Summary
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er den vanligste leukemi i den vestlige verden. NFAT transkripsjonsfaktorer er viktig regulatorer og aktivisering i rekke celletyper. Her presenterer vi en protokoll for bruk av chromatin immunoprecipitation (ChIP) i CLL menneskeceller å identifisere romanen målet gener av NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er preget av utvidelse av ondartet B-cellen kloner og representerer den vanligste leukemi i vestlige land. Fleste CLL pasienter viser en lat Sykdomsforløp samt en anergic fenotypen av leukemi celler, henviser til en B-celle reseptor slutter å svare på ytre stimulering. Vi har nylig vist at transkripsjon faktoren NFAT2 er en viktig regulator av anergy i CLL. En stor utfordring i analysen av rollen som en transkripsjon faktor i ulike sykdommer er identifikasjonen av sin bestemt mål gener. Dette er av stor betydning for utviklingen av pathogenetic mekanismer og potensielle terapeutiske tiltak. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknikk å demonstrere protein-DNA interaksjoner og kan derfor brukes til å identifisere direkte mål gener av transkripsjonsfaktorer i pattedyrceller. Her, ble ChIP brukt til å identifisere LCK som en direkte mål genet av NFAT2 i menneskeceller CLL. DNA og tilhørende proteiner er krysskoblet med formaldehyd og senere skåret av sonication i DNA fragmenter av ca 200-500 base parene (bp). Krysskoblede DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er så selektivt immunoprecipitated fra celle rusk å bruke et αNFAT2 antistoff. Etter rensing oppdages tilknyttede DNA fragmenter via kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berikelse representerer områder i genomet som er angitt av NFAT2 i vivo. Aktuelle klipping av DNA og valg av nødvendige antistoffer er spesielt viktig for bruk av denne metoden. Denne protokollen er ideell for demonstrasjon av direkte vekselsvirkningene av NFAT2 med mål gener. Dens stor begrensning er vanskeligheten å ansette ChIP i store analyser analysere målet genene for flere transkripsjonsfaktorer i intakt organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) representerer de vanligste leukemi hos voksne i vestlige land, viser tydelig opphopning av CD19 og CD23 CD5 uttrykke modne B celler1. De fleste pasienter utstillingen en lat sykdom kurset, som ikke kreve spesifikk behandling i mange år. Derimot viser noen pasienter rask progresjon krever umiddelbar terapeutisk intervensjon med immun-kjemoterapi eller andre målrettet terapi2,3. Kjernefysiske faktor av aktivert T-celler (NFAT) er en familie av transkripsjonsfaktorer kontrollere ulike utviklingsmessige og aktivisering prosesser i mange celle typer4,5,6. Vi nylig viste overuttrykte og konstitusjonelle aktivering av NFAT2 i CLL celler fra pasienter med lat sykdom7. Her, regulerer den en unresponsive tilstand til B celle reseptor stimulering kalt anergy7. For å demonstrere at NFAT2 binder lymfocytt-spesifikke protein tyrosin kinase (LCK) selskapet og regulerer LCK uttrykk i menneskelige CLL celler, en bestemt chromatin immunoprecipitation analysen ble (ChIP) utviklet og ansatt.
Brikken er en av de flere teknikkene for å undersøke hvilken rolle transkripsjonsfaktorer i gene expression8. Genuttrykk er tett organisert på en svært komplisert måte av flere regulatorer med transkripsjonsfaktorer tar en uerstattelig del i denne prosessen9,10,11,12. Transkripsjonsfaktorer regulere genuttrykk i romlig og tidsmessige sammenheng er blitt identifisert i mange arter (f.eks for utvikling og differensiering)13,14,15, 16,17,18. Feil i intrikate kontrollmekanismer som involverer transkripsjonsfaktorer kan føre til en rekke patologisk prosesser inkludert kreft19,20. Identifikasjon av transkripsjonsfaktorer og deres respektive målene kan derfor tilby romanen terapeutiske veier21,22. For å undersøke dette spennende feltet finnes det flere metoder som ChIP, electrophoretic mobilitet Skift analysen (EMSA), ulike DNA rullegardinmenyen analyser og reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
For å demonstrere at en viss transkripsjon faktor samhandler med bestemte regioner i genomet er i vivo, . ChIP en ideell teknikk25. For dette formålet, er DNA og tilhørende proteiner i levende celler krysskoblet UV bestråling eller formaldehyd (krysskoblet ChIP, XChIP). Dette trinnet er utelatt å få bedre DNA og protein utvinning i den såkalte innfødte ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser skråstilles senere av sonication i fragmenter av ca 200-500 base parene (bp) og immunoprecipitated fra celle rusk med et spesifikt antistoff mot transkripsjon faktoren av interesse. Tilknyttede DNA fragmenter er så renset og preget av PCR, molekylær kloning og sekvenser. Alternative teknikker bruke microarrays (ChIP-on-Chip) eller den neste generasjons sekvensering (ChIP-Seq) til å analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP ble først introdusert av Gilmour og Lis i 1984 når de brukte UV lys til covalently krysskobling DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. Cellen lyse og immunoprecipitation av bakteriell RNA polymerase, ble bestemte sonder av kjente gener brukt til kart i vivo distribusjon og tetthet av RNA polymerase. Metoden ble senere brukt av samme etterforskerne for å analysere fordelingen av eukaryote RNA polymerase II på varme sjokk protein gener i Drosophila28. XChIP analysen var fremme raffinert av Varshavsky og kolleger som først brukte formaldehyd cross-linking for å studere tilknytningen av histone H4 varme sjokk protein gener29,30. NChIP tilnærming, som bærer fordelen av en bedre DNA og protein utvinning på grunn av naturlig intakt epitoper og, derfor større antistoff spesifisitet, ble først beskrevet av Hebbes og kolleger i 198831.
