Summary
Denne protokol beskriver hvordan man vurdere synergi mellem en anticancer antistof og antineoplastiske stoffer i prækliniske modeller ved hjælp af kombination indeks ligning af Chou og Talalay.
Abstract
Potensering af fjendtlige monoklonale antistoffer (mAb) af kemoterapeutiske stoffer udgør en værdifuld strategi til design effektiv og sikker behandling mod kræft. Her giver vi en protokol for at identificere en rationel kombination på den prækliniske trin. Først, vi beskriver en celle-baseret analyse for at vurdere den synergi mellem anticancer mAb og cytotoksiske stoffer, der bruger kombination indeks ligning af Chou og Talalay1. Dette omfatter måling af tumor celle stof og antistof-følsomhed ved hjælp af en MTT assay, efterfulgt af en automatiseret computer analyse til at beregne kombination indeks (CI) værdier. CI værdier i < 1 angive synergi mellem testet mAbs og cytotoksiske agenser1. For at underbygge den in vitro- resultaterne i vivo, vi yderligere at beskrive en metode til at vurdere kombination regime effektiviteten i en xenograft tumor model. I denne model forsinker den kombinerede regime betydeligt tumorvækst, hvilket resulterer i en betydelig udvidet overlevelse i forhold til single-agent kontrol. Vigtigere, afslører i vivo forsøg, at kombination regime er veltolereret. Denne protokol giver mulighed for en effektiv evaluering af anticancer narkotika kombinationer i prækliniske modeller og identifikation af rationel kombination at evaluere i kliniske forsøg.
Introduction
Den konventionelle tilgang til behandling af et stort antal forskellige typer kræft var baseret på monoterapi. Selv hvis det bruges stadig i mange tilfælde, mødte denne metode flere forhindringer fører til vælger kombinerede terapier2. Navnlig, er kræftceller mere modtagelige for at udvikle resistens når behandlet med en enkelt drug ved at inducere alternative overlevelse mekanismer3, hvilket resulterer i behandlingssvigt i patienter4. Derudover i monoterapi, er narkotika normalt administreres på en høj dosis. Denne situation ofte resulterer i forekomsten af stærk dosisafhængig bivirkninger, der kan være uacceptabel og tvinge læger til at stoppe behandling2. Af disse grunde, Sammenslutningen af anticancer molekyler er nu foretrukket at monoterapi.
Ideel drug kombinationer vil være dem, som handle i synergi mod tumorceller, uden øget toksicitet mod normale celler. Synergi refererer til samspillet mellem to eller flere stoffer, der producerer en terapeutisk effekt større end summen af hver enkelt drug handler separat. Sådanne interaktioner kan resultere i forbedrede kliniske terapeutiske virkning2. Det begrænser behandling modstand, øger effektiviteten og kan også reducere toksicitet2. I virkeligheden, kan dosis af hvert stof reduceres til at sænke deres bivirkninger ved at målrette forskellige veje. Desuden kan en af molekylerne også tjene som en sensibiliserende agens mod kræftceller. Effekten af den anden medicin kan forbedres på overfølsomme over celler og færre doser kan være brugt5.
Kombineret behandling kan indeholde to eller flere kemoterapeutiske stoffer og/eller biologiske lægemidler, såsom monoklonale antistoffer6. Disse mAbs målrettet mod celler, der udtrykker en celle overflade antigen af interesse og er i stand til at dræbe tumorceller gennem immunologiske veje herunder antistof-afhængige celle-medieret cytotoksicitet (ADCC), med inddragelse af immun effektor celler 7, og komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC)6. De kan også handle via en ikke-immunologiske mekanisme medieret apoptose8,9,10,11. I dette tilfælde kan induktion af programmeret celledød processen bevidstgøre kræftceller svække deres funktion og effektivisere den tilknyttede kemoterapeutiske stof ved en lavere dosering. Som sådan proapoptotic mAb er gode kandidater til at designe kombination regimer med antineoplastiske stoffer.
Forskellige matematiske modeller er blevet beskrevet til at vurdere stoffet synergi; en af dem er baseret på kombination indeks metode1. Denne metode er baseret på median-effekt princippet udviklet af Chou1. Median-effekt ligning korrelerer stof dosis og narkotika virkning som følger.
Her, er D stof dosis; DM er den dosis, median-effekt; FA er den fraktion, påvirket af dosis; m er en eksponent, der angiver formen af dosis-effekt plot1. Median-effekt dosis bruges til at beregne dosis Dx af et stof, der hæmmer eller dræber "x" procent af celler. CI værdien beregnes derefter for at vurdere stoffet kombination, som følger1additiv virkning.
