל 1:10, בטחונות, 1:1000 במים נטולי נוקלאז) משמש כדי לחשב את העשרת יחסי. בתאים Jurkat, il-2 שימש לשלוט בגודל32. CD40L, מטרה ידועים של NFAT2 בתאי B, שימש פקד חיובי תאים CLL ו LCK כדוגמה עבור גן המטרה הרומן של NFAT2 ב CLL33,34. צבעי יסוד האזור יזם CD40L, il-2 , LCK מתוארים בטבלה של ריאגנטים ספציפיים וציוד.
6. נורמליזציה וניתוח נתונים
הערה: העשרה היחסי עבור אזורים יזם עניין (il-2, CD40L או מזל) מחושבת באמצעות הפקד IgG עבור נרמול.
- ראשית, קבע Ct (סף מחזור) ערכים עבור קלט טורי דילול, את il-2, CD40L את האזור יזם LCK דרך התוכנה הערכה מנתונים לרביעיית-PCR.
- הגדרת עיקול רגיל עבור הריכוזים באמצעות דילול טורי של הקלט. עם זה עיקול רגיל לחשב את הריכוז il-2, CD40L האזור יזם LCK עבור כל שכפול של כל דגימה.
- בשלב הבא, לחשב את הממוצע של הכפילויות. לאחר מכן, הגדר את הדגימה immunoprecipitation IgG כנקודת התייחסות. מגדירים את העשרת יחסי עבור הדוגמה 1.0 והשווה אחרות לדוגמה (מ- immunoprecipitation NFAT2) כדי הפניה זו.
- לבסוף, לחשב את העשרת יחסי על-ידי חלוקת הריכוז של הדגימות על ידי הריכוז של ההפניה IgG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג ניתוח cytometry זרימה למופת של המטופל CLL לאחר צביעת עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE. איור 1a מציג את דרך השער של לימפוציטים, המייצג את רוב תאי הדם של חולי CLL. איור 1b מציגה את הפרופורציה של CD19+/CD5+ CLL התאים, אשר מייצגים 89.03% לימפוציטים בדוגמה זו. חלקם של CD19+/CD5– B תאים הוא 3.72 צד % אצל המטופל בהתאמה.
איור 2 מציג דוגמאות של נוגדן ביצועים בתאים Jurkat קבוע עבור תקופות זמן שונות כמו לאומדן מרחביות-דף, ווסטרן כתם. נוגדנים שונים מיצרנים שונים נותחו. איור 2a מראה הביצועים של הנוגדן αNFAT2 (שיבוט 7A6) מיצרנים שונים, מזוהה עם נוגדן אנטי-עכבר ירוק פלורסנט. הנוגדן של יצרן 1 הראו מחייב את שלה epitope בלי קיבוע (פס א) אפילו כאשר תאים Jurkat היה קבוע עבור מינימום 2.5 או 5 דקות (להקת B או C, בהתאמה). ΑNFAT2-הנוגדן (שיבוט 7A6) מיצרן 2, מצד שני, הראו ביצועים חלשים יותר אפילו בתאים Jurkat לא קבוע (פס ד). על קיבעון, הנוגדן של יצרן זה להשיג תוצאות אפילו חלש יותר (להקות E (2.5 דקות קיבוע) ו- F (5 דקות קיבוע)). איור 2b מראה הביצועים של הנוגדן αNFAT2 (שיבוט D15F1) מיצרן שונה מזוהה עם נוגדן אנטי-ארנב פלורסנט אדום. נוגדן זה גם ביצע בחולשה בדגימות מבולבל (פס A), העדר של להקה המציין המסיכה של epitope שלה על ידי הקיבעון (להקות B (2.5 דקות קיבוע) ו- C (5 דקות קיבוע)).
איור 3 מראה דוגמאות של כרומטין הוטו מתאי Jurkat שהושג לאחר קיבוע שונות, הטיית פעמים באיכות טובה ועניים כפי מוערך על ידי ג'ל אלקטרופורזה. להקות A ו- B (מינימום 0 קיבוע או קיבוע 2.5 דקות, בהתאמה) באיכות טובה הצג לכסנתם כרומטין, אשר מאופיין על ידי גודל מקטע דנ א של bp 200-500 אשר ניתן לאתרם על ג'ל agarose כמו כתם טיפוסי. כרומטין הוטו באיכות ירודה, מצד שני, ניתן לזהות על ידי היעדרות כמעט מלא או מלא של השמצות הצפוי של DNA (פס C), כמו גם כתם גדול יותר או קטן יותר טווח גודל המקטע הצפוי (להקות D-F). העדר מוחלט של השמצות מציין את השימוש כמויות מספיקות של הפעלת חומר. זיהוי ה-DNA קטן יותר קטעים רמזים מופרז DNA ההטיה (להקה. E) תוך גדול DNA שברי רמז הטיית לא מספיקות.