Fordelen med ChIP i forhold til andre teknikker for å analysere DNA-protein interaksjoner er faktisk at faktiske samspillet av en transkripsjon faktor kan være undersøkt i vivo og ingen sonder eller kunstig betingelser som buffere eller gels ansatt8,11,12. Ved å kombinere ChIP med neste generasjons sekvensering, kan flere mål identifiseres samtidig.
Store begrensninger av denne teknikken er den begrenset bruksområde omfattende analyser i intakt organismer25. Analyse av differensial genet uttrykk mønstre kan også være utfordrende med ChIP teknikker hvis respektive proteiner uttrykkes bare i lave nivåer eller under smale tidsvinduer. En annen potensielt begrensende faktor er tilgjengeligheten av et passende antistoff egnet for ChIP11.
ChIP protokollen presenteres her kan være ansatt i vivo identifikasjonen av målet gener av en transkripsjon faktor av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). Spesielt var målet å identifisere romanen målet gener av NFAT2 i CLL. ChIP ble valgt fordi dens potensiale direkte demonstrere binding av NFAT2 til regionene arrangøren av ulike gener under naturlige forhold i CLL pasienten menneskeceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene utført med menneskelige materiale ble godkjent av den etiske komiteen på Universitetet i Tübingen og skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter som bidro å denne studien.
1. isolering og stimulering av Jurkat celler
Merk: For å optimalisere protokollen, bruke Jurkat celle linjen som er kjent for å uttrykke den høye nivået av NFAT2. Alle trinnene utføres under laminær strømning hette.
- Forberede 50 mL av RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin ved oppvarming det 37 ° c i et vannbad.
- Kultur Jurkat celler for 1-2 d i en celle kultur kolbe på 37 ° C og 5% CO2 i 20 mL RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin til en tetthet på ca 2 x 106 celler/mL (celler telles med Trypan blå flekker og Neubauer kammer under mikroskopet) og høste dem av sentrifugering i 5 min på 200 x g.
- Fjern nedbryting med en pipette og resuspend cellene i 10 mL av RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin. Deretter telle celler med en konvensjonell trypan blå flekker og en Neubauer kammer under mikroskopet.
- Sentrifuge cellene fra trinn 1.3 for 5 min på 200 x g og fjerne nedbryting av aspirasjon. Deretter resuspend cellene på en tetthet av 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 1% penicillin/streptomycin og overføre 1 mL i en ny konvensjonelle 5 mL tube av pipettering.
- Stimulere cellene ved å legge 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) og 1 µM ionomycin. Deretter ruge celler for 16 h 37 ° C og 5% CO2 med lokket på røret åpnet (for å unngå forurensning, en forsegling film permeable til luft kan brukes).
2. isolering og stimulering av primære CLL celler fra menneskelige pasienter
Merk: Pasientprøvene ble kjøpt og stimulert som beskrevet tidligere7. Alle trinnene utføres under laminær strømning hette.
- Forbered nødvendig å trekke blod fra pasienter og utføre en tetthet gradert separasjon utstyr: 21-G sprøyter, tilstrammende, NH4-heparin-blod samling sprøyter (f.eks S-monovettes), 1 x PBS og tetthet gradert medium (tetthet 1.077 g/mL) .