CI værdien 1 angiver en additiv effekt og et CI værdien af < 1 angiver en synergistisk effekt, mens en CI-værdi på > 1 angiver antagonisme1. Anvendelsen af denne metode er yderligere fremmet af tilgængeligheden af et edb-program, CompuSyn, der bestemmer synergi og antagonisme på alle doser eller effekt niveauer simuleret automatisk12.
Vores gruppe har udviklet mAb 8B6 specifikke for O-acetyl-GD2 ganglioside (OAcGD2) neuroblastoma antigen13 og yderligere vist at denne mAb er i stand til at fremkalde celledød med attributter af apoptose11. For at teste, om mAb 8B6 kan bevidstgøre neuroblastoma celler til antineoplastisk agent topotecan, tilpasset vi den ovennævnte metode udviklet af Chou1. Først, vi bestemme de effektive dosis 50 (ED50) værdier af mAb 8B6 og topotecan. Næste, neuroblastoma celler med equipotent forhold mellem de to forbindelser baseret på ED50 værdier er udsat for at bestemme de CI værdier ved hjælp af ovennævnte simulation software. Denne metode gør det muligt for os at demonstrere synergi mellem mAb 8B6 og topotecan in vitro. Næste, vi beskriver en protokol for at yderligere vurdere styrken og sikkerheden af denne kombination regime i vivo. Denne protokol kan nemt anvendes for at markere potente og sikre anticancer mAb og kemoterapeutiske agent kombinationer i prækliniske studier. En skematisk gengivelse af denne undersøgelse er fastsat i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Staldfaciliteter og eksperimentel procedure blev godkendt af den franske regering (aftaler #C44-278 og #APAFIS 03479.01). Dyrs pleje og procedurer blev gennemført under direktiv EU 2010/63/EU og fransk lov #2013-118 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. evaluering af Drug interaktion mellem mAb 8B6 og Topotecan In Vitro
- 96-brønd prøveforberedelse
Forsigtig: Høre institutionens arbejdsmiljø udvalg og følge lokale forordning regler relateret til laboratoriet sikkerhed. Gennemgå oplysninger om materiale og sikkerhedsdatabladet før du arbejder med medier, cellelinjer eller reagenser. Brug ordentlig steril teknik og arbejde i en laminar flow hætte. Alle løsninger/udstyr, der bruges til at manipulere celler skal være steril.
Bemærk: Følgende protokol var designet til brug med vedhængende celler. Ændringer er forpligtet til at anvende metoden til nonadherent celler vokser i suspension; denne protokol bruger fire eksemplarer for hver eksperimentelle betingelse.- Vokse IMR5 celler i en kolbe på T75.
- Observere cellekultur under et mikroskop for at kontrollere den celle confluency på den første dag (dag 0). Opsug den celle medium fra kolben, vaske det med 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 3 mL 0,05% ethylendiamintetra syre (EDTA) / PBS løsning. Vende kolben til rugemaskine for 3 min (37 ° C, 5% CO2).
- Undersøge cellekultur under et mikroskop for celle detachement.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, retur kolben til rugemaskine for en yderligere 3-5 min, afhængig af tumor celletype. - Kolben tilsaettes 10 mL af komplet celle medium og overføre cellesuspension til en steril 15 mL konisk slange. Der centrifugeres celler i 5 min på 300 x g. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Fjern og kassér supernatanten. Resuspenderes celle i komplet vækstmediet. Justere den medium volumen for at opnå en endelig koncentration på 1 x 105 celler/mL.
- Frø 84 wells af en 96-og kultur plade med 104 celler hver, som er 100 µL af cellesuspension. Følg den eksperimentelle layout vist i figur 2.
- Inkuber celler til 18 h i celle inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Drug løsning forberedelse
Bemærk: For drug/mAb sensibilisering undersøgelser, ændre timingen, længde og koncentration behandling der passer til den særlige stof/mAb pågældende. Bemærk, at den oprindelige koncentration 3 x endelige koncentration.- Den næste morgen (dag 1), forberede de følgende narkotika løsninger ved hjælp af komplet vækstmediet.
-
mAb løsning forberedelse
- Fortyndes Mas i 500 µL af komplet vækstmediet at opnå et antistof brugsopløsning med en mAb koncentration af 240 µg/mL.
- Udføre fem dobbelte serielle fortyndinger, som angivet i figur 2.
