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Cancer Research

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.

Abstract

Potencialização dos hostis antibodies monoclonal (mAb) por agentes quimioterápicos constitui uma estratégia valiosa para a concepção de terapia eficaz e segura contra o câncer. Aqui nós fornecemos um protocolo para identificar uma combinação racional na etapa pré-clínica. Primeiro, nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar o sinergismo entre mAb anticâncer e drogas citotóxicas, que utiliza a equação de índice de combinação de Chou e Talalay1. Isso inclui a medição de tumor celular droga-anticorpo-sensibilidade e usando um ensaio de MTT, seguido por uma análise automatizada de computador para calcular os valores de índice (CI) de combinação. Valores de CI de < 1 indicar sinergismo entre mAbs testado e agentes citotóxicos1. Para corroborar o em vitro achados na vivo, descrevemos mais um método para avaliar a eficácia do regime de combinação em um modelo de tumor de enxerto. Neste modelo, o regime combinado significativamente atrasa o crescimento do tumor, o que resulta em uma significativa sobrevivência prolongada em comparação com controles de único agente. Importante, a experimentação na vivo revela que o regime de combinação é bem tolerado. Este protocolo permite a avaliação eficaz das combinações de drogas anticâncer em modelos pré-clínicos e a identificação de uma combinação racional de avaliar em ensaios clínicos.

Introduction

A abordagem convencional no tratamento de um grande número de diferentes tipos de câncer foi baseada em monoterapia. Mesmo que ainda é usado em muitos casos, este método encontrou vários obstáculos levando a optar por terapias combinadas2. Particularmente, as células cancerosas são mais suscetíveis a desenvolver resistência quando tratados com uma única droga através da indução de sobrevivência alternativa mecanismos3, resultando em falha terapêutica em pacientes4. Além disso, em monoterapia, drogas são administradas geralmente em uma dose alta. Essa situação geralmente resulta da ocorrência de fortes efeitos colaterais de dose-dependente que pode ser intolerável e forçar os médicos a parar o tratamento2. Por estas razões, a associação de moléculas anticâncer é agora preferiu em monoterapia.

Combinações de drogas ideal seriam aqueles que agem em sinergia contra células tumorais, sem maior toxicidade contra células normais. Sinergismo refere-se a interação de duas ou mais drogas que produz um efeito terapêutico maior que a soma de cada fármaco individual agindo separadamente. Tais interações podem resultar em maior eficácia terapêutica clínica2. Isso limita a resistência de tratamento aumenta a eficácia e também pode reduzir a toxicidade2. Na verdade, a dose de cada fármaco pode ser reduzida para diminuir seus efeitos colaterais, orientando caminhos diferentes. Além disso, uma das moléculas também pode servir como um agente de sensibilização contra células cancerosas. O efeito da segunda droga pode ser melhorado em células sensibilizadas e menos dosagens podem ser usado5.

Terapia combinada pode incluir dois ou mais quimioterápicos e/ou produtos biológicos, tais como anticorpos monoclonais6. Esses mAbs voltados especificamente para as células expressando um antígeno de superfície celular de interesse e são capazes de matar células tumorais através de vias imunológicas, incluindo a citotoxicidade mediada por células do anticorpo-dependente (ADCC), com a participação de células imunes efetoras 7e citotoxicidade complemento-dependente (CDC)6. Eles também podem atuar através de um mecanismo não-imunológica mediado por apoptose8,9,10,11. Neste caso, a indução do processo de morte celular programada pode sensibilizar as células cancerosas, enfraquecer sua função e que a droga associada quimioterápico mais eficazes em uma dosagem mais baixa. Como tal, proapoptotic mAb são bons candidatos para a concepção de regimes de combinação com fármacos antineoplásicos.

Diferentes modelos matemáticos têm sido descritos para avaliar sinergismo de drogas; um deles é baseado na combinação índice método1. Este método baseia-se no princípio da mediana-efeito desenvolvido por Chou1. A equação da mediana-efeito correlaciona a dose da droga e o efeito de drogas como segue.

Equation 1

Aqui, D é a dose de drogas; DM é a dose mediana-efeito; FA é a fração que afetaram a dose; m é um expoente que significa a forma do dose-efeito trama1. A dose de mediana-efeito é usada para calcular a dose Dx de uma droga que inibe ou mata "x" por cento das células. O valor de CI é então calculado para avaliar o efeito aditivo da combinação de drogas, da seguinte forma1.

Equation 2

CI o valor 1 indica um efeito aditivo e um valor de CI de < 1 indica um efeito sinérgico, enquanto um valor de CI de > 1 indica o antagonismo1. A aplicação deste método é facilitada pela disponibilidade de um programa de computador, CompuSyn, que determina o sinergismo e antagonismo em todas as doses ou níveis de efeito automaticamente simularam12.