- På venipuncture, trekke blod fra CLL pasienter (ca. 40 mL blod per pasient) i sprøyter. Deretter overføre blodet i 50 mL konisk rør. Vask sprøyten med 10 mL PBS og samle blod-PBS-suspensjon i 50 mL rør (justere antall rør volumet av blod).
- Forberede 15 mL tetthet gradert mediet i en fersk 50 mL konisk rør. Deretter lag 35 mL blod-PBS-suspensjon nøye på tetthet gradert mediet. For dette formålet, holder røret på en flat vinkel og sakte Pipetter blod-PBS-suspensjon mot den nederste veggen av 50 mL konisk røret. Som flere av blod-PBS-suspensjon er akkumuleres i 50 mL konisk røret, øke vinkelen på røret til en rett vinkel. Gjenta dette trinnet av blod-PBS-suspensjon.
- Utføre sentrifugering 560 x g for 20 min (uten brems), så ekstra den mononukleære celle fasen som inneholder perifert blod mononukleære celler (PBMCs). For å gjøre så, samle den hvite interphase av tetthet gradert separasjon med en 5 mL serologisk pipette og overføre den til en ny 50 mL konisk tube.
- Fylle celle-oppheng til 50 mL med PBS og sentrifuge for 5 min på 360 x g. Fjerne nedbryting av aspirasjon. Gjenta dette trinnet med sentrifugering for 5 min på 275 x g. Deretter basseng cellene i en pasient i 5-10 mL PBS i et 50 mL konisk rør.
- Telle celler som beskrevet i 1.3.
Merk: Det avhenger andelen av CLL celler i de isolerte PBMCs, hvis cellene kan brukes direkte til denne prosedyren eller en B-cellen aisolering gjennomføres, f.eks via magnetisk celle sortering (Mac). B celle isolasjon anbefales, men kan utelates hvis CLL celler er over 95% av total lymfocytter (bestemmes via flowcytometri). Blod av CLL pasienter er fast og lysed i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter en farging med CD19-FITC og CD5-PE antistoffer utføres i henhold til produsentens instruksjoner og cellene analyseres via flowcytometri. En eksemplarisk pasient er vist i figur 1, der CLL celler er 89.03%. Dermed har en B-cellen aisolering utføres i denne pasienten. Fysiologiske B-celler er ubetydelig (3,72% i eksemplet). - Vask cellene med 10 mL forvarmes (37 ° C) RPMI 1640 supplert med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvate og 50 mM β-mercaptoethanol for 5 min 200 x g og fjern nedbryting av aspirasjon.
- Justere cellene til 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 supplert med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvate og 50 mM β-mercaptoethanol (37 ° C) og fyll 1 mL av cellen suspensjon i en 5 mL tube.
Merk: ß-mercaptoethanol er ansatt å motvirke oksidativt stress. - Stimulere cellene ved å legge 32,4 nM PMA og 1 µM ionomycin. Deretter ruge celler for 16 h 37 ° C og 5% CO2 med lokket på røret åpnet (for å unngå forurensning, en forsegling film permeable til luft kan brukes).
Merk: For å redusere stressnivået cellene kan være uthvilt 1t på 37 ° C og 5% CO2 i inkubator før 16 h av stimulering.
3. fiksering, celle Lysis og Chromatin skjæring
Merk: Pasientprøvene og Jurkat celler er fast og lysed med et kommersielt tilgjengelig ChIP kit i henhold til produsentens instruksjoner med modifikasjoner som beskrevet tidligere7. Fiksering utføres under laminær strømning hette.
- Forberede en 1,5 mL tube med 1 mL av 37% formaldehyd, en 1,5 mL tube med 1 mL av 1,25 M glysin, en 5 mL tube med 4 mL 1 x PBS og en boks med is fiksering av cellene.
- Etter stimulering av cellene for respektive inkubasjon gang i trinn 1.5 eller 2.9, spinn 5 mL rørene på 200 x g i 5 min og resuspend cellene i 500 µL av PBS i 5 mL rørene.
- Legge til 340 µM formaldehyd (13,5 µL av 37% formaldehyd) i cellene. Etter kort blanding av pipettering forsiktig opp og ned ruge suspensjon for 2,5 min (Jurkat celler) eller 5 min (pasienten eksempel) i romtemperatur.
Merk: Langvarig fiksering tid er nødvendig for primær celler å sikre optimal klipping. - Legge til 125 mM glysin (57 µL av 1,25 M glysin) for å stoppe fiksering og ruge for en annen 5 min. sette cellene i is umiddelbart etterpå og sentrifuge på 500 x g for 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting av aspirasjon.