-
Topotecan løsning forberedelse
- Fortyndet, som ovenfor, at stoffet i 500 µL af komplet vækstmediet at opnå en drug brugsopløsning med en endelig koncentration på 120 nM.
- Udføre fem dobbelte serielle fortyndinger, som angivet i figur 2.
-
Antistof og narkotika løsning forberedelse
- Fortynd stof og mAb løsningerne i 500 µL af komplet vækstmediet at opnå en løsning på 120 nM stof og 240 µg/mL mAb (brugsopløsning).
- Udføre fem dobbelte serielle fortyndinger, som angivet i figur 2.
-
mAb løsning forberedelse
- For at nå frem til den endelige koncentration, overføre 50 µL af hver enkelt drug løsning til de tilsvarende wells, som angivet i den eksperimentelle layout ( figur 2).
Bemærk: Overføre 50 µL af komplet vækstmediet i ubehandlet celle wells, som angivet i figur 2. - Inkuber celler for 72 h i inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Den næste morgen (dag 1), forberede de følgende narkotika løsninger ved hjælp af komplet vækstmediet.
- MTT assay
- Tilføje 10 µL af MTT reagens løsning i hver brønd.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
- Tilsæt 100 µL af lysis løsning (10% SDS i 0,01 M HCl) i hver brønd, ved hjælp af en multikanalpipette, og blandes grundigt af pipettering.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer i en fugtig kammer (95% fugtighed).
- Læse absorbans ved 570 nm (en570) og 620 nm (en620) ved hjælp af et spektrofotometer.
Bemærk: Mix hver prøve igen af pipettering før læsning absorbans; absorbans på 620 nm giver mulighed for korrektion af uspecifik baggrundsværdierne. - Beregne den korrigerede absorbans: korrigeret absorbans = en570- en620.
- Beregne cellernes levedygtighed som følger: cellernes levedygtighed = 100 x (prøve gennemsnitlige korrigerede absorbans / styre gennemsnitlige korrigerede absorbans).
- Beregne de brøkdel-ramte værdier (Fa) ved hjælp af følgende ligning: 1 - (prøve gennemsnitlige korrigerede absorbans / styre gennemsnitlige korrigerede absorbans).
- Drug interaktion analytiske simuleringssoftware for enkelt og narkotika kombination undersøgelser
- Køre simuleringssoftware for at åbne vinduet start.
- Klik på knappen Nyt eksperiment at åbne hovedvinduet .
- Skriv navnet på eksperimentet i vinduet navn .
Bemærk: En dato kan tilføjes i vinduet dato . - Klik på knappen Ny enkelt Drug .
- Skriv navnet i vinduet Fulde navn .
- Skriv forkortelsen i vinduet Kongerige .
- Skriv drug koncentration enheden i vinduet enheder .
- Indtast Data punkt 1 dosis og Fa værdi, skal du trykke på Enter.
- Gentag dette trin, indtil alle datapunkter er angivet.
- Klik på knappen færdig .
- Følg de samme trin for at angive mAb datapunkter.
Bemærk: Brug den samme koncentration enhed, som bruges af narkotika. - Klik på knappen Nyt stof Combo .
- Vælg stof og mAb.
- Vælg Konstant forhold og klik på OK.
- Skriv navnet i vinduet Fulde navn .
- Skriv forkortelsen i vinduet Kongerige .
- Skriv stof/mAb forholdet i vinduet forholdet mellem .
- Indtast Data punkt 1 dosis og tryk Enter.
Bemærk: Programmet vil automatisk beregne doser af mAb og Combo. - Indtast Data punkt 1 Fa værdi og tryk Enter.
- Gentag dette trin, indtil alle datapunkter er angivet.
- Klik på knappen færdig , og klik derefter på knappen Generer betænkning .
- Vælg stof og mAb, og klik derefter på OK.
- Vælg Combo , og klik derefter på OK.
- Vælg Header, CI bordog sammenfattende oversigt. Klik derefter på OK.
- Skriv navnet på filen analyse og klik på Gem for at oprette rapporten.
Bemærk: Når du klikker på OK, betænkningen vil automatisk åbne i computerens standard web gennemser. - For at udskrive rapporten, skal du vælge udskrive fra webbrowser fil menu. Rapporten indeholder et resumé tabel sektionen titel, dato, filnavn, beskrivelse Bemærk, parametre (m, Dm og r), ED50 for hver agent brugte i monoterapi eller i kombination, og tabellen CI for hver kombination af på ED50, ED 75, ED90og ED95.
Bemærk: En CI værdien af < 1 angiver synergi, CI værdien = 1 angiver additivity, og en CI-værdi på > 1 angiver antagonisme.