O nosso grupo desenvolveu o mAb 8B6 específico para O-acetil-GD2 gangliosídeos (OAcGD2) neuroblastoma antígeno13 e ainda mais demonstrado que este mAb é capaz de induzir a morte celular com atributos de apoptosis11. Para testar se o mAb 8B6 pode sensibilizar as células de neuroblastoma de Topotecano o agente antineoplásicos, adaptamos o método acima mencionado, desenvolvido por Chou1. Primeiro, vemos a dose efetiva 50 (ED50) valores de mAb 8B6 e Topotecam. Em seguida, as células de neuroblastoma com equipotent rácios dos dois compostos com base nos valores de50 ED são expostas para determinar os valores de CI usando o software de simulação acima mencionados. Este método nos permite demonstrar sinergismo entre mAb 8B6 e Topotecano em vitro. Em seguida, descreveremos um protocolo para avaliar a potência e a segurança desta combinação regime na vivo. Este protocolo pode ser facilmente aplicado para selecionar mAb anticâncer potente e seguro e agente quimioterapêutico combinações em estudos pré-clínicos. Uma representação esquemática deste estudo é fornecida na Figura 1.

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Protocol

Alojamento dos animais e procedimento experimental foram aprovados pelo governo francês (acordos #C44-278 e #APAFIS 03479.01). Procedimentos e cuidados com animais foram conduzidos sob a Directiva UE 2010/63/CE e Lei n ° 2013 #-118 relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.

1. avaliação da interação de droga entre mAb 8B6 e Topotecano In Vitro

  1. preparação da amostra de 96 poços
    Atenção: Consultar a Comissão de saúde e segurança da instituição e seguir as regras do regulamento local relacionadas a segurança do laboratório. Reveja as informações de Material e a ficha de dados de segurança antes de trabalhar com qualquer mídia, linhas celulares ou reagentes. Utilizar técnica asséptica adequada e trabalho em uma capa de fluxo laminar. Todas as soluções/equipamentos que são usados para manipular as células devem ser estéreis.
    Nota: O seguinte protocolo foi projetado para uso com células aderentes. As modificações são necessárias para aplicar o método de células crescendo em suspensão; Este protocolo usa quatro exemplares para cada condição experimental.
    1. Desenvolvem-se células de IMR5 num balão T75.
    2. No primeiro dia (dia 0), observe a cultura de células sob um microscópio para verificar a confluência de célula. Aspire o meio celular do frasco, lave-o com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) e adicionar 3 mL de 0,05% o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) / solução de PBS. Retorne o frasco para a incubadora por 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Examine a cultura de células sob um microscópio para o destacamento de célula.
      Nota: Se necessário, retorne o frasco para a incubadora para um adicional 3 a 5 min, dependendo do tipo de células do tumor.
    4. Adicionar 10 mL de meio de célula completa no balão e transferir a suspensão de células para um tubo cônico estéril 15 mL. Centrifugar as células durante 5 min à 300 x g. Conte as células usando um hemocytometer.
    5. Remover e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet de células em um meio completo. Ajuste o volume médio para obter uma concentração final de 1 x 105 células/mL.
    6. Poços de semente 84 de uma placa de cultura de 96 poços com 104 células cada, que é de 100 µ l de suspensão de células. Siga o layout experimental mostrado na Figura 2.
    7. Incube as celulas para 18 h na incubadora celular (37 ° C, 5% CO2).
  2. Preparação da solução medicamentosa
    Nota: Para estudos de sensibilização de drogas/mAb, modifica a altura, o comprimento e o tratamento de concentração de acordo com o droga/mAb específico em questão. Observe que a concentração inicial é de 3 x a concentração final.
    1. Na manhã seguinte (dia 1), prepare as seguintes soluções de drogas usando o meio de crescimento completo.
      1. preparação de solução do mAb
        1. Dilua o mAb em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução de trabalho de anticorpo com uma concentração de mAb 240 µ g/ml.
        2. Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.
      2. Preparação de solução de Topotecano
        1. Diluído, como acima, a droga em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução de trabalho de drogas com uma concentração final de 120 nM.
        2. Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.
      3. Preparação de solução anticorpo e drogas
        1. Dilua as soluções de drogas e mAb em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução em 120 nM droga e mAb 240 µ g/mL (solução de trabalho).
        2. Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.
    2. Para obter a concentração final, transferi 50 µ l de cada solução de drogas para os poços correspondentes, conforme indicado no layout experimental ( Figura 2).
      Nota: Transferi 50 µ l de meio de cultura completo para os poços de célula não tratada, conforme indicado na Figura 2.
    3. Incube as celulas para 72 h na incubadora (37 ° C, 5% CO2).
  3. Ensaio de MTT
    1. Adicione 10 µ l de solução de reagente MTT em cada poço.
    2. Incube a 37 ° C por 4 h.
    3. Adicione 100 µ l de solução de lise (10% SDS em 0,01 M HCl) em cada poço, usando uma pipeta multicanal e misture bem por pipetagem.
    4. Incube a 37 ° C por 4 horas em uma câmara umidificada (95% de umidade).
    5. Ler a absorvância a 570 nm (570) e 620 nm (620), utilizando um espectrofotômetro.
      Nota: Misturar cada amostra novamente pipetando antes de ler a absorvância; absorvância a 620 nm permite a correção dos valores de fundo inespecífica.
    6. Calcular a absorbância corrigida: corrigido absorbância = um570- um620.
    7. Calcular a viabilidade celular da seguinte maneira: viabilidade celular = 100 x (média corrigida absorvância da amostra / controle de média de absorbância corrigida).
    8. Calcular os valores afetados por fração (Fa) usando a seguinte equação: 1 - (média corrigida absorvância da amostra / controle de média de absorbância corrigida).
  4. Software de simulação analítica de interação de droga para single e estudos de combinação de drogas
    1. Execute o software de simulação para abrir a janela de início.
    2. Clique no botão para abrir a janela principal de Nova experiência .
    3. Digite o nome do experimento na janela de nome .
      Nota: A data pode ser adicionada na janela Data .
    4. Clique no botão Nova droga única .
    5. Digite o nome na janela Nome completo .
    6. Digite a abreviatura na janela abrev .
    7. Digite a unidade de concentração de droga na janela unidades .
    8. Inserir Dados ponto 1 Dose e valor de Fa, pressione Enter.
    9. Repita este passo até que todos os pontos de dados são inseridos.
    10. Clique no botão terminado .
    11. Siga os mesmos passos para inserir pontos de dados do mAb.
      Nota: Use a mesma unidade de concentração como é usado por droga.
    12. Clique no botão Nova combinação de drogas .
    13. Selecione a droga e mAb.
    14. Selecione a Relação constante e clique no Okey.
    15. Digite o nome na janela Nome completo .
    16. Digite a abreviatura na janela abrev .
    17. Digite a relação de drogas/mAb na proporção da janela.
    18. Insira Dados ponto 1 Dose e pressione Enter.
      Nota: O programa automaticamente irá calcular as doses de mAb e Combo.
    19. Insira o valor de Dados ponto 1 Fa e pressione Enter.
    20. Repita este passo até que todos os pontos de dados são inseridos.
    21. Clique no botão concluído e, em seguida, clique no botão Gerar relatório .
    22. Selecione a droga e mAb e, clique em Okey.
    23. Selecione o Combo e, clique em Okey.
    24. Selecione o cabeçalho, CI tabelae quadro-resumo. Em seguida, clique em Okey.
    25. Digite o nome do arquivo do arquivo de análise e clique em salvar para gerar o relatório.
      Nota: Depois de clicar Okey, o relatório será aberto automaticamente no navegador de web padrão do computador.
    26. Para imprimir o relatório, escolha Imprimir no menu arquivo do navegador da web. O relatório contém uma seção de tabela de resumo que inclui título, data, nome do arquivo, nota de descrição, parâmetros (m, Dm e r), ED50 para qualquer agente usado em monoterapia ou em combinação e a tabela de CI para cada combinação de ED50, ED 75, ED90e ED95.
      Nota: Um CI valor de < 1 indica sinergismo, um valor de CI de = 1 indica a aditividade e um valor de CI de > 1 indica o antagonismo.

2. geração de Xenografts humanos Neuroblastoma em obesos diabéticos NOD Gamma Scid Mice (NSG ratos)

Nota: Exclui qualquer contaminação da cultura de pilha. Desde que a matriz da membrana basal forma um gel acima de 5 ° C, todos os cultureware ou entrar em contato com o reagente de matriz de membrana basal de mídia deve ser prechilled/gelo-frio. Manter a matriz da membrana basal no gelo durante todo o processo.

  1. Preparação da suspensão de células de IMR5
    1. Descongele o reagente de matriz de membrana basal durante a noite, submergindo o frasco no gelo em um frigorífico de 4 ° C antes do uso.
    2. No dia 0, colha as IMR5 pilhas cultivadas como detalhado acima.
    3. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar x g por 5 min.
    4. Desprezar o sobrenadante. Lavar as células 2 x com 15 mL de PBS gelado e preparar uma suspensão de células de 5 x 107 células/mL de PBS gelado.
      Nota: Se necessário, transferi a suspensão de células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    5. Agite o frasco de matriz de membrana basal.
      Nota: O reagente de matriz de membrana basal deve ser descongelado e dispersos.
    6. Adicionar um volume de reagente de matriz da membrana basal e misture pipetando para obter uma suspensão de células de 2.5 x 107 células /mL.
    7. Manter a suspensão de células no gelo.
  2. Preparação dos ratos
    Nota: Os ratos devem ser seis ou sete semanas de idade.
    1. Manter os ratos sob uma condição específica de agentes patogénicos.
    2. Permita um período de aclimatação de três a cinco dias depois chegaram os ratos.
    3. No dia da inoculação, raspar o flanco onde será a injeção (consulte a etapa 2.3.6).
  3. Preparação da injeção de células de tumor
    Nota: Manter a suspensão de células de matriz gelada da membrana basal asséptica durante o procedimento.
    1. Misture as células e cuidadosamente desenhar a suspensão de células em uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha 21G.
    2. Verifique se que não há nenhuma bolha de ar na seringa.
    3. Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.
    4. Aperte suavemente a pele do rato no flanco entre os dedos, no local da injeção.
    5. Insira a agulha exatamente a dobra de pele. Não coloque a agulha profundamente no tecido para garantir uma injeção subcutânea.
    6. Injete 100 µ l de suspensão de células IMR5 (ou seja, 2,5 x 106 células) por via subcutânea no flanco direito inferior dos ratos.
    7. Gire a seringa para evitar fugas e retirar a agulha.
  4. Monitoramento de alterações de peso do corpo e o crescimento do tumor
    1. Medir o comprimento (A) e a largura (B) do tumor com uma pinça.
    2. Calcule o volume do tumor usando a fórmula (A x B2) x 0,5.
    3. Inicie a terapia quando os tumores têm alcançado um volume médio de ~ 50-60 mm3.

3. drogas e administração de anticorpos em ratos

  1. Administração intravenosa de mAb 8B6
    1. Com cuidado, encha uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha 25g com solução do mAb.
    2. Coloque o mouse sob uma lâmpada de calor por 10 min dilatar a veia da cauda.
    3. Contenha o mouse em uma retenção de roedor.
    4. Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.
    5. Insira a agulha paralelamente a veia da cauda, penetrante 2-4 mm para o lúmen, mantendo o bisel da face de agulha para cima (Figura 3A).
    6. Injetar 100 µ l de solução de anticorpos por via intravenosa (i.v.).
    7. Terminada a injeção, suavemente, pressão no local da injeção para prevenir hemorragias.
  2. Administração intraperitoneal de Topotecano
    1. Desenhe a solução de drogas em uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha de 25 G.
    2. Segure o mouse na posição supina, com a extremidade posterior ligeiramente elevada.
    3. Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.
    4. Localize a linha mediana de abdômen do rato e mentalmente, dividir o abdome em quadrantes. Localize o local da injeção no quadrante inferior direito ou esquerdo (Figura 3B).
    5. Insira a agulha no abdômen (5 mm de profundidade) em ângulo de ~ 10°, no quadrante inferior direito ou esquerdo.
    6. Injetar 100 µ l de solução de fármaco intraperitonealmente (i.p.).
    7. Desinfecte o local da inoculação.

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Representative Results

Os resultados representativos e figuras são adaptadas com a permissão de trabalho anteriormente publicado14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 sinergicamente aumenta os efeitos inibitórios de Topotecano no crescimento de linha de células de Neuroblastoma:

Para estabelecer a droga e as concentrações de anticorpos deve ser usado para avaliar o sinergismo entre 8B6 Topotecano e mAb, a droga e as sensibilidades de anticorpo de IMR5 humana, células de neuroblastoma foram medidas em primeiro lugar, usando um ensaio de MTT. Exposição a mAb 8B6 ou Topotecano sozinho para 72 h resultou em uma inibição concentração-dependente da viabilidade celular de IMR5 (Figura 4A). Curvas dose-resposta permitiu o cálculo do ED50 valores para cada composto. Para este fim, os valores de Fa foram calculados usando o software de simulação de análise. Os valores calculados de50 ED foram encontrados para ser 10 nM ± 1 para Topotecano (Figura 4B) e 18 µ g/mL ± 3 para mAb 8B6 (dados não mostrados).

Com base nesses valores de50 ED, em seguida, a potência de seis equipotent combinacional rácios de mAb 8B6 e Topotecano foram testados (Figura 2). O deslocamento da curva de dose-resposta de combinação para o lado sensível do gráfico indica que o regime de combinação é mais potente que cada monoterapia (Figura 4A). Para obter os valores de CI e correspondente ED50 , foram calculados os valores de Fa. Os valores de50 ED de Topotecano foram significativamente menores na presença de 8B6 mAb (p < 0,05, Figura 4B), indicando que mAb 8B6 sensibiliza a célula de tumor de Topotecano. Importante, os valores de CI foram significativamente menos de 1.0 (p < 0,05), demonstrando uma interação sinérgica (Figura 5). Assim, o mAb 8B6 tem o potencial como agente terapêutico para Topotecano quimioterapia adjuvante.

MAb anti-OAcGD2 8B6 realça Antitumor atividade de Topotecano In Vivo

Porque em vitro modelos também não levam em conta a meia-vida de droga nem o metabolismo das drogas, é necessário corroborar a em vitro achados em vivo. Além disso, na vivo modelos são muito úteis para avaliar a segurança do regime de combinação. Para confirmar que o sinergismo entre Topotecano e mAb 8B6 era específico para as células cancerosas, foram avaliados os efeitos antineuroblastoma da terapia de combinação em um modelo de transplante do tumor. Por isso, a cepa de rato NSG imunodeficientes grave foi selecionada. Estes ratos faltam uma inata e um sistema imune adaptativo de15e, portanto, tornam possível que pesquisadores de excluir quaisquer efeitos imunomoduladores induzidos pela terapia de Topotecano que pode afetar a potência do mAb. O tratamento foi iniciado uma vez que os tumores exibido um volume médio de 50 ± 2,5 mm3 (figura 6A). Os tratamentos consistiram de qualquer 8B6 mAb (150 µ g i.v., dia 7 e dia 11), Topotecano (0,36 mg/kg, i.p., dias 7-11), ou uma combinação de mAb 8B6 e Topotecam. Os volumes de tumor foram monitorados durante o curso da experimentação. Todas as terapias levaram ao atraso de crescimento do tumor em comparação com grupos de controle (figura 6A). O regime de combinação, no entanto, induziu o efeito mais forte (figura 6A).

O crescimento do tumor pode ser analisado ainda mais para estudar a taxa de sobrevivência após o tratamento. Para este fim, o evento resultando em eutanásia rato foi definido como o tumor volume ≥ 1 cm3 por razões éticas. Isso nos permitiu realizar uma análise de sobrevivência de Kaplan-Meyer e para calcular o tempo de sobrevida livre de evento média para cada grupo experimental. Como mostrado na Figura 6B, ambos monotherapies melhorado substancialmente a sobrevivência livre de evento (EFS) quando comparado ao grupo controle (a mediana EFS do grupo tratados com veículo era de 21 dias; do grupo controle de anticorpo, 22 dias; do grupo Topotecano, 26 dias ; do mAb 8B6 grupo, 29 dias [Figura 6B]). Ainda, a terapia combinada teve o efeito mais forte sobre a sobrevivência de ratos, com uma mediana de EFS alargadas a 39,5 dias (p < 0.05, mAb 8B6 vs combinação; p < 0,01, Topotecano vs combinação [Figura 6B]).

Porque interações sinérgicas podem resultar em toxicidade aumentada, a segurança do regime de combinação deve ser avaliada. Como tal, a perda de peso é comumente usada como um marcador sensível para monitoramento de integridade em roedores16. Assim, peso perda-medido como um declínio em percentagem do peso inicial-foi mantido como um indicador da tolerabilidade sistêmica de cada regime testado. Observou-se sem perda de peso corporal, sugerir que o tratamento foi bem tolerado (Figura 7). Estes dados sugerem que a combinação de Topotecano e mAb 8B6 representa um mais potente eficácia antitumoral em vivo do que qualquer agente sozinho, sem toxicidade detectável.

Figure 1
Figura 1 : Representação esquemática do estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Layout do experimento combinação em uma placa de 96 poços, com rácios de Topotecano-para-mAb 8B6, preparado como seis soluções. As soluções foram preparadas como descrito no protocolo. Poços rotulados de 1 a 4 servem como mAb 8B6 soluções, poços rotulados de 5 a 8 servem como soluções de Topotecano, e poços rotulados de 9 a 12 servem como mAb 8B6 e Topotecano (combinação) soluções. Poços rotulados A e H servir como controles; poços rotulados B servem como 0,125 x soluções de droga concentração50 ED; poços rotulados C servem como 0,25 x soluções de droga concentração50 ED; poços rotulados D servem como 0.5 x soluções de droga concentração50 ED; poços rotulados E serve como soluções de droga concentração50 ED; poços rotulados F servem como 2 x soluções de droga concentração50 ED; poços rotulados G servem como 4 x soluções de droga concentração50 ED, conforme indicado. Agentes terapêuticos com duas unidades diferentes (isto é, µ g/mL para o mAb 8B6 e nM para Topotecano) são analisados em uma combinação de taxa fixa (0.075, Topotecano/8B6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Injeções. (A) injeção intravenosa na veia de cauda de um rato comedido, usando uma seringa de insulina de 27 x 1/2, em 1 mL. (B) injeção Intraperitoneal para o quadrante inferior direito do abdômen do rato, utilizando uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha de 25 G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Relação dose-efeito de Topotecano e sua combinação na inibição de viabilidade do crescimento de células de neuroblastoma de IMR5 após 72 h de exposição mAb 8B6. Um ensaio de MTT foi realizado conforme descrito no protocolo. Curvas (A), a dose-resposta mostradas são representativos de três repetições independentes, cada um executado em quadruplicates. Os dados são apresentados como a média ± DP; p < 0,001. (B) ED50 de Topotecano, usado como agente único ou em combinação com 8B6 mAb. Os dados são apresentados como a média ± SEM. Esta figura foi modificada de Faraj et al 14. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Valores de índice de combinação. Valores de sobrevivência de porcentagem foram transformados em valores de (Fa) fração afetadas e usados para calcular o índice de combinação (medida de sinergia, aditividade e antagonismo) utilizando o software de computador, conforme indicado no texto. Nas tramas combinação índice, os dados são apresentados como média ± DP de três repetições independentes. Os resultados mostram que 8B6 mAb teve um efeito sinérgico com Topotecano (CI < 1). Esta figura foi modificada de Faraj et al 14. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Tratamento de combinação de xenografts IMR5 em camundongos NSG com mAb 8B6 além de Topotecano. (A) ratos rolamento neuroblastoma humano IMR5 xenografts foram tratados com veículo (PBS, i.p.), Topotecano sozinho (0,36 mg/kg, i.p.), controlar IgG sozinho (150 µ g, i.v.), mAb 8B6 sozinho (i.v.) ou Topotecano e mAb 8B6 combinado, conforme indicado. A administração do tratamento de anticorpo 8B6 ou controle mAb começou no dia 7 após a inoculação de células IMR5 e repetiu-se uma vez no dia 11. O Topotecano ou tratamento de PBS começou no dia 7 e era para cinco dias consecutivos. O crescimento do tumor foi monitorizado, e calcularam-se volumes de tumor. O tumor médio volume ± SEM de cada grupo de tratamento (grupo PBS, 9 ratos; todos os outros grupos, 10 ratos) são retratados (* p < 0.05 para mAb 8B6 contra 8B6 mAb e Topotecano junto, * * p < 0,01 para Topotecano contra mAb 8B6 e Topotecano junto), como indicado. Observou-se uma redução significativa no volume de enxerto para a combinação 8B6/Topotecano mAb, em comparação com os controles de drogas sozinho, como indicado (p < 0,05). (B) evento-livre são mostradas as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meyer de diferentes grupos tratados. Esta figura foi modificada de Faraj et al 14. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Significa o peso para cada grupo de tratamento, conforme indicado. O peso médio dos ratos no dia 0 foi definido como 100%, em peso. O peso de cada grupo se manteve estável durante o período de tratamento. Os dados são apresentados como a média ± SEM. Esta figura foi modificada de Faraj et al 14. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para prever o efeito de interações medicamentosas, podem ser usados três métodos: a metodologia de isobologram17, a mistura não-linear modelo18e a combinação do índice1. Análise do índice de combinação é o mais comumente usado porque sua aplicação é simplificada pela disponibilidade de um programa de computador user-friendly. Para esta finalidade, nós primeiro caracteriza a resposta de dose-efeito de cada agente usado sozinho ou em combinação, através da realização de um ensaio MTT19. Esta metodologia baseia-se na capacidade das células viáveis para reduzir o sal de tetrazólio em um produto formazan de cor roxa, com um máximo de absorbância de 570 nm19. A morte, as células perdem a capacidade de converter MTT em formazan. Assim, a quantidade do produto formazan colorido é proporcional ao número de células viáveis na cultura19. Com efeito, escolhemos esta metodologia como uma alternativa nonradioactive para a incorporação de timidina tritiada em DNA para a medição de proliferação celular19. Como tal, MTT ensaios tem sido amplamente adotados e continuam a ser populares em laboratórios acadêmicos, como evidenciado por milhares de artigos publicados. Enquanto a quantidade de formazan é medida pela gravação da absorvância a 570 nm, utilizando um Espectrofotômetro de leitura de placa, comprimento de onda de referência de 620 nm às vezes é usado, mas não é necessário para a maioria das condições de ensaio. Tendo em consideração a etapa crítica descrita aqui, descobrimos que as condições de cultura utilizadas para cultivar células podem afetar os resultados dos ensaios MTT. Nós achamos que o número de células viáveis, a atividade metabólica da célula, a idade das culturas e o número de passagens e detalhes do meio de crescimento podem ser fatores importantes. Assim, devem ser tomadas em consideração quando repetir o ensaio e análise de dados. Além disso, as condições de cultura celular são diferentes para cada linha de celular. É, assim, complicado para fornecer que qualquer clara indicações sobre a célula de densidade de semeadura. Como regra geral, recomenda-se um número médio de células entre 2.000-10.000 células por poço conseguir uma densidade de célula ideal dentro de 72 h. importante, redução de MTT reflete o metabolismo celular viável e não, especificamente, proliferação de células ou morte de células. Portanto, MTT ensaios nem devem ser descritos como medição proliferação de células nem celular citotoxicidade20,11. A detecção de morte celular se baseia em ensaios cell-based específicos. Por exemplo, em estudos anteriores, usamos análise ocidental do borrão para detectar a ativação de caspase 3 e/ou fluxo cytometry análise para detectar a fosfatidilserina no folheto da membrana externa do plasma, para evidenciar a atividade proapoptotic do mAb 8B613.

Quando a combinação de teste de drogas, podem ser entregues juntos ou sucessivamente no tempo. Dada a variedade do mecanismo de ação, é difícil fornecer orientações precisas para a configuração experimental relevante. Ainda, a maioria dos investigadores utilizam testes diretos de combinações de drogas. Além disso, as concentrações que produzem um efeito único agente definido de inibição do crescimento celular 50% são comumente usadas. Concentrações de drogas, refletindo as concentrações plasmáticas alcançáveis em pacientes são comumente consideradas relevantes clinicamente. Como tal, a análise de dose-efeito de combinação é executada para várias doses, mantendo a proporção de combinação constante com uma diluição serial da (ED50)mAb/relação dedrogas (ED.50), embora não seja uma exigência absoluta 1. da nota, os valores de CI devem ser também calculados em diversos ED testado (por exemplo, ED50, ED75e ED90) porque eles podem alterar com o Fa em uma maneira não-linear1. Depois de executar a análise automatizada dos valores de CI, o coeficiente de correlação linear r-valor estimado pelos algoritmos deve ser > 0,9, para refletir a bondade do ajuste dos dados experimentais. Valores de CI de < 1 indicar sinergia, valores de CI de = 1 indicar aditividade e valores de CI de > 1 denotar antagonismo1. Devido à variabilidade em ambos os métodos experimentais e o sistema biológico, o CI calculado mais deve ser submetido a análise estatística. Como tal, é um método simples para repetir o experimento de combinação de drogas várias vezes seguido o cálculo dos valores de CI resultantes antes de determinar as estatísticas da média ± SD1. Também é aconselhável testar a combinação no painel maior possível da linha de celular, para ter em conta a variabilidade que existe entre eles.

Importante, vários parâmetros no estudo em vitro não são tomados em consideração para a extrapolação na vivo . Por exemplo, em vitro viabilidade ensaios que nem levar em consideração o Half-Life no vivo de droga, nem na vivo metabolismo de drogas que pode resultar na inativação de drogas. Assim, a extrapolação do in vitro , in vivo permanece uma questão separada, e a droga benéfica interação evidenciada em vitro deve ser ainda mais confirmado em vivo. Como tal, uma clara demonstração da sinergia em camundongos rolamento xenografts tumor, usando o método de índice de combinação, tem sido publicado21. Ainda, na vivo estudos exigem um grande número de animais para definir com precisão a sinergia e são mais caros e mais demorados. O modelo alternativo eficaz F-teste ainda exige recursos substanciais22. Como uma abordagem diferente para limitar o uso de um grande número de animais consiste em demonstrar a sinergia de droga em modelos de cultura celular seguido pelas provas de uma maior resposta antitumoral da combinação em um enxerto heterólogo limitado estudo14, usamos as células de neuroblastoma humano IMR5 como o destino do tumor para o estudo em vivo . Mantivemos as células IMR5, porque eles são oncogenicidade em ratos imunodeprimidos23. Enquanto modelos de enxerto de tumor humano fornecem modelos valiosos para testar combinações de drogas na vivo24, pode ser difícil estabelecer tais modelos a partir de uma variedade de linhas de célula25. Para aumentar a incidência de formação de tumor em camundongos, células podem ser injetadas em camundongos com uma matriz de porão de membrana como um veículo de25. Importante, desde que a matriz de porão de membrana se polimeriza e solidifica a temperaturas acima de 5 ° C, todos cultureware ou meios de entrar em contato com a matriz de porão de membrana devem ser prechilled/gelo-frio, e as soluções do porão de membrana devem ser mantidas gelo durante o processo inteiro de25. Com o uso da matriz da membrana do porão, observamos uma taxa de 100% para com células de IMR5, enquanto, na ausência de matriz de porão de membrana, esta linha de celular demonstrou um < 80% tomam taxa (dados não mostrados). Além disso, para aumentar a incidência de enxerto de tumor, matriz de porão de membrana também pode aumentar o de taxa de crescimento do tumor25. Observou-se que todos os xenografts tinham aparecido por dia 11. No entanto, durante os primeiros sete dias após o desafio de células do tumor, a presença de nódulos pode ser observada, que pode ser causada pela presença de inóculo inicial (dados não mostrados). Assim, nós não considerou as medições do tamanho do tumor significativo antes deste horário. Usando a matriz de porão de membrana, foi possível reduzir o número de ratos no cenário experimental e para realizar o experimento na vivo no prazo de três meses.

Dosagens de drogas/anticorpo podem variar consoante a tensão de linha e rato de célula. Devido à limitação do ensaio de viabilidade em vitro para extrapolar a dose droga/anticorpo na vivo descrita acima, dosagens clinicamente relevantes foram retidas para ambos Topotecano e mAb 8B6 na configuração experimental na vivo , com base nos dados publicados por outros26,,27. Para extrapolar a configuração de dosagem humana aos ratos, foram seguidas orientações anteriormente publicado28 . Propriamente dita, nós injetamos 150 µ g de soro de anticorpos 8B6 no dia 7, seguido por uma segunda injeção, cinco dias depois (total dose/rato = 300 µ g). Tratamento de Topotecano começou no mesmo dia como a primeira injeção de 8B6 mAb injetando Topotecano 0,36 mg/kg ou PBS controle i.p. durante cinco dias consecutivos. Tendo em consideração a etapa crítica descrita aqui, recomendamos começar infusões de anticorpo quando os xenografts tumor atingir ~ 50 mm3. Maiores volumes de enxerto heterólogo tumor resultará em uma menor taxa de resposta porque fardos de tumor claramente correlacionam inversamente com a concentração de anticorpos e exposição de anticorpo anticorpo eficácia29. Também manteve a perda de peso como um indicador de tolerabilidade sistêmica de cada regime testado16. No entanto, a interpretação dos pesos coletados não pode ser útil com um tumor grande massa. Neste caso, corpo condição de pontuação, conforme descrito em outro lugar16, aconselha.

Tumores podem ser coletados em pontos de tempo diferentes para análise imunoquímica, para fornecer mais informações sobre o mecanismo de ação desencadeada em vivo. Em um trabalho anterior, o índice de apoptotic tumor foi avaliado após mAb 8B6 infusão13. Para este fim, pilhas apoptotic de tumor foram detectadas usando um TUNEL ensaio13. Além disso, a percentagem de núcleos de células de tumor foi marcada com Ki67 antígeno-positivo coloração para analisar a proliferação de tumor índice13.

Camundongos imunodeficientes graves faltam de imunidade inata e adaptativa com a perda de células T, células B e células de (NK) assassinos naturais com reduzida macrófago e funções de célula apresentadora de antígeno e a ausência de circulação complementar30. Assim, este protocolo não permite que os pesquisadores tirar quaisquer conclusões sobre efeitos putativos de quimioterapia em potenciando mAb terapia, alterando o microambiente tumor na vivo31. No entanto, ambos efeitos imunomoduladores putativo do agente quimioterápico e o papel da região (Fc) fragmento cristalizável o mAb em reforçar a actividade antitumoral de drogas merecem consideração, mas estas questões exigem a disponibilidade de um modelo syngeneic com um sistema imune intacto e um microambiente do tumor fisiológica.

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Disclosures

S.Fa., J.F. e S.B. são designados como inventores do pendente patentes cobrindo a aplicação clínica de anticorpos terapêuticos anti-O-acetil-GD2.

Acknowledgments

Conceder apoio: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, Ligue La contre le Cancer Comitê de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e Comitê de Vendée, une rosa pour S.A.R.A.H., L'Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les Cânceres et les leucémies de L'enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. e J.F. são suportados pela La Liga Contre Le Cancer. Os autores graças a UTE-facilidade da estrutura Fédérative de Recherche François Bonamy. Os autores também agradecer o Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) para fornecer as células IMR5 e a Sra. H. Estéphan para a assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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