איור 4 מציגה את התוצאות של ניסוי טיפוסי עם תאים Jurkat. מזל נותחו כמטרה NFAT2 פוטנציאליים. Il-2 וזה גן יעד מוגדר היטב של NFAT2 בתאי T שימש פקד חיובי. נוגדנים IgG-control היה מנוצל עבור נרמול. איור 4a מציג ניסוי עם תוצאות אופטימליות שתיעד העשרה משמעותית של פקד ה- il-2 חיובי. ומהניסוי הזה, ניתן להסיק שמקדם שיש העשרת משמעותית של LCK רצפי ה-DNA precipitated הוכחת כי מזל הוא מטרה NFAT2 ישירה בתאים Jurkat. איור 4b מראה ניסוי הופיעה עם איכות ירודה DNA עקב חסר קיבוע או הליך ההטיה שיוצרת גורם תואר נמוך של העשרה בפקד חיובי il-2 .
איור 5 מראה את התוצאות של ניסוי עם ראשי תאים CLL אנושיים. CD40L המהווה מטרה NFAT2 ידוע בתאי B שימש את הפקד חיובית ועל LCK נותחו כיעד ניסיוני. איור 5a מראה ניסוי ניכרת ברמת העשרה של CD40L DNA בפקד חיובי. מ העשרת חזקה של LCK DNA, אפשר להסיק כי מזל הוא גם מטרה NFAT2 ישירה בתאי CLL אדם ראשי. איור 5b מראה ניסוי עם איכות ירודה הדי קרוב לוודאי עקב הטיית לקוי. אין העשרה משמעותי של CD40L DNA עשוי לזהות בפקד חיובי עיבוד המידע מהניסוי חסר משמעות.
איור 1: ניתוח cytometry זרימה למופת של חולי CLL. (א) דגימות של חולי CLL נותחו באמצעות cytometry זרימה לאחר צביעת עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE, לימפוציטים היו מגודרת. (ב) לאחר מכן, שיעור CD19+/CD5+ CLL התאים ואת CD19+/CD5– B תאים היו נחושים. הנה, CD19+/CD5+ CLL התאים חשבון 89.03% של לימפוציטים, ואילו CD19+/CD5– B תאים לייצג 3.72 צד % של לימפוציטים. מטופל למופת אחד מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות של נוגדן ביצועים בתאים Jurkat קבוע לאומדן מרחביות-דף, המערבי-כתם. (א) Jurkat התאים תוקנו 0 דקות (להקות A ו- D), 2.5 min (להקות B ו- E), או 5 דקות (C ו- F) וαnfat2-הנוגדן (שיבוט 7A6) מיצרנים שונים (להקות A-C = יצרן 1, להקות D-F = יצרן 2) נמשל. הנוגדן של יצרן 1 הראו יותר הכולל הופעה, מחייב עם זיקה גבוהה יותר אפילו דגימות קבוע (להשוות להקות A-C ולהקות D-F). (ב) αNFAT2-הנוגדן (שיבוט D15F1) מיצרן שונה היה בשימוש. נוגדן זה הראה רק הופעה המסכן בדגימות מבולבל (פס A), epitope היה מוסווה על קיבוע. לכן, אין איגוד של הנוגדן יכול להתגלות לאחר קיבוע (להקות B ו- C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דוגמאות של כרומטין של איכות חיתוך טוב ועניים מתאי Jurkat מוערך על ידי אלקטרופורזה בג'ל. התאים Jurkat קבוע, לכסנתם עבור תקופות זמן שונות. קיבוע נעשה 0 דקות (להקות A ו- D), 2.5 דקות (להקות פריצות), או 5 דקות (C ו- F). הטיית בוצעה עבור 10 דקות (להקות A-C) או 20 דקות (להקות D-F). כרומטין באיכות טובה ההטיה מאופיין על ידי גודל מקטע דנ א של bp 200-500 אשר יהיה מזוהה כמו כתם באזור בהתאמה (להקות A ו- B). כרומטין באיכות ירודה ניתן לזהות שאו על ידי היעדרות כמעט מלא או מלא של ה-DNA ימרחו עקב כמות מספיקה של הפעלת חומר המשמש (פס C) או על-ידי כתם באזור בגודל קטן או גדול יותר בגלל (תנאים הטיה