- Vask cellene to ganger med 1 mL av iskalde PBS 200 x g i 5 min på 4 ° C og fjern nedbryting hver gang av aspirasjon.
Merk: Etter fiksering, protokollen kan pauses. Fast celler skal lagres på-80 ° C. For å teste, hvis av antistoffer skal bruke i følgende protokollen ikke er maskert via fiksering, kan Tapp brukes til analyse via SDS side gel geleelektroforese og Western blot. Disse trinnene utføres med 100 µg protein i henhold til produsentens instruksjoner. Alle αNFAT2 antistoffer er brukt på en fortynning av 1:1000, GAPDH antistoffer på en fortynning av 1:10000. Et eksemplarisk bilde av fast prøver fra Jurkat celler med passende og upassende antistoffer er vist i figur 2. - Resuspend celle pellet i 5 mL av kommersielt tilgjengelig lyseringsbuffer 1 av pipettering opp og ned. Deretter plasserer prøvene på is i en shaker og ruge dem i 10 min mens risting.
Merk: Før lysis,-cellene kan bli oppløst for 10 s i flytende nitrogen. Dette er nyttig for Jurkat cellene, men bør unngås i primære pasientprøvene. For oppløsningen, plassere 5 mL rør for 5 s i 5-10 mL av flytende nitrogen i en bestemt beholder. Bruk vernebriller og riktig vernehansker. - Deretter sentrifuge rørene på 500 x g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting nøye ved pipettering.
- Homogenize cellene i 5 mL av kommersielt tilgjengelig lyseringsbuffer 2 av pipettering opp og ned og ruge i 10 min på is mens risting. Deretter sentrifuge rørene på 500 x g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting nøye ved pipettering.
- Resuspend celle pellet i 500 µL (Jurkat celler) eller 140 µL (pasientprøvene) av klipping buffer 1 inneholder 1 x protease hemmer (5 µL eller 1,4 µL, henholdsvis) og Inkuber blandingen for 10 min på is.
- For chromatin klippe, overføre 140 µL av celle-suspensjon fra trinn 3.9 til sonicator rør (unngå luftbobler og gjenta dette trinnet hvis nødvendig på grunn av prøven volum). Plass rørene i den fokusert ultra-sonicator ved en temperatur på 7 ° C og skjær i 10 min (celle linje) eller 7,5 min (pasientprøvene) med en gjennomsnittlig hendelsen kraft 9.375 W å få 200-500 bp DNA fragmenter.
- Endelig sentrifuge 15700 x g i 10 min på 4 ° C i en liten sentrifuge og samle nedbryting i en ny 1,5 mL tube.
- For å teste for aktuelle fragment størrelser, analysere 20 µL av skråstilte chromatin via gel-geleelektroforese i 1,5% TBE agarose gel. Et eksemplarisk bilde av skråstilte chromatin fra Jurkat celler av gode og dårlige kvalitet vises i Figur 3. På dette punktet, kan protokollen være potensielt midlertidig. Skråstilte chromatin bør lagres på-80 ° C.
4. chromatin Immunoprecipitation
Merk: Chromatin-immunoprecipitation ble utført med en kommersielt tilgjengelig ChIP kit i henhold til produsentens instruksjoner med modifikasjoner7.
- Beregne antall immunoprecipitations (70 µL (Jurkat celler) eller 15 µL (pasientprøvene) skråstilte chromatin pluss en antistoff) og forberede 20 µL av protein A belagt perler per nedbør i en 1,5 mL tube. Vask perlene i 40 µL av 1 x ChIP-buffer 1 per nedbør av pipettering opp og ned, la perlene hvile i en magnetisk rack for 1 min og fjerne nedbryting av pipettering. Utføre dette trinnet fire ganger totalt. Til slutt, resuspend perler i opprinnelige volumet med 1 x ChIP buffer 1.
- Immunoprecipitation seg, bruke 10 µg αNFAT2 antistoff (7A6) for å fange NFAT2 med sin bundne målet sekvenser. Bruk 2,5 µg en kanin IgG antistoff (DA1E) som en IgG-kontroll. Forbered reaksjoner i frisk 1,5 mL rør som vist i tabell 1.
Merk: Det er viktig å bruke et monoklonalt antistoff med høy affinitet som epitope ikke er maskert under fiksering for denne protokollen. Polyklonale antistoffer introdusere et ekstra nivå av variasjon gjør det betydelig vanskeligere å tolke riktig mottatt resultatene. - Inkuber blandingen fra trinn 4.2 overnatting på 4 ° C på et roterende hjul på 6 rpm.