2. generation af Human Neuroblastoma Xenografts i Nonobese diabetisk NOD Scid Gamma mus (NSG mus)
Bemærk: Udelukke enhver forurening af cellekultur. Da matrixen basalmembranen danner en gel over 5 ° C, bør alle cultureware eller medier kommer i kontakt med basalmembranen matrix reagens prechilled/is-kold. Holde basalmembranen matrix på isen under hele processen.
-
Forberedelse af IMR5 cellesuspension
- Tø basalmembranen matrix reagens natten over ved nedsænkning i hætteglasset i isen i 4 ° C køleskab før brug.
- På dag 0, høste de kulturperler IMR5 celler som beskrevet ovenfor.
- Overfør celler til en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten. Vaske celler 2 x med 15 mL iskold PBS, og forberede en cellesuspension af 5 x 107 celler/mL i iskold PBS.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, overføre cellesuspension til en 1,5 mL microcentrifuge tube. - Swirl basalmembranen matrix hætteglas.
Bemærk: Basalmembranen matrix reagens skal optøet og spredte. - Tilføj en diskenhed basalmembranen matrix reagens og bland det af pipettering for at opnå en cellesuspension af 2,5 x 107 celler /mL.
- Holde cellesuspension på is.
-
Forberedelse af mus
Bemærk: Mus skal være seks til syv uger gammelt.- Vedligeholde mus under et specifikt patogenfrie tilstand.
- Tillade en tre - til fem - dages akklimatisering periode efter at musene er ankommet.
- På dagen for podning, barbere flanken hvor injektionen bliver (Se trin 2.3.6).
-
Forberedelse af tumor celle indsprøjtning
Bemærk: Hold iskold basalmembranen matrix cellesuspension aseptisk under hele proceduren.- Bland cellerne og forsigtigt trække cellesuspension i en 1 mL sprøjte monteret med en 21 G kanyle.
- Kontroller at være sikker på at der er ingen luftbobler i sprøjten.
- Desinficere området podning af mus med en antiseptisk opløsning.
- Forsigtigt klemme musens huden på flanken mellem fingre, på injektionsstedet.
- Indsætte nålen nøjagtigt i hud-folden. Placer ikke nålen dybt ind i vævet til at sikre en subkutan injektion.
- Indsprøjtes 100 µL af IMR5 cellesuspension (dvs.2,5 x 106 celler) subkutant i den nederste højre flanke af mus.
- Rotere i sprøjten for at forhindre lækage og hæve nålen.
-
Overvågning af kroppens vægtændringer og tumorvækst
- Måle længden (A) og bredde (B) af tumor med en skydelære.
- Beregning af tumor volumen ved hjælp af formlen (A x B2) x 0,5.
- Starte behandling, når tumorer har nået et gennemsnitlig volumen af ~ 50-60 mm3.
3. stof og antistof Administration i mus
-
Intravenøs indgift af mAb 8B6
- Omhyggeligt udfylde en 1 mL sprøjte monteret med en 25 G kanyle med mAb løsning.
- Placer musen under en varmelampe til 10 min til at spile hale vene.
- Dy mus i en gnaver Tilbageholderen.
- Desinficere området podning af mus med en antiseptisk opløsning.
- Indsætte nålen parallelt med halen vene, gennemtrængende 2-4 mm ind i lumen samtidig holde facet af nålen ansigtet opad (figur 3A).
- Indsprøjtes 100 µL antistof løsning intravenøst (i.v.).
- Når injektionen er færdig, tryk forsigtigt injektionsstedet at forhindre blødning.
-
Intraperitoneal indgift af topotecan
- Tegne drug løsning i en 1 mL sprøjte monteret med en 25 G kanyle.
- Hold musen i en liggende stilling, med dens bageste ende lidt forhøjet.
- Desinficere området podning af mus med en antiseptisk opløsning.
- Find musens maven midterlinjen og mentalt opdele maven i kvadranter. Find injektionsstedet i højre eller venstre nedre kvadrant (figur 3B).
- Indsætte nålen ind i maven (5 mm dyb) ~ 10° vinkel, i den højre eller venstre nedre kvadrant.
- Indsprøjtes 100 µL af narkotika løsning intraperitoneal (i.p.).