לא הולם להקות D-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שבב של תאים Jurkat לאומדן לרביעיית-PCR- (א) NFAT2 נקשר LCK ו- il-2 האמרגן בתאים Jurkat. העשרת היחסי של LCK ו- il-2 אזורים יזם זירז עם הנוגדן NFAT2 מוצג כפי נותחו על ידי לרביעיית-PCR. 3 עצמאית שבב-ניסויים מוצגות כפי מתכוון ± SEM (מבחן t של סטודנט, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001). (ב) ה-DNA מדגימות בעלי איכות ירודה כרומטין הוטו שימש. אין איגוד הרלוונטיים של NFAT2 על הרצף היעד יכול להתגלות. תמונה דומה ניתן להבחין אם היה אין קיבוע או זמן הדגירה עם הנוגדן NFAT2 היה לא מספיק. 3 עצמאית שבב-ניסויים מוצגות כפי מתכוון ± SEM (מבחן t של סטודנט, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שבב של ראשי תאים CLL אנושיים לאומדן לרביעיית-PCR- (א) NFAT2 באופן ספציפי נקשר היזמים LCK ו CD40L בתאי CLL אדם ראשי מחולים עם קורס indolent של המחלה. הדיאגרמה מציגה את העשרת היחסי של LCK CD40L יזם ואזורים זירז עם הנוגדן NFAT2 כפי נותחו על ידי לרביעיית-PCR. 3 עצמאית שבב-ניסויים מוצגות כפי מתכוון ± SEM (מבחן t של סטודנט, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001). (ב) ה-DNA מדגימות החולה בעלי איכות ירודה כרומטין הוטו שימש. יכול להיות שנצפו אין איגוד של NFAT2 על הרצף היעד המתאים. 3 עצמאית שבב-ניסויים מוצגות כפי מתכוון ± SEM (מבחן t של סטודנט, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריט | נפח (µL) לפי IP |
| BSA 5% | 6 |
| 100 x מעכב פרוטאז | 3 |
| 5 x שבב מאגר 1 | 56 |
| כרומטין הוטו | x (15 µL או 70 µL) |
| חלבון א' מצופה beads מגנטי | 20 |
| שבב seq כיתה מים | 185-x-y |
| נוגדנים (αNFAT2 או IgG-control) | y (שוקל 1.09 µL או 1 µL) |
| סה | 270 |
טבלה 1: לוח הזמנים עבור pipetting את immunoprecipitation כרומטין. Immunoprecipitation כרומטין בוצעה על-ידי הכנת התגובות כמצוין בטבלה.
| פריט | נפח (µL) לכל לרביעיית-PCR |
| immunoprecipitated DNA | 9 |
| מיקס לרביעיית-PCR | 10 |
| פריימר לפנים (מזל/CD40L/il-2) | 0.5 |
| פריימר הפוכה (מזל/CD40L/il-2) | 0.5 |
| סה | 20 |
בטבלה 2: לוח הזמנים עבור pipetting לרביעיית-PCR- לרביעיית-PCR בוצעה על-ידי הכנת התגובות כמצוין בטבלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים של ביצוע וזמינותו שבב מוצלחת של הבחירה של נוגדן המתאים הינם אופטימיזציה של כרומטין הטיית תהליך25. הבחירה של הנוגדן αNFAT2 הוכיחה להיות מאתגרת במיוחד במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אמנם ישנם מספר נוגדנים αNFAT2 זמינים מסחרית, רוב העבודות האלה בסדר גמור עבור סופג המערבי ויישומים אחרים, שיבוט 7A6 היה הנוגדן היחיד אשר יכול לשמש בהצלחה עבור השבב7. אפילו כביכול נוגדנים זהים 7A6 של יצרנים שונים הציג הבדלים משמעותיים לגבי הביצועים שלהם שבב. האתגר העיקרי הוא שיבוש epitopes חלבון המטרה על ידי תהליך קיבוע בשימוש XChIP פרוטוקולים25פוטנציאליים.