- På neste dag spinne rør for 5 s 7000 x g i små centrifuge ruge dem i en magnetisk rack for 1 min og fjerne nedbryting av aspirasjon. Vask perler når med hver av vaskebuffere 1, 2, 3 og 4 fortløpende.
- Gjør resuspend perler i 350 µL av vaskebuffer og ruge dem i 5 min på 4 ° C på et roterende hjul på 6 rpm.
- Deretter spinne rør for 5 s 7000 x g i små sentrifuge. Deretter plassere dem i 1 min i en magnetisk rack, fjerner nedbryting og legge den neste vaskebuffer.
- Etter siste vask trinn, fjerne nedbryting av pipettering, ta opp perler i 100 µL av elueringsbufferen 1 og ruge dem i 30 min på et roterende hjul på 6 rpm.
- Spin rør kort tid (5 s 7000 x g i små sentrifuge) og plassere dem i en magnetisk rack for 1 min.
- Deretter overføre nedbryting av pipettering til en ny 1,5 mL tube og legge 4 µL av elueringsbufferen 2.
- For å opprette kontrollen inn, bland 1 µL av skråstilte chromatin med 99 µL av elueringsrør buffer 1 og 4 µL av elueringsbufferen 2 (i dette oppsettet, finnes det tre rør per pasient: en input kontroll, én IgG-kontroll og en αNFAT2 utvalg).
- Inkuber prøvene 4 h på 65 ° C og 1300 rpm i en 1,5 mL tube shaker. Legge til 100 µL av 100% isopropanol, vortex og spinn prøvene for 5 s 7000 x g i små sentrifuge.
- Resuspend tilgjengelig magnetiske perler av grundig vortexing, legge til 10 µL av perler hvert utvalg og ruge 1t ved romtemperatur på et roterende hjul på 6 rpm.
- Etter inkubasjon, spin rør for 5 s 7000 x g i små sentrifuge og plassere dem i 1 min i en magnetisk rack. Fjerne nedbryting av aspirasjon.
- Resuspend perler i 100 µL av vaskebuffer 1. Invertere rør for å mikse og ruge i 5 minutter ved romtemperatur på et roterende hjul på 6 rpm.
- Spin rør for 5 s 7000 x g i små centrifuge plasseres i 1 min i en magnetisk rack og fjerne nedbryting av pipettering. Gjenta trinnene 4.13-4.14 med vaskebuffer 2.
- Deretter fjerne vaskebuffer av aspirasjon, resuspend perler i 55 µL av elueringsbufferen og ruge i 15 min ved romtemperatur på roterende hjul på 6 rpm til elute utfelt DNA. Til slutt, spin rør for 5 s 7000 x g i små centrifuge plasseres i 1 min i en magnetisk rack og overføre nedbryting i nye 1,5 mL rør.
Merk: Her protokollen kan være potensielt midlertidig. Eluted DNA skal deretter lagres på 20 ° C.
5. gjenkjenning av NFAT mål gener i CLL celler.
- Gjennomføre qRT PCR reaksjonen i like for alle utvalg som vist i tabell 2.
Merk: For deteksjon av mål gener en kvantitativ sanntid PCR (qRT-PCR) er utført ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig qRT PCR-blanding med en Real-time PCR instrument. - Bruk hvite 96-brønns reaksjon plater for reaksjonene og RT PCR-apparatet. Sykling forholdene er som følger: 95 ° C for 30 s, [95 ° C i 5 s, 60 ° C for 30 s] x 40 sykluser.
Merk: En seriell fortynning av input (ufortynnet eller fortynnes 1:10, 1: 100 og 1:1000 i nuclease-fritt vann) brukes til å beregne den relative berikelse. I Jurkat celler, ble IL-2 brukt som en positiv kontroll32. CD40L, et velkjent mål for NFAT2 i B celler, ble brukt som en positiv i CLL celler og LCK som et eksempel for en roman målet genet av NFAT2 i CLL33,34. Primere for regionen CD40L, IL-2 og LCK arrangøren er beskrevet i bestemte reagenser og utstyr.
6. normalisering og dataanalyse
Merk: Relative berikelse for arrangøren regionene rundt (IL-2, CD40L eller LCK) beregnes ved hjelp av IgG-kontrollen for normalisering.
- Først fastslå Ct (terskel syklus) verdier for inndata føljetong fortynning, IL-2, CD40L og regionen LCK promoter via prøveversjonen av programvaren fra qRT PCR data.
- Definere en standardkurven for konsentrasjonen via serielle fortynning av input. Med denne standardkurve Beregn konsentrasjonen for IL-2, CD40L og LCK promoter området for hver kopi av hvert utvalg.