- Desinficere webstedet podning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative resultater og tal er tilpasset med tilladelse fra tidligere offentliggjorte arbejde14.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 forbedrer synergistisk hæmmende effekter af Topotecan på Neuroblastoma cellevækst linje:
At etablere stoffet og antistof koncentrationerne anvendes til vurdering af synergi mellem topotecan og mAb 8B6, stof og antistof følsomheder af menneskelige IMR5 neuroblastoma celler blev målt første, ved hjælp af en MTT assay. Eksponering til enten mAb 8B6 eller topotecan alene for 72 h resulterede i en koncentration-afhængige hæmning af IMR5 cellernes levedygtighed (figur 4A). Dosis-respons-kurver tilladt ved beregningen af ED50 værdier for hvert stof. Herpå var Fa værdier beregnet ved hjælp af analyse simulation software. De beregnede ED50 værdier blev fundet for at være 10 nM ± 1 for topotecan (figur 4B) og 18 µg/mL ± 3 for mAb 8B6 (data ikke vist).
Baseret på disse ED50 værdier, næste, testet styrken af seks kombinatoriske equipotent nøgletal mAb 8B6 og topotecan blev (figur 2). Skift af kombination dosis-respons kurve mod følsomme side af grafen viser, at kombinationen regime er mere potent end hver monoterapi (figur 4A). For at opnå tilsvarende ED50 og CI værdier, blev Fa værdier beregnet. ED50 værdier af topotecan var betydeligt lavere i overværelse af mAb 8B6 (p < 0,05, figur 4B), der angiver at mAb 8B6 sensitizes tumor celle til topotecan. Vigtigere, var CI værdier betydeligt mindre end 1,0 (p < 0,05), viser en synergistisk interaktion (figur 5). Således har mAb 8B6 potentiale som en adjuvans terapeutiske agent for topotecan kemoterapi.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 forbedrer Antitumor aktivitet af Topotecan In Vivo
Fordi i vitro modeller heller ikke tages hensyn til narkotika half-life eller drug metabolisme, er det nødvendigt at bekræfte den in vitro- resultater in vivo. Desuden, i vivo modeller er meget nyttigt at vurdere kombination regime sikkerhed. For at bekræfte, at synergi mellem topotecan og mAb 8B6 var specifik for kræftceller, blev antineuroblastoma virkninger af kombinationsbehandling i en tumor xenograft model vurderet. For dette, blev den alvorlige immundefekte NSG mus stamme valgt. Disse mus mangler både en medfødt og en adaptive immunsystem15, og derfor gøre det muligt for forskere at udelukke enhver immunmodulerende effekt induceret af topotecan terapi, der kan påvirke mAb potens. Behandlingen blev startet når tumorer vises et gennemsnitlig volumen på 50 ± 2,5 mm3 (figur 6A). Behandlingerne, der bestod af enten mAb 8B6 (150 µg i.v., dag 7 og dag 11), topotecan (0,36 mg/kg i.p., dage 7-11), eller en kombination af mAb 8B6 og topotecan. Tumor diskenheder blev overvåget i løbet af eksperimenter. Alle behandlinger førte til tumor væksthæmning sammenlignet med kontrolgruppen (figur 6A). Kombination regime, induceret imidlertid de stærkeste virkning (figur 6A).
Tumorvækst kan analyseres yderligere for at undersøge overlevelsen efter behandling. Med henblik herpå, blev den hændelse, der opstår i mus eutanasi defineret som tumor volumen ≥ 1 cm3 af etiske grunde. Dette tillod os at udføre en Kaplan-Meyer overlevelses analyse og til at beregne medianen event-fri overlevelsestid for hver eksperimentelle gruppe. Som vist i fig. 6B, begge monotherapies event-fri overlevelse (EFS) blevet væsentligt forbedret sammenlignet med kontrolgruppen (median EFS af gruppen køretøj-behandlede var 21 dage; af antistof kontrolgruppe, 22 dage; af gruppen topotecan, 26 dage ; af mAb 8B6 gruppen, 29 dage [figur 6B]). Endnu, den kombinerede behandling havde den stærkeste virkning på mus overlevelse, med en median EFS forlænges til 39,5 dage (p < 0,05, mAb 8B6 vs. kombination; p < 0,01, topotecan vs kombination [figur 6B]).