כרומטין הטיה הליך חיוני גם לרכישת תוצאות מתאימות ב- XChIP. גודל המקטע של 200-500 bp כפי לאומדן agarose בג'ל נמצאה אופטימלי ב פרוטוקול זה השבב NFAT27. לא הולם תנאים ההטיה וכתוצאה מכך מחסור של DNA מתחיל בדרך כלל חומר או שברי DNA של גודל קטן או גדול יותר להוביל לתוצאות שיוצרת בעת ביצוע וזמינותו הזה. הטיית שיוצרת גם נצפתה בעת שימוש מוקפאים ולא rethawed PBMCs. לפיכך, הפשרתו של PBMCs, גרמו תשואה נמוכה יותר של ה-DNA של תאים, כמו גם עלייה הטיה מוגזמת של ה-DNA-קטעים.
הזמינות של מגוון רחב של ערכות השבבים, צ'יפ-כיתה נוגדנים הוא מאתגר, אבל מציעה גם את האפשרות להשתמש בטכניקה בהקשר רחב. לכן, מגוון של גורמי שעתוק יכול ייחקרו סוגי תאים שונים. לדוגמה, שאר בני המשפחה NFAT (NFAT1 ו- NFAT4) נחקרו לאחרונה באמצעות שבב35,36,37.
ערכת השבבים המשמש כאן גם היה צריך להיות שונה כדי להתאים לצרכינו. קודם כל, הזמן של קיבעון הותאם כדי להימנע מיסוך של epitope מוכר על ידי הנוגדן בשימוש ולאפשר הטיה אופטימלית. הנפח של מאגרים המשמשים פירוק הטיה השתנה גם כדי להפחית את אובדן תאים במהלך השלבים כביסה שונים. בנוסף, התנאים ההטיה אופטימציה לקבל שברי DNA בטווח של 200-500 bp. את מעכב פרוטאז, הנוגדן IgG-פקד הוחלפו עם ריאגנטים זמינים מסחרית אחרים כפי הם הוכיחו להיות דומות יותר וחסכוניות יותר. השלב לערב המוביל המסופקים על ידי היצרן הושמט כמו זה הפריע המשקעים של ה-DNA. בסופו של דבר, כמות מאגר נהגה elute ה-DNA הותאמה להניב תשואה של נפח מספיק כדי לשמש את לרביעיית-PCR.
יש מספר קיטים אחרים זמינים מחברות שונות ויש גם האפשרות לבצע את השבב ללא ערכת. עם זאת, בדיקות והקמת מאתגרות מאוד, שכן ישנם גורמים רבים כדי להיחשב, כמו התאימות של תאים שנותחה, חלבונים עם קיבוע שונות, הטיית שיטות. ערכת שהוזכרו שימש כפי שהיה ומבוססת במעבדה שלנו.
מגבלה העיקריים של שיטה זו הוא שלה תחולה מוגבלת כדי החקירות בקנה מידה גדול דגם שלם אורגניזמים כי נוגדנים המתאימים צריך להיות מזוהה או שנוצר עבור כל גורם שעתוק בודדים. הניתוח של גנים אשר באים לידי ביטוי רק ברמות נמוכות, במספר קטן של תאים, או במהלך חלון זמן מוגבל יכול גם להיות מאתגרת באמצעות שבב.
בעוד השבב הוא תקן הזהב כדי להדגים את האינטראקציה הישירה של פקטור שעתוק נתון עם הגנים המתאימים היעד שלו התאים האיקריוטים שלם25, יש מספר טכניקות אחרות כדי לחקור באינטרקציה בין חלבונים ודנ א . EMSA היא שיטה שימושית לזהות נמוך-שפע DNA מחייבת חלבונים תא lystates24. זה יכול לשמש גם כדי לאפיין את זיקה מחייבת של חלבון מסוים דרך שיטתית אנליזת דנ א בדיקה mutational. היתרון העיקרי של EMSA בהשוואה שבב היא העובדה כי היא בדרך כלל באופן משמעותי פחות זמן רב להקים וזמינותו בהתאמה. מבחני נפתחים דנ א, לכידת microplate ואת מבחני איתור מבחני כתב הן טכניקות אחרות לניתוח אינטראקציות חלבון-DNA23.
ההתפתחויות האחרונות יותר הפכו אותו ניתן להחיל וזמינותו שבב גישות הגנום כולו על ידי השילוב שלו עם microarray טכנולוגיה (שבב על שבב)38,39,40 -הדור הבא רצפי (צ'יפ-Seq )42,41,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי DFG הענק מו 3340/1-1 ו- Krebshilfe דויטשה את הענק 111134 (שניהם הוענק M.R.M.). אנו מודים אלקה Malenke לסיוע טכני מעולה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).