- Deretter Beregn gjennomsnittet av duplikatene. Deretter angi IgG immunoprecipitation prøven som referanse. Definere den relative berikelse for dette eksemplet som 1.0 og sammenligne andre prøven (fra NFAT2 immunoprecipitation) til denne referansen.
- Til slutt, beregne relative anriking ved konsentrasjonen av prøvene av konsentrasjonen av IgG referansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en eksemplarisk flyt cytometri analyse av en CLL pasient utført etter farging med CD19-FITC og CD5-PE antistoffer. Figur 1a viser gating av lymfocytter, som representerer fleste cellene i blodet til CLL pasienter. Figur 1b viser andelen CD19+/CD5+ CLL celler, som representerer 89.03% av lymfocytter i dette eksemplet. Andelen CD19+/CD5- B-celler er 3,72% i respektive pasienten.
Figur 2 viser eksempler på antistoff ytelse i Jurkat celler fast for ulike tidsperioder som vurdert av SDS side og Western Blot. Forskjellige antistoffer fra forskjellige produsenter ble analysert. Figur 2a viser resultatene for αNFAT2-antistoffer (klone 7A6) fra forskjellige produsenter oppdaget med en grønn fluorescerende anti-musen antistoff. Antistoffer av 1 viste binding til sin epitope uten fiksering (band A) og selv når Jurkat celler var fast for 2,5 min eller 5 min (band B eller C, henholdsvis). ΑNFAT2-antistoffer (klone 7A6) fra produsenten 2, derimot, viste en svakere ytelse selv i Jurkat celler ikke fast (band D). På fiksering oppnådd antistoffer av denne produsenten enda svakere resultater (band E (2,5 min fiksering) og F (5 min fiksering)). Figur 2b viser resultatene for αNFAT2-antistoffer (klone D15F1) fra en annen produsent oppdaget med en rød fluorescerende anti-kanin antistoff. Denne antistoff også utført svakt i ufestede prøver (band A) og fravær av et band angir maskering av sine epitope av fiksering (band B (2,5 min fiksering) og C (5 min fiksering)).
Figur 3 viser eksempler på skråstilte chromatin fra Jurkat cellene innhentet etter ulike fiksering og skråstilling for god og dårlig kvalitet som vurdert av gel geleelektroforese. Band A og B (0 min fiksering eller 2,5 min fiksering, henholdsvis) viser god kvalitet skåret chromatin, som er preget av en DNA fragment størrelse 200-500 bp som kan oppdages på en agarose gel som en typisk smøre. Skråstilte chromatin av dårlig kvalitet, derimot, kan gjenkjennes av nesten komplett eller fullstendig fravær av forventet DNA smear (band C) samt en smear i større eller mindre enn forventet fragment størrelse utvalg (band D-F). Den komplette fraværet av smear angir bruk av utilstrekkelige mengder starter materiale. Gjenkjenning av mindre DNA fragmenter hint til overdreven DNA klipping (band E) mens større DNA fragmenter hint til utilstrekkelig klipping.
Figur 4 viser resultatene av en typisk forsøk med Jurkat celler. LCK ble analysert som potensielle NFAT2 mål. IL-2 som er en godt definert mål genet av NFAT2 i T celler ble brukt som en positiv. Et IgG-kontroll antistoff ble benyttet for normalisering. Figur 4a viser et eksperiment med optimale resultater dokumentert av betydelig anriking av IL-2 positiv kontrollen. Fra dette eksperimentet, kan det konkluderes at det er en betydelig anriking av LCK sekvenser i utfelt DNA demonstrere at LCK er en direkte NFAT2 målet i Jurkat celler. Figur 4b viser et eksperiment utført med dårlig kvalitet DNA på grunn av manglende fiksering eller en suboptimal klipping prosedyre forårsaker en lav grad av berikelse i kontrollen IL-2 positiv.
Figur 5 viser resultatet av et eksperiment med primære menneskelige CLL celler. CD40L som er et kjent NFAT2 mål i B-celler som positive kontroll og LCK ble analysert eksperimentelle målet. Figur 5a viser et eksperiment med en betydelig grad av anriking av CD40L DNA i kontrollen positiv. Fra enda sterkere anriking av LCK DNA, kan det konkluderes at LCK er også en direkte NFAT2 målet i primære menneskeceller CLL. Figur 5b viser et eksperiment med dårlig kvalitet DNA sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig klipping. Ingen betydelige anriking av CD40L DNA ble oppdaget i positiv kontrollen rendering eksperimentelle data meningsløst.
Figur 1: eksemplarisk Flow cytometri analyse av CLL pasienter. (a) prøver av CLL pasienter ble analysert via flowcytometri etter farging med CD19-FITC og CD5-PE antistoffer og lymfocytter ble gated. (b) deretter andelen CD19+/CD5+ CLL celler og CD19+/CD5- B-cellene var bestemt. Her, CD19+/CD5+ CLL celler står for 89.03% av lymfocytter, mens CD19+/CD5- B-cellene representerer 3,72% av lymfocytter. En eksemplarisk pasienten vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempler på antistoff ytelse i fast Jurkat celler vurdert av SDS side og Western Blot. (a) Jurkat celler ble løst i 0 min (band A og D), 2,5 min (band B og E), eller 5 min (C og F) og αNFAT2-antistoffer (klone 7A6) fra forskjellige produsenter (band vekselstrøm = produsenten 1, band D-F = produsenten 2) ble sammenlignet. Antistoffer av 1 viste en bedre generell ytelse ved binding med høyere affinitet til fast prøver (sammenligne band vekselstrøm og band D-F). (b) αNFAT2-antistoff (klone D15F1) fra en annen produsent ble brukt. Denne antistoff viste bare en dårlig ytelse i ufestede prøver (band A) og epitope var maskert på fiksering. Derfor kan ingen binding av antistoffer bli oppdaget etter fiksering (band B og C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempler på chromatin av gode og dårlige klipping kvalitet fra Jurkat cellene vurdert av gel geleelektroforese. Jurkat cellene var fast og skåret for ulike tidsperioder. Fiksering ble gjort for 0 minutter (band A og D), 2,5 min (band B og E) eller 5 min (C og F). Klipping ble utført i 10 min (band vekselstrøm) eller 20 min (band D-F). Chromatin god klipping kvalitet er preget av en DNA fragment størrelse 200-500 bp som kan bli oppdaget som en smear i respektive regionen (band A og B). Chromatin av dårlig kvalitet kan bli gjenkjent ved en nesten komplett eller fullstendig fravær av DNA smøre på grunn av en utilstrekkelig mengde starter materiale brukt (band C) eller en smear i en mindre eller større størrelse region på grunn av upassende klipping forhold ( band D-F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ChIP Jurkat celler vurdert av qRT PCR. (a) NFAT2 binder til LCK og IL-2 arrangøren i Jurkat celler. Relativ anriking av LCK og IL-2 promoter regioner igangsatte med NFAT2 antistoffer vises som analyseres av qRT PCR. Tre uavhengige ChIP-eksperimenter vises som betyr ± SEM (Student t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) DNA fra prøver med dårlig kvalitet skråstilte chromatin ble brukt. Ingen relevante binding av NFAT2 til målet sekvenser kan oppdages. Et lignende bilde kan oppdages hvis det var ingen fiksering eller inkubasjon tiden med NFAT2 antistoffer var utilstrekkelig. Tre uavhengige ChIP-eksperimenter vises som betyr ± SEM (Student t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ChIP av primære CLL menneskeceller vurdert av qRT PCR. (a) NFAT2 bindes spesifikt til LCK og CD40L arrangører i primære menneskeceller CLL fra pasienter med en lat selvfølgelig av sykdommen. Diagrammet viser den relative anriking av LCK og CD40L promoter regioner igangsatte med NFAT2 antistoffer som analyseres av qRT PCR. Tre uavhengige ChIP-eksperimenter vises som betyr ± SEM (Student t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) DNA fra pasientprøvene med dårlig kvalitet skråstilte chromatin ble brukt. Ingen binding av NFAT2 til den respektive mål sekvenser kan observeres. Tre uavhengige ChIP-eksperimenter vises som betyr ± SEM (Student t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| element | volum (µL) per IP |
| 5% BSA | 6 |
| 100 x protease hemmer | 3 |
| 5 x ChIP-buffer 1 | 56 |
| skråstilte chromatin | x (15 µL eller 70 µL) |
| Protein A belagt magnetiske perler | 20 |
| ChIP seq klasse vann | 185-x-y |
| antistoff (αNFAT2 eller IgG-kontroll) | y (1.09 µL eller 1 µL) |
| Totalt | 270 |
Tabell 1: tidsplan for pipettering chromatin-immunoprecipitation. Chromatin immunoprecipitation ble utført ved å forberede reaksjonene som angitt i tabellen.
| element | volum (µL) per qRT PCR |
| immunoprecipitated DNA | 9 |
| qRT PCR Mix | 10 |
| primer frem (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| primer omvendt (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| Totalt | 20 |
Tabell 2: tidsplan for pipettering qRT-PCR. QRT-PCR ble utført ved å forberede reaksjonene som angitt i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktige skritt for å utføre en vellykket ChIP-analysen er utvalget av et passende antistoff og optimalisering av chromatin klippe prosessen25. Valg av αNFAT2 antistoffer viste seg for å være spesielt utfordrende under utviklingen av denne protokollen. Det finnes flere αNFAT2 antistoffer kommersielt tilgjengelig og fleste av disse arbeider fin for vestlige blotting og andre programmer, var klone 7A6 bare antistoffer som kan brukes med hell for ChIP7. Selv tilsynelatende utstilt identiske 7A6 antistoffer fra forskjellige produsenter signifikante forskjeller når det gjelder ytelsen i brikken. En stor utfordring er potensielle avbrudd i målet protein epitopes av fiksering prosessen brukes i XChIP protokoller25.
Chromatin skjæring prosedyren er også avgjørende for å skaffe passende resultater i XChIP. Et fragment størrelsen på 200-500 bp ble som vurdert av agarose gel geleelektroforese funnet for å være optimalt i denne NFAT2 ChIP protokollen7. Upassende klipping forhold som resulterer i mangel på DNA starter materiale eller DNA fragmenter av mindre eller større størrelse vanligvis føre til suboptimal resultater når du utfører denne analysen. Suboptimal klipping ble også observert ved frosne og rethawed PBMCs. Derfor, tiner PBMCs resulterte i en lavere avkastning av DNA fra celler i tillegg til en økning i overdreven klipping av DNA-fragmenter.
Tilgjengeligheten av et bredt spekter av ChIP kits og ChIP-grade antistoffer er utfordrende, men tilbyr også muligheten til å bruke teknikken i en bred sammenheng. Dermed kan et mangfold av transkripsjonsfaktorer undersøkes i forskjellige celletyper. For eksempel har andre medlemmer av familien NFAT (NFAT1 og NFAT4) blitt undersøkt nylig bruker ChIP35,36,37.
ChIP kit her også måtte endres for å passe våre behov. Først ble av fiksering justert til unngå maskering av epitope anerkjent av brukte antistoffer og aktivere optimal klipping. Antall buffere lyse og skjæring ble også endret for å redusere tap av celler i de ulike vask trinnene. I tillegg var klipping forholdene optimalisert for å få DNA fragmenter i området fra 200-500 bp. Den protease inhibitor og IgG-kontroll antistoffer ble utvekslet med andre tilsvarede reagenser som de viste seg for å være sammenlignbare og mer kostnadseffektive. Trinnet involverer bærer fra produsenten ble utelatt som det interfered med nedbør av DNA. Til slutt ble mengden bufferen til elute DNA tilpasset for å gi et tilstrekkelig volum i qRT-PCR.
Det finnes flere andre kits fra ulike selskaper og det er også muligheten til å utføre ChIP uten en kit. Men er testing og etableringen svært utfordrende, som det er mange faktorer tas i betraktning som kompatibiliteten til analysert celler og proteiner med forskjellige fiksering og skråstilling metoder. Den nevnte kit ble brukt som det var godt etablert i vårt laboratorium.
En stor begrensning av denne metoden er begrenset brukbarheten til de store undersøkelsene i intakt modell organismer fordi passende antistoffer har identifisert eller genereres for hver individuelle transkripsjon faktor. Analyse av gener som er uttrykt bare ved lave nivåer, i et lite antall av celler eller under en begrenset vinduet kan også være utfordrende med ChIP.
Mens ChIP er gull standard å demonstrere en direkte interaksjon med en gitt transkripsjon faktor med sin respektive målet gener i intakt eukaryote celler25, er det en rekke andre teknikker for å undersøke en interaksjon mellom proteiner og DNA . EMSA er en nyttig metode for å oppdage lav-overflod DNA bindende proteiner i celle lystates24. Det kan også brukes til å karakterisere den forpliktende tilhørighet til en bestemt protein gjennom en systematisk DNA sonde mutational analyse. En stor fordel med EMSA i forhold til ChIP er det faktum at det er vanligvis vesentlig mindre tid å etablere respektive analysen. DNA rullegardinmenyen analyser, microplate fangst og gjenkjenning analyser og reporter analyser er andre teknikker til å analysere protein-DNA interaksjoner23.
Nyere utviklingen har gjort det mulig å bruke ChIP analysen genomet hele tilnærminger av kombinasjonen med microarray teknologi (ChIP-on-chip)38,39,40 eller neste generasjons sekvensering (ChIP-Seq )41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av DFG gi MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe gi 111134 (både til M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for utmerket kundestøtte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).