Fordi synergistiske interaktioner kan resultere i øget toksicitet, skal kombination regime sikkerhed vurderes. Som sådan, er vægttab almindeligt anvendt som en følsom markør for sundhedsovervågning i gnavere16. Således, vægt tab-målt som et fald i procent af den oprindelige vægt-blev bibeholdt som en indikator for den systemiske tolerance af hver testet regime. Uden tab af kropsvægt blev observeret, tyder på, at behandlingen var godt tolereret (figur 7). Disse data tyder på, at kombinationen af topotecan plus mAb 8B6 repræsenterer en mere potent antitumor effekt i vivo end enten alene, uden påviselige toksicitet agent.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af undersøgelsens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Layout kombination eksperiment på en 96-brønd plade med nøgletal af topotecan til mAb 8B6, forberedt som seks løsninger. Løsningerne, der blev udarbejdet som beskrevet i protokollen. Brønde mærket 1-4 tjene som mAb 8B6 løsninger, wells mærket 5 til 8 tjene som topotecan løsninger, og brønde mærket 9 til 12 tjene som mAb 8B6 og topotecan (kombination) løsninger. Brønde mærket A og H tjener som kontrol; brønde mærket B tjene som 0,125 x ED50 koncentration narkotika løsninger; brønde mærket C fungere som 0,25 x ED50 koncentration narkotika løsninger; brønde mærket D tjene som 0,5 x ED50 koncentration narkotika løsninger; brønde mærket E tjene som ED50 koncentration narkotika løsninger; brønde mærket F tjene som 2 x ED50 koncentration narkotika løsninger; brønde mærket G tjene som 4 x ED50 koncentration narkotika løsninger, som angivet. Terapeutiske agenter med to forskellige enheder (dvs., µg/mL for mAb 8B6 og nM for topotecan) er analyseret i et fast forhold kombination (0.075, topotecan/8B6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Injektioner. (A) intravenøs injektion i halen vene behersket musen, bruge en insulin sprøjte af 27 G x 1/2 i 1 mL. (B) Intraperitoneal injektion til den nederste højre kvadrant af musens underliv, ved hjælp af en 1 mL sprøjte monteret med en 25 G kanyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Dosis-effekt relationer af topotecan, mAb 8B6 og deres kombination på vækst levedygtighed hæmning af IMR5 neuroblastoma celler efter 72 h eksponering. En MTT analyse blev udført som beskrevet i protokollen. (A) dosis-respons kurver vist er repræsentative for tre uafhængige replikater, hver kørsel i quadruplicates. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SD; p < 0,001. (B) ED50 af topotecan bruges som en enkelt agent eller i kombination med mAb 8B6. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Faraj et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kombination indeksværdier. Overlevelse procentværdier blev omdannet til brøk-ramte (Fa) værdier og bruges til at beregne kombination index (måling af synergi, additivity og antagonisme) ved hjælp af computersoftware, som anført i teksten. I kombinationen indeks parceller præsenteres data som betyder ± SD for tre uafhængige replikater. Resultaterne viser at mAb 8B6 havde en synergistisk effekt med topotecan (CI < 1). Dette tal er blevet ændret fra Faraj et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Kombinationsbehandling af IMR5 xenografts i NSG mus med mAb 8B6 plus topotecan. (A) mus forsynet med human neuroblastoma IMR5 xenografts blev behandlet med køretøjet (PBS, i.p.), topotecan alene (0,36 mg/kg, i.p.), styre IgG alene (150 µg, i.v.), mAb 8B6 alene (i.v.) eller topotecan og mAb 8B6 kombineret, som angivet. Administration af mAb 8B6 eller kontrol antistof behandling begyndte på dag 7 efter IMR5 celle podning og blev gentaget gang på dag 11. Topotecan eller PBS behandling var startet på dag 7 og givet for fem på hinanden følgende dage. Tumorvækst blev overvåget, og tumor diskenheder blev beregnet. Den gennemsnitlige tumor volume ± SEM af hver behandling gruppe (PBS gruppe, 9 mus; alle andre grupper, 10 mus) er afbildet (* p < 0,05 for mAb 8B6 mod mAb 8B6 og topotecan sammen, ** p < 0,01 for topotecan mod mAb 8B6 og topotecan sammen), som angivet. En betydelig reduktion i xenograft volume blev observeret for mAb 8B6/topotecan kombination, i forhold til kontrolelementerne drug-alene som angivet (p < 0,05). (B) Event-fri overlevelse Kaplan-Meyer kurver af forskellige grupper behandlet er vist. Dette tal er blevet ændret fra Faraj et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 :: Vægt for hver behandling, som antydet. Den gennemsnitlige vægt af mus på dag 0 blev defineret som 100% vægt. Vægt i hver gruppe forblev stabil for perioden af behandling. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Faraj et al. 14. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at forudsige effekten af lægemiddelinteraktioner, der kan anvendes tre metoder: isobologram metode17, ikke-lineære blanding model18og kombinationen indeks1. Kombination indeks analyse er de mest almindeligt anvendte fordi dens anvendelse er forenklet af tilgængeligheden af et brugervenligt computerprogram. Til dette formål karakteriseret vi først dosis-effekt svar af hver agent, anvendt alene eller i kombination, ved at udføre en MTT assay19. Denne metode bygger på levedygtige celler evne til at reducere tetrazolium salt i en lilla-farvet formazankoncentrationen produkt med en absorbans maksimum på 570 nm19. Ved død mister cellerne evnen til at konvertere MTT i formazankoncentrationen. Således, mængden af produktet, farvet formazankoncentrationen er proportional med antallet af levedygtige celler i kultur19. Faktisk, vi valgte denne metode som en ikke-radioaktive alternativ til tritiumholdigt thymidine indarbejdelse i DNA til at måle celle spredning19. Som sådan, MTT assays er blevet bredt vedtaget og fortsat være populære i akademiske labs som det fremgår af tusindvis af offentliggjorte artikler. Mens mængden af formazankoncentrationen måles ved at optage absorbans ved 570 nm ved hjælp af en plade-læsning Spektrofotometer, en reference bølgelængde på 620 nm er undertiden bruges, men ikke nødvendigt for de fleste assay betingelser. I betragtning af den kritiske trin beskrives her, fandt vi, at dyrkningsbetingelserne plejede at dyrke celler kan påvirke resultaterne af MTT assays. Vi fandt, at alle levedygtige celle nummer, celle metaboliske aktivitet, alder af kulturer, og antallet af passager og detaljer af vækstmediet kan være vigtige faktorer. Således, de skal tages i betragtning når gentage assayet og analysere data. Derudover celle kultur betingelser er forskellige for hver cellelinjer. Det er således kompliceret for at give nogen klare indikationer om cellen såning tæthed. Som en tommelfingerregel, et gennemsnitligt antal celler mellem 2.000-10.000 celler pr. brønd er anbefalet til at opnå en optimal celle tæthed inden for 72 h. vigtigere, MTT reduktion afspejler levedygtige cellestofskiftet og ikke specifikt cell spredning eller celle død. MTT assays bør derfor heller ikke betegnes som måle celle spredning eller celle cytotoksicitet20,11. Påvisning af celledød er afhængig af specifikke cellebaserede assays. For eksempel, i tidligere undersøgelser brugte vi western blot analyse afsløre caspase 3 aktivering og/eller flow flowcytometri analyse til påvisning af phosphatidylserin i ydre plasmamembran indlægsseddel, beviser proapoptotic aktiviteten af mAb 8B613.
Når kombination test narkotika, kan de blive leveret sammen eller successivt i tid. I betragtning af den lange række af virkningsmekanismen, er det svært at give præcise retningslinjer for den relevante eksperimentelle indstilling. Alligevel, de fleste efterforskere udnytte direkte test af narkotika kombinationer. Derudover er koncentrationer, der producerer en definerede single-agent effekt af 50% celle væksthæmning almindeligt anvendt. Drug koncentrationer afspejler plasmakoncentrationer opnås hos patienter er almindeligvis betragtes som relevant klinisk. Som sådan kombination dosis / effekt-analysen er gennemført for flere doser, at holde kombination ratio konstant med en seriel fortynding af (ED50)mAb/ (ED50)stof forhold, selv om det ikke er et absolut krav 1. Bemærk, CI værdier bør også beregnes på forskellige ED testet (fx, ED50, ED75og ED90), fordi de kan ændre med Fa i en ikke-lineær måde1. Efter udførte en automatiseret analyse af CI værdier, den lineære korrelationskoefficient r-værdien anslået af algoritmer skal være > 0,9, afspejler godhed af anfald af eksperimentelle data. CI værdier af < 1 angive synergi, CI værdier = 1 angiver additivity og CI værdier > 1 betegne antagonisme1. På grund af variation i både de eksperimentelle metoder og det biologiske system, bør den beregnede CI underkastes yderligere til statistiske overvejelser. Som sådan, er en simpel metode at gentage drug kombination forsøget flere gange efterfulgt af beregningen af de resulterende CI værdier før bestemmelse af statistikken over gennemsnit ± SD1. Det er også rådes til at teste kombinationen i den største mulige panel af cellelinjer, at tage højde for variationen, der eksisterer mellem dem.
Vigtigere, er flere parametre i in vitro- undersøgelse ikke taget hensyn til i vivo ekstrapolering. For eksempel, at in vitro- levedygtighed assays hverken tage i betragtning i vivo halveringstid på stoffet, og heller ikke i vivo drug metabolisme, kan resultere i narkotika inaktivering. Således ekstrapolering fra in vitro til in vivo forbliver et separat spørgsmål, og gavnlige drug interaktion fremgår in vitro bør yderligere bekræftet in vivo. Som sådan har en klar demonstration af synergi i mus forsynet med tumor xenografts, ved hjælp af metoden kombination indeks været udgivet21. Endnu, i vivo undersøgelser kræver et stort antal dyr at præcist definere synergi og er dyrere og mere tidskrævende. Den alternative effektive model F-test kræver stadig betydelige ressourcer22. Som en anden tilgang til at begrænse brugen af et stort antal dyr består i demonstrere drug synergi i celle kultur modeller efterfulgt af dokumentation for en øget antitumor svar af kombinationen i en begrænset xenograft undersøgelse14, brugte vi human neuroblastoma IMR5 celler som tumor mål for i vivo undersøgelse. Vi beholdt IMR5 celler, fordi de er tumorfremkaldende i immunkompromitterede mus23. Mens menneskelige tumor xenograft modeller giver værdifulde modeller til test narkotika kombinationer i vivo24, kan det være vanskeligt at etablere sådanne modeller fra en bred vifte af celle linjer25. For at øge hyppigheden af tumordannelse hos mus, kan celler injiceres ind i musene med en membran kælderen matrix som et køretøj25. Vigtigere, da membran kælderen matrix polymeriserer og størkner ved temperaturer over 5 ° C, alle cultureware eller medier kommer i kontakt med membran kælderen matrix skal være prechilled/is-kold, og membranen kælderen løsninger bør holdes is under hele processen25. Med brugen af matrixen membran kælder, vi observeret en 100% take sats med IMR5 celler, mens i mangel af membran kælderen matrix, denne cellelinie demonstreret en < 80% tage sats (data ikke vist). Derudover for at øge forekomsten af tumor graft, kan membran kælderen matrix også øge tumor vækst sats25. Vi observerede, at alle xenografts havde optrådt ved dag 11. Men i de første syv dage efter tumor celle udfordring, tilstedeværelsen af klumper kunne observeres, som kan være forårsaget af tilstedeværelsen af den oprindelige inokulum (data ikke vist). Dermed, vi ikke overveje målinger af tumorstørrelse meningsfuld før denne tid. Ved hjælp af membran kælderen matrix, gjort det muligt at reducere antallet af mus i den eksperimentelle indstilling og udføre i vivo eksperiment inden for tre måneder.
Stof-antistof doser kan variere afhængigt af den celle linje og mus stamme. På grund af begrænsningen af in vitro- levedygtighed assay for ekstrapolering i vivo stof-antistof doseringen beskrevet ovenfor, blev klinisk relevante doser bevaret for både topotecan og mAb 8B6 i i vivo eksperimentelle indstilling, baseret på de data, der er offentliggjort af andre26,27. For at ekstrapolere den menneskelige dosering indstilling til mus, blev tidligere offentliggjort retningslinjer28 fulgt. Per se, vi sprøjtet 150 µg af antistof 8B6 i.v. på dag 7, efterfulgt af en anden injektion fem dage senere (total dosis/mus = 300 µg). Topotecan behandling begyndte samme dag som den første mAb 8B6 injektion ved at indsprøjte 0,36 mg/kg topotecan eller PBS kontrol i.p. for fem på hinanden følgende dage. I betragtning af den kritiske trin beskrives her, anbefaler vi at starte antistof infusioner, når tumor xenografts nå ~ 50 mm3. Højere tumor xenograft mængder vil resultere i en lavere svarprocent fordi tumor byrder tydeligt korrelere omvendt med antistof koncentration, antistof eksponering og antistof effektivitet29. Vi har også bevaret vægttab som en indikator for systemisk tolerabiliteten af hver testet regime16. Men fortolkning af indsamlede vægte kan ikke være behjælpelig med en stor tumor masse. I dette tilfælde tilrådes krop betingelse scoring, som beskrevet andetsteds16.
Tumorer kan være indsamlet på forskellige tidspunkter for immunochemistry analyse, at give yderligere oplysninger om mekanismen af handling udløses in vivo. I et tidligere arbejde, blev tumor apoptotiske indeks vurderet efter mAb 8B6 infusion13. Med henblik herpå, blev apoptotiske tumorceller fundet ved hjælp af en TUNEL assay13. Desuden var andelen af tumor cellekerner scorede med Ki67 antigen-positive farvning for at analysere tumor spredning indeks13.
Svær immundefekte mