Summary
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) är den vanligaste leukemi i västvärlden. NFAT transkriptionsfaktorer är viktiga regulatorer av utveckling och aktivering i många celltyper. Här presenterar vi ett protokoll för användning av kromatin immunoprecipitation (ChIP) i mänskliga KLL celler att identifiera nya målgener av NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) kännetecknas av utbyggnaden av maligna B cell kloner och representerar de vanligaste leukemi i västvärlden. Majoriteten av patienter med KLL visar en indolent kurs av sjukdomen samt en anergic fenotyp av sin leukemiceller, hänvisar till en B-cell receptor okänslig för yttre stimulering. Vi har nyligen visat att den Transkriptionfaktorn NFAT2 är en viktig regulator av anergi i KLL. En stor utmaning i analysen av rollen av en transkriptionsfaktor i olika sjukdomar är identifiering av dess specifika målgener. Detta är av stor betydelse för förtydligandet av patogenetiska mekanismer och potentiella terapeutiska interventioner. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en klassisk teknik att demonstrera protein-DNA interaktioner och kan därför användas för att identifiera direkta målgener av transkriptionsfaktorer i däggdjursceller. Här användes ChIP att identifiera LCK som en direkt mål gen av NFAT2 i mänskliga KLL-celler. DNA och associerade proteiner tvärbunden med formaldehyd och därefter klippt av ultraljudsbehandling i DNA fragment av ca 200-500 baspar (bp). Tvärbunden DNA-fragment som är associerad med NFAT2 är sedan selektivt immunoprecipitated från cellfragment som använder en αNFAT2 antikropp. Efter rening upptäcks associerade DNA-fragmenten via kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydlig anrikning representerar regioner i genomet som är målriktade genom NFAT2 in-vivo. Lämpliga klippning av DNA och val av krävs antikroppen är särskilt avgörande för en framgångsrik tillämpning av denna metod. Detta protokoll är idealisk för demonstration av direkta interaktioner mellan NFAT2 och målgener. Dess största begränsningen är svårigheten att anställa ChIP i storskaliga analyser analysera mål generna av flera transkriptionsfaktorer i hela organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) representerar de vanligaste leukemi hos vuxna i västvärlden, uppvisar distinkta ansamling av CD19, CD23 och CD5 uttrycker mogna B-celler1. De flesta patienter uppvisar en indolent sjukdom kurs, vilket inte nödvändiggör särskild behandling under många år. Däremot uppvisar vissa patienter snabb progression som kräver omedelbar terapeutiska interventioner med immun-kemoterapi eller andra riktade terapier2,3. Nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT) är en familj av transkriptionsfaktorer som styr olika utvecklings och aktivering processer i många cell typer4,5,6. Vi visade nyligen överuttryck och konstitutionella aktiveringen av NFAT2 i KLL celler från patienter med indolent sjukdom7. Det reglerar här, ett tillstånd som inte svarar på B-cell receptorn stimulering kallas anergi7. För att visa att NFAT2 binder till promotorn lymfocyter-specifika protein tyrosine kinase (LCK) och reglerar LCK uttryck i mänskliga KLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) utvecklades och anställd.
ChIP är en av de flera teknikerna för att undersöka betydelsen av transkriptionsfaktorer i gen uttryck8. Genuttryck är tätt iscensatt i ett mycket komplext sätt av flera tillsynsmyndigheter med transkriptionsfaktorer som en oersättlig del i denna process9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer som reglerar genuttrycket i rumsliga och tidsmässiga sammanhang har identifierats i talrika arter (t.ex. för utveckling och differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fel i intrikata kontrollmekanismer som involverar transkriptionsfaktorer kan leda till en mängd olika patologiska processer inklusive cancer19,20. Identifiering av transkriptionsfaktorer och deras respektive mål kan därför erbjuda nya terapeutiska möjligheter21,22. För att undersöka detta spännande område finns flera metoder som ChIP, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA), olika DNA nedrullningsbara analyser och reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
För att visa att en viss transkriptionsfaktor interagerar med specifika regioner i genomet är in vivo ChIP en idealisk teknik25. För detta ändamål, är DNA och associerade proteiner i levande celler tvärbunden med hjälp av UV-bestrålning eller formaldehyd (tvärbunden ChIP, XChIP). Detta steg utelämnas att erhålla bättre DNA och protein återhämtning i den så kallade infödda ChIP (NChIP)26. De DNA-proteinkomplex är därefter klippt av ultraljudsbehandling i fragment av ca 200-500 baspar (bp) och immunoprecipitated från de cellfragment som använder en specifik antikropp mot Transkriptionfaktorn av intresse. De associerade DNA-fragment därefter renas och kännetecknas av PCR, molekylär kloning och sekvensering. Alternativa tekniker använda microarrays (ChIP-on-Chip) eller nästa generations sekvensering (ChIP-Seq) för att analysera immunoprecipitated DNA.
ChIP introducerades först av Gilmour och Lis 1984 när de använde UV ljus kovalent korslänk DNA och bundna proteiner i levande bakterier27. Vid cell lysis och immunoprecipitation bakteriell RNA-polymeras användes särskilda sonder av kända generna att mappa in-vivo distribution och täthet av RNA-polymeras. Metoden användes senare av samma utredarna för att analysera fördelningen av eukaryota RNA-polymeras II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysens förfinades ytterligare av Varshavsky och medarbetare som först används formaldehyd tvärbindningsmedel för att studera associering av Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Det NChIP synsättet, som bär fördelen med en bättre DNA och protein återhämtning beror på naturligt intakt epitoper och, därför, större antikropp specificitet, beskrevs först av Hebbes och kollegor i 198831.
Fördelen med ChIP i jämförelse med andra tekniker för att analysera DNA-protein interaktioner är i själva verket att faktiska växelverkan av en transkriptionsfaktor kan vara undersökta i vivo och ingen sonder eller konstgjorda förhållanden skapats av buffertar eller geler är anställd8,11,12. Genom att kombinera ChIP med nästa generations sekvensering, kan flera mål identifieras samtidigt.
Stora begränsningar av denna teknik är dess begränsad tillämplighet till storskaliga analyser i hela organismer25. Analysen av differentiell gen uttrycksmönster kan också vara utmanande med ChIP teknik om respektive proteinerna uttrycks endast vid låga nivåer eller under smala tidsfönster. En annan potentiellt begränsande faktor är tillgången på en lämplig antikropp lämpad för ChIP11.
Protokollet ChIP som presenteras här kan användas för identifiering i vivo av målgener av en transkriptionsfaktor av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet att identifiera nya målgener av NFAT2 vid KLL. ChIP valdes på grund av dess potential att direkt påvisa bindning av NFAT2 till arrangören regioner i olika målgener under naturliga förhållanden i mänskliga KLL patientens celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som utförs med humant material godkändes av den etiska kommittén av universitetar av Tübingen och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter som bidragit prover till denna studie.
1. isolering och stimulering av Jurkat celler
Obs: För att optimera protokollet, använda Jurkat cell linje som är känd att uttrycka de höga nivåerna av NFAT2. Alla åtgärder utförs under en LAF.
- Förbereda 50 mL RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS och 1% penicillin/streptomycin med uppvärmningen det till 37 ° C i ett vattenbad.
- Kultur Jurkat celler för 1-2 d i en cell kultur kolv vid 37 ° C och 5% CO2 i 20 mL RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS och 1% penicillin/streptomycin till en täthet av ca 2 x 106 celler/mL (celler räknas med Trypan blå färgning och en Neubauer avdelningen under mikroskopet) och skörda dem genom centrifugering för 5 min vid 200 x g.
- Ta bort supernatanten med en pipett och resuspendera cellerna i 10 mL RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS och 1% penicillin/streptomycin. Därefter räkna cellerna med en konventionell trypan blå färgning och en Neubauer kammare under mikroskopet.
- Centrifugera cellerna från steg 1.3 för 5 min vid 200 x g och ta bort supernatanten genom aspiration. Sedan resuspendera cellerna på en densitet på 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS och 1% penicillin/streptomycin och överför 1 mL i en ny konventionell 5 mL tub av pipettering.
- Stimulera cellerna genom att lägga till 32,4 nM phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) och 1 µM ionomycin. Sedan Inkubera cellerna för 16 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 med locket på tuben öppnas (för att undvika kontaminering, en tätning film som släpper igenom luft kan användas).
2. isolering och stimulering av primära KLL-celler från mänskliga patienter
Obs: Patientprover var förvärvat och stimuleras som tidigare beskrivna7. Alla åtgärder utförs under en LAF.
- Förbereda utrustningen som är nödvändig att dra blod från patienter och utföra en täthet lutning separation: 21-G nålar, tourniquet, NH4-heparin-blod insamling sprutor (t.ex. S-monovettes), 1 x PBS och täthet lutning medium (densitet 1.077 g/mL) .
- Vid venpunktion, dra upp blodet från KLL patienter (ca. 40 mL blod per patient) i sprutorna. Överför sedan blodet i 50 mL koniska rör. Tvätta sprutan med 10 mL PBS och pool blod-PBS-suspensionen i 50 mL rören (justera antalet tuber till volymen av blod).
- Förbereda 15 mL av täthet lutning medium i en färsk 50 mL koniska tub. Därefter lager 35 mL blod-PBS-suspensionen noggrant på täthet lutning medium. För detta ändamål håller röret i en platta vinkel och långsamt Pipettera blod-PBS-suspensionen mot väggens nedre av 50 mL koniska röret. Som mer blod-PBS-suspensionen ackumulerande i 50 mL koniska röret, öka vinkeln på röret upp till rät vinkel. Upprepa detta steg enligt volymen av blod-PBS-upphängning.
- Utföra centrifugering vid 560 x g i 20 min (utan bromsar), sedan extrahera fasen mononukleära celler som innehåller de perifera mononukleära blodcellerna (PBMC). Att göra det, samla vita interphasen av täthet lutning separation med 5 mL serologiska pipett och överföra den till en ny 50 mL koniska tub.
- Fyll cell-suspensionen till 50 mL med PBS och Centrifugera under 5 minuter vid 360 x g. Ta bort supernatanten genom aspiration. Upprepa detta steg med centrifugering för 5 min på 275 x g. Sedan, pool cellerna i en patient i 5-10 mL PBS i en 50 mL konisk tub.
- Räkna celler som beskrivs i 1.3.
Obs: Det beror på hur stor andel av KLL celler i de isolerade PBMC, om cellerna kan användas direkt för detta förfarande eller en B-cell isolering har ska genomföras, t.ex. via magnetiska cell sortering (Mac). B-cell isolering rekommenderas men kan utelämnas om andelen KLL celler är över 95% av totala lymfocyter (bestäms via flödescytometri). Blod av KLL patienter är fast och lyserat enligt tillverkarens anvisningar. Sedan en färgning med CD19-FITC och CD5-PE antikroppar utförs enligt tillverkarens anvisningar och cellerna analyseras via flödescytometri. En exemplarisk patient visas i figur 1, där andelen KLL celler är 89.03%. Således har en B-cell isolering ska utföras i denna patient. Andel av fysiologiska B-celler är försumbar (3.72% i exemplet). - Tvätta cellerna med 10 mL före värmde (37 ° C) RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM natrium pyruvat och 50 mM β-merkaptoetanol för 5 min vid 200 x g och ta bort supernatanten genom aspiration.
- Justera celler till 2 x 107 celler/mL i RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 100 mM icke-essentiella aminosyror, 1 mM natrium pyruvat och 50 mM β-merkaptoetanol (37 ° C) och fyll 1 mL cellsuspension i en 5 mL tub.
Obs: Den ß-merkaptoetanol är anställd för att motverka oxidativ stress. - Stimulera cellerna genom att lägga till 32,4 nM PMA och 1 µM ionomycin. Sedan Inkubera cellerna för 16 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 med locket på tuben öppnas (för att undvika kontaminering, en tätning film som släpper igenom luft kan användas).
Obs: För att minska stressnivån cellerna kan vara utvilad för 1 h vid 37 ° C och 5% CO2 i inkubatorn före 16 h av stimulering.
3. fixering, Cell Lysis och kromatin klippning
Obs: Patientprover och Jurkat celler är fast och lyserat med en kommersiellt tillgänglig ChIP kit enligt tillverkarens anvisningar med ändringar som tidigare beskrivits7. Upptagning utförs under en LAF.
- Förbereda ett 1,5 mL rör med 1 mL av 37% formaldehyd, ett 1,5 mL rör med 1 mL av 1,25 M glycin, en 5 mL tub med 4 mL 1 x PBS och en låda med is för fixering av cellerna.
- Efter stimulering av cellerna för respektive inkubationstiden i steg 1,5 eller 2,9, snurra 5 mL tuberna vid 200 x g i 5 min och resuspendera cellerna i 500 µL av PBS i 5 mL rör.
- Lägga till 340 µM formaldehyd (13,5 µL av 37% formaldehyd) i cellerna. Inkubera suspensionen för 2,5 min (Jurkat celler) eller 5 min (patientprov) vid rumstemperatur efter kort blandning av noggrant pipettering upp och ner.
Obs: Långvarig fixering tid behövs för primära celler att säkerställa optimal klippning. - Lägg till 125 mM glycin (57 µL av 1,25 M glycin) för att stoppa fixeringen och inkubera i en annan 5 min. sätta cellerna på is omedelbart därefter och centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten genom aspiration.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL iskallt PBS vid 200 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten varje gång av aspiration.
Obs: Efter fixeringen, protokollet kan pausas. Fast celler ska förvaras vid-80 ° C. För att testa, om epitop antikroppens avsåg att använda i följande protokoll inte maskeras via fixering, kan ytterligare prover användas för analys via SDS-PAGE gel-elektrofores och Western blot. Dessa steg genomförs med 100 µg protein enligt tillverkarens anvisningar. Alla αNFAT2 antikroppar används vid en spädningsgrad av 1: 1000, GAPDH antikroppen vid en spädning på 1:10000. En exemplarisk bild av fasta prover från Jurkat celler med lämpliga och olämpliga antikroppar visas i figur 2. - Återsuspendera cellpelleten i 5 mL av kommersiellt tillgängliga lyseringsbuffert 1 av pipettering upp och ner. Sedan placera proverna på isen på en shaker och inkubera dem i 10 min under omskakning.
Obs: Före Lys, cellerna kan vara desintegrerade för 10 s i flytande kväve. Detta är användbart för Jurkat celler men bör undvikas i primära patientprover. För sönderfall, placera 5 mL tuberna för 5 s i 5-10 mL flytande kväve i en särskild behållare. Bär skyddsglasögon och lämpliga skyddshandskar. - Därefter Centrifugera rören vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten noggrant genom pipettering.
- Homogenisera cellerna i 5 mL av kommersiellt tillgängliga lyseringsbuffert 2 genom pipettering upp och ner och inkubera i 10 min på is under omskakning. Sedan Centrifugera rören vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten noggrant genom pipettering.
- Återsuspendera cellpelleten i 500 µL (Jurkat celler) eller 140 µL (patientprover) klippning buffert 1 som innehåller 1 x proteashämmare (5 µL eller 1,4 µL, respektive) och inkubera blandningen i 10 min på is.
- För kromatin klippning, överföra 140 µL cellsuspension-från steg 3,9 in någon sonikator rören (Undvik producerar luftbubblor och upprepa detta steg om det behövs på grund av provvolymen). Placera rören i den fokusera ultra-någon sonikator vid en temperatur på 7 ° C och skjuvning i 10 min (cell linje) eller 7,5 min (patientprover) med en incident medeleffekt av 9,375 W att få 200-500 bp DNA-fragment.
- Slutligen, Centrifugera 15700 x g under 10 minuter vid 4 ° C i små centrifugen och samla supernatanten i en ny 1,5 mL tub.
- För att testa för lämpliga fragment storlekar, analysera 20 µL av klippt kromatinet via gel-elektrofores i 1,5% TBE agarosgel. En exemplarisk bild av klippt kromatin från Jurkat celler av bra och dåliga kvalitet visas i figur 3. Vid denna punkt, kan protokollet pausas potentiellt. Klippt kromatin ska förvaras vid-80 ° C.
4. kromatin Immunoprecipitation
Obs: Den kromatin immunoprecipitation utfördes med en kommersiellt tillgänglig ChIP kit enligt tillverkarens anvisningar med ändringar7.
- Beräkna antalet immunoprecipitations (70 µL (Jurkat celler) eller 15 µL (patientprover) klippt kromatin plus en antikropp) och förbereda 20 µL av protein A belagda pärlor per nederbörd i en 1,5 mL tub. Tvätta pärlorna i 40 µL 1 x ChIP buffert 1 per nederbörd genom pipettering upp och ner, låt pärlorna vila i en magnetisk rack för 1 min och ta bort supernatanten genom pipettering. Utföra detta steg fyra gånger totalt. Så småningom Återsuspendera pärlorna i den ursprungliga volymen med 1 x ChIP buffert 1.
- För immunoprecipitation själv, använda 10 µg av αNFAT2 antikropp ((7A6) för att fånga NFAT2 med dess bundna mål sekvenser. Använda 2,5 µg kanin IgG antikroppar (DA1E) som en IgG-kontroll. Förbereda reaktionerna i färska 1,5 mL rör som anges i tabell 1.
Obs: Det är viktigt att använda en monoklonal antikropp med hög affinitet vars epitop inte är maskerat under fixering för detta protokoll. Polyklonala antikroppar införa ytterligare en nivå av variation vilket gör det betydligt svårare att korrekt tolka de erhållna resultaten. - Inkubera blandningen från steg 4,2 övernattning på 4 ° C på en roterande hjul vid 6 rpm.
- På nästa dag snurra rören för 5 s vid 7000 x g i små centrifugen, inkubera dem i en magnetisk rack för 1 min och ta bort supernatanten genom aspiration. Tvätta pärlorna en gång med varje tvätt buffertar 1, 2, 3 och 4 i följd.
- Till gör så, Återsuspendera pärlorna i 350 μl tvättbuffert och inkubera dem i 5 minuter vid 4 ° C på en roterande hjul vid 6 rpm.
- Därefter snurra rören för 5 s vid 7000 x g i små centrifugen. Sedan placera dem för 1 min i en magnetisk rack, avlägsna supernatanten och lägga till nästa tvättbuffert.
- Efter det sista steget-tvättning ta bort supernatanten genom pipettering, tar upp pärlorna i 100 µL av eluering buffert 1 och inkubera dem i 30 min på ett roterande hjul vid 6 rpm.
- Snurra rören inom kort (5 s vid 7000 x g i den liten centrifugen) och placera dem i en magnetisk rack för 1 min.
- Sedan överför supernatanten genom pipettering till en ny 1,5 mL tub och tillsätt 4 µL eluering buffert 2.
- Skapa de ingående kontrollen, genom att blanda 1 µL klippt kromatinet med 99 µL av eluering buffert 1 och 4 µL eluering buffert 2 (i den här installationen finns det tre rör per patient: en inmatningsenhet kontroll, en IgG-kontroll och ett αNFAT2 prov).
- Inkubera proverna för 4 h vid 65 ° C och 1300 rpm i en 1,5 mL tub shaker. Tillsätt 100 µL av 100% isopropanol, vortex och spin proverna för 5 s vid 7000 x g i små centrifugen.
- Återsuspendera tillgängliga magnetiska pärlor av grundligt vortexa, tillsätt 10 µL av pärlor i varje prov och inkubera i 1 h i rumstemperatur på en roterande hjul vid 6 rpm.
- Efter inkubering, snurra rören för 5 s vid 7000 x g i lilla Centrifugera och placera dem för 1 min i en magnetisk rack. Ta bort supernatanten genom aspiration.
- Återsuspendera pärlorna i 100 µL av tvättbuffert 1. Invertera rören för att blanda och inkubera i 5 min i rumstemperatur på en roterande hjul vid 6 rpm.
- Snurra rören för 5 s vid 7000 x g i små centrifugen, placera dem i 1 min i en magnetisk rack och ta bort supernatanten genom pipettering. Upprepa stegen 4.13-4.14 med tvättbuffert 2.
- Därefter ta bort tvättbuffert genom aspiration, Omsuspendera pärlorna i 55 µL eluering buffert och inkubera i 15 min i rumstemperatur på det roterande hjulet vid 6 rpm till eluera utfällda DNA. Slutligen, snurra rören för 5 s vid 7000 x g i små centrifugen, placera dem i 1 min i en magnetisk rack och överför supernatanten till nya 1,5 mL rör.
Obs: Här protokollet kan potentiellt pausas. Eluerade DNA ska sedan förvaras vid-20 ° C.
5. detektion av NFAT målgener i KLL celler.
- Genomföra qRT-PCR reaktionen i duplikat för varje prov som anges i tabell 2.
Obs: För detektion av målgener en kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) utförs med en kommersiellt tillgänglig qRT-PCR-Mix med en Real-time PCR-instrumentet. - Använd vit 96 brunnar reaktion plattor för reaktionerna och RT-PCR-instrumentet. De cykling villkoren är följande: 95 ° C i 30 s, [95 ° C i 5 s, 60 ° C under 30 s] x 40 cykler.
Obs: En seriell utspädning av input (outspädd eller utspädd 1:10, 1: 100 och 1: 1000 i nuclease-fritt vatten) används för att beräkna den relativa anrikningen. I Jurkat celler användes IL-2 som en positiv kontroll32. CD40L, ett välkänt mål för NFAT2 i B-celler, användes som en positiv kontroll i KLL celler och LCK som ett exempel för en roman målgenen av NFAT2 i KLL33,34. Primers för regionen CD40L, IL-2 och LCK arrangören beskrivs i tabellen av särskilda reagenser och utrustning.
6. normalisering och dataanalys
Obs: Relativa anrikningen för regionerna som arrangören av intresse (IL-2, CD40L eller LCK) beräknas med hjälp av IgG-kontrollen för normalisering.
- Först bestämma Ct (tröskelvärde cykel) värdena för ingående seriell utspädning, IL-2, CD40L och regionen LCK arrangören via programvaran utvärdering från qRT-PCR data.
- Definiera en standardkurva för koncentrationerna via seriell utspädning av indata. Beräkna koncentrationen för IL-2, CD40L och regionen LCK promotorn för varje kopia av varje prov med denna standardkurvan.
- Nästa, beräkna medelvärdet av dubbletter. Ställ sedan IgG immunoprecipitation provet som referens. Definiera den relativa anrikningen för provet som 1.0 och jämföra andra provet (från den NFAT2 immunoprecipitation) denna referens.
- Slutligen, beräkna den relativa anrikningen genom att dividera koncentrationen av proverna av koncentrationen av IgG hänvisningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en exemplarisk Flödesanalys flödescytometri av KLL patienten utförs efter färgning med CD19-FITC och CD5-PE-antikroppar. Figur 1a visar den gating av lymfocyter, som representerar majoriteten av celler i blodet hos patienter med KLL. Figur 1b visar andelen CD19+/CD5+ KLL-celler, som representerar 89.03% av lymfocyter i detta exempel. Andelen av CD19+/CD5– B-celler är 3,72 procent i respektive patient.
Figur 2 visar exempel på antikropp prestanda i Jurkat celler fast för olika tidsperioder enligt bedömning av SDS-PAGE och Western Blot. Olika antikroppar från olika tillverkare analyserades. Figur 2a visar resultaten av αNFAT2-antikropp (klon (7A6) från olika tillverkare identifieras med en grön fluorescerande antimus-antikropp. Antikroppen tillverkare 1 visade bindande till dess epitop utan fixering (band A) och även när Jurkat celler har fastställts för 2,5 min eller 5 min (band B eller C, respektive). ΑNFAT2-antikroppen (klon (7A6) från tillverkaren 2, däremot, visade en svagare utveckling även i Jurkat celler inte fast (band D). Vid fixering uppnått antikroppen av denna producent ännu svagare resultat (band E (2,5 min fixering) och F (5 min fixering)). Figur 2b visar resultaten av αNFAT2-antikropp (klon D15F1) från en annan tillverkare med en röd fluorescerande anti-kanin antikroppar upptäckts. Denna antikropp utförs också svagt i ofixerade prover (band A) och avsaknad av ett band indikerar maskering av dess epitop av fixering (band B (2,5 min fixering) och C (5 min fixering)).
Figur 3 visar exempel på klippt kromatin från Jurkat celler som erhållits efter olika fixering och klippning tider av bra och dålig kvalitet enligt bedömning av gel elektrofores. Band A och B (0 min fixering eller 2,5 min fixering, respektive) Visa god kvalitet klippt kromatin, som kännetecknas av en DNA fragment storlek på 200-500 bp som kan upptäckas på en agarosgel som ett typisk utstryk. Klippt kromatin av dålig kvalitet, däremot, kan kännas igen av nästan komplett eller total avsaknad av förväntade DNA utstryket (C band) samt ett utstryk i en större eller mindre än förväntade fragment storleksintervall (band D-F). Komplett avsaknad av utstryket anger användningen av otillräckliga mängder av utgångsmaterial. Upptäckt av mindre DNA fragment tips till överdriven DNA klippning (band E) medan större DNA fragment antydan till otillräcklig klippning.
Figur 4 visar resultaten av en typisk experiment med Jurkat celler. LCK analyserades som potentiella NFAT2 mål. IL-2 som är en väldefinierad målgenen av NFAT2 i T-celler användes som positiv kontroll. En IgG-kontroll antikropp utnyttjades för normalisering. Figur 4a visar ett experiment med optimala resultat dokumenteras av betydande anrikning av IL-2 positiv kontroll. Från detta experiment, kan det konstateras att det finns en betydande berikning av LCK sekvenser i utfällda DNA visar att LCK är en direkt NFAT2 mål i Jurkat celler. Figur 4b visar ett experiment som utförts med dålig kvalitet DNA på grund av fixering eller ett suboptimalt klippning förfarande som orsakar en låg grad av anrikning i IL-2 positiv kontroll saknas.
Figur 5 visar resultatet av ett experiment som utförs med primära humana KLL-celler. CD40L som är en känd NFAT2 mål i B-celler som tjänade som positiv kontroll och LCK analyserades som experimentella mål. Figur 5a visar ett experiment med en betydande nivå av anrikning av CD40L DNA i den positiva kontrollen. Från ännu starkare anrikningen av LCK DNA, kunde slutsatsen dras att LCK är också en direkt NFAT2 mål i primära mänskliga KLL-celler. Figur 5b visar ett experiment som utförs med dålig kvalitet DNA troligen på grund av otillräcklig klippning. Inga betydande anrikning av CD40L DNA kunde upptäckas i den positiva kontrollen rendering experimentella data meningslös.
Figur 1: exemplariskt Flow flödescytometri analys av patienter med KLL. a prover av KLL patienter analyserades via flödescytometri efter färgning med CD19-FITC och CD5-PE antikroppar och lymfocyter var inhängnat. (b) därefter andelen CD19+/CD5+ CLL celler och CD19+/CD5– B-celler bestämdes. Här, CD19+/CD5+ CLL celler 89.03 procent av lymfocyter, medan CD19+/CD5– B celler representerar 3.72% av lymfocyter. En exemplarisk patient visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på antikropp prestanda i fast Jurkat celler utvärderas av SDS-PAGE och Western-Blot. a Jurkat cellerna fastställdes för 0 min (band A och D), 2,5 min (band B och E), eller 5 min (C och F) och αNFAT2-antikroppen (klon (7A6) från olika tillverkare (band A-C = tillverkare 1, band D-F = tillverkare (2) jämfördes. Antikroppen tillverkare 1 visade en bättre övergripande prestanda, bindande med högre affinitet till fasta prover (jämför band A-C och band D-F). (b) αNFAT2-antikropp (klon D15F1) från en annan tillverkare har använts. Denna antikropp visade bara en dålig prestanda i ofixerade prover (band A) och epitop var maskerade vid fixering. Därför kunde ingen bindning av antikroppen påvisas efter fixering (band B och C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på kromatin av bra och dålig klippning kvalitet från Jurkat celler bedömas med gelelektrofores. Jurkat cellerna var fast och klippt för olika tidsperioder. Fixering skedde för 0 min (band A och D), 2,5 min (band B och E) eller 5 min (C och F). Klippning utfördes antingen i 10 min (band A-C) eller 20 min (band D-F). Kromatin klippning bra kännetecknas av en DNA fragment storlek på 200-500 bp som kan upptäckas som ett utstryk i respektive region (band A och B). Kromatin av dålig kvalitet kan identifieras antingen av fullständig eller nästan fullständig avsaknad av DNA smeta på grund av ett otillräckligt belopp av utgångsmaterial används (C band) eller av ett utstryk i en mindre eller större storlek region på grund av olämpligt klippning () villkor band D-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ChIP Jurkat celler bedömt qRT-PCR. (a) NFAT2 binder till LCK och IL-2 arrangören i Jurkat celler. Den relativa anrikningen av LCK och IL-2 arrangören regioner fälls ut med NFAT2 antikroppen visas som analyseras av qRT-PCR. Tre oberoende ChIP-experiment visas som menar ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) DNA från prover med dålig kvalitet klippt kromatin användes. Inga relevanta bindning av NFAT2 till de mål sekvenserna kunde detekteras. En liknande bild kan upptäckas om det fanns ingen fixering eller inkubationstiden med NFAT2 antikroppen var otillräcklig. Tre oberoende ChIP-experiment visas som menar ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ChIP av primära mänskliga KLL-celler bedömt qRT-PCR. (a) NFAT2 binder specifikt till LCK och CD40L initiativtagarna i primära mänskliga KLL-celler från patienter med en indolent jagar av sjukdomen. Diagrammet visar den relativa anrikningen av LCK och CD40L arrangören regioner fälls ut med NFAT2 antikroppen som analyseras av qRT-PCR. Tre oberoende ChIP-experiment visas som menar ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001). (b) DNA från patientprover med dålig kvalitet klippt kromatin användes. Ingen bindning av NFAT2 till de respektiva mål sekvenserna kunde observeras. Tre oberoende ChIP-experiment visas som menar ± SEM (Students t-test, * P < 0,05; ** P < 0,01 *** P < 0,001) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| objekt | volym (µL) per IP |
| 5% BSA | 6 |
| 100 x proteashämmare | 3 |
| 5 x ChIP buffert 1 | 56 |
| klippt kromatin | x (15 µL eller 70 µL) |
| Protein A belagda magnetiska pärlor | 20 |
| ChIP seq grade vatten | 185-x-y |
| antikropp (αNFAT2 eller IgG-kontroll) | y (1,09 µL eller 1 µL) |
| Totalt | 270 |
Tabell 1: schema för pipettering av kromatin immunoprecipitation. Den kromatin immunoprecipitation utfördes genom att förbereda reaktionerna som anges i tabellen.
| objekt | volym (µL) per qRT-PCR |
| immunoprecipitated DNA | 9 |
| qRT-PCR-Mix | 10 |
| primer framåt (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| primer omvänd (LCK/CD40L/IL-2) | 0,5 |
| Totalt | 20 |
Tabell 2: schema för pipettering qRT-PCR. QRT-PCR utfördes genom att förbereda reaktionerna som anges i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg för att utföra en lyckad ChIP-analysen är valet av en lämplig antikropp och optimering av den kromatin klippning process25. Valet av αNFAT2 antikroppen visat sig vara särskilt utmanande under utvecklingen av detta protokoll. Medan det finns flera αNFAT2 antikroppar kommersiellt tillgänglig och majoriteten av dessa fungerar bra för western blotting och andra applikationer, var klon 7A6 den enda antikropp som kan användas framgångsrikt för ChIP7. Även förment uppvisade identiska 7A6 antikroppar från olika tillverkare signifikanta skillnader med avseende på deras resultat i ChIP. En stor utmaning är den potentiella störningen i mål protein epitoper av fixering processen används i XChIP protokoll25.
Den kromatin klippning förfarande är också kritisk för att förvärva lämpliga resultat i XChIP. En fragment storlek på 200-500 bp befanns enligt bedömning av agaros gel-elektrofores vara optimala i detta NFAT2 ChIP protokoll7. Olämpliga klippning tillstånd som resulterar i en brist på DNA utgångsmaterial eller DNA-fragment av större eller mindre storlek brukar leda till suboptimala resultat när du utför denna analys. Suboptimal klippning observerades också när du använder frysta och rethawed PBMC. därav, upptining av PBMC resulterade i en lägre avkastning av DNA från celler samt en ökning av överdriven klippning av DNA-fragment.
Tillgången till ett brett utbud av ChIP kit och ChIP-grade antikroppar är utmanande, men erbjuder också möjligheten att använda tekniken i ett brett sammanhang. En mångfald av transkriptionsfaktorer kan således undersökas i olika celltyper. Exempelvis har andra medlemmar av familjen NFAT (NFAT1 och NFAT4) utretts nyligen använda ChIP35,36,37.
ChIP kit används här hade också ändras för att passa våra behov. Först justerades tidpunkten för fixering att undvika maskering av de epitop som erkänns av begagnade antikroppen och för att möjliggöra optimal klippning. Volymen av buffertar används för lys och klippning har också ändrats för att minska förlusten av celler under olika tvätt stegen. Dessutom var klippning villkoren optimerad för att få DNA-fragment i intervallet 200-500 bp. Proteashämmare och IgG-kontroll antikroppen växlades med andra kommersiellt tillgängliga reagenser som de visat sig vara jämförbara och mer kostnadseffektivt. Det steget som berör transportören som tillhandahålls av tillverkaren utelämnades som det stört efter utfällning av DNA. I slutändan var mängden buffert som används för att eluera DNA anpassad för att ge en tillräcklig volym för att användas i qRT-PCR.
Det finns flera andra kit från olika företag och det finns också möjlighet att utföra ChIP utan ett kit. Testning och etablering är dock mycket utmanande, eftersom det finns många faktorer som måste beaktas, som analyserade celler och proteiner förenlighet med olika fixering och klippning metoder. Nämnda satsen användes som det var väl etablerad i vårt laboratorium.
En större begränsning med denna metod är dess begränsad tillämplighet till de storskaliga undersökningarna i intakt modellorganismer eftersom lämpliga antikroppar måste identifieras eller genereras för varje enskild transkriptionsfaktor. Analys av gener som uttrycks endast vid låga nivåer, i ett litet antal celler eller under en begränsad tid kan också vara svårt med ChIP.
ChIP är den gyllene standarden att påvisa direkt interaktion av en viss transkriptionsfaktor med dess respektive målgener i intakt eukaryota celler25, finns det ett antal andra tekniker för att utreda ett samspel mellan proteiner och DNA . EMSA är en användbar metod för att upptäcka låg-överflöd DNA-bindande proteiner i cellen lystates24. Det kan också användas för att karaktärisera affinitet av ett visst protein genom en systematisk DNA sonden mutationsanalys analys. En stor fördel med EMSA jämfört med ChIP är det faktum att det är generellt betydligt mindre tidskrävande att fastställa de respektive analysen. DNA nedrullningsbara analyser, mikroplattan fånga och upptäckt analyser och reporter analyser finns andra metoder att analysera protein-DNA interaktioner23.
Senaste utvecklingen har gjort det möjligt att tillämpa ChIP analysen genome-wide närmandena vid dess kombination med microarray technology (ChIP-on-chip)38,39,40 eller nästa generations sekvensering (ChIP-Seq )41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av DFGEN bevilja MU 3340/1-1 och den Deutsche Krebshilfe bevilja 111134 (båda tilldelas M.R.M.). Vi tackar Elke Malenke för utmärkt tekniskt bistånd).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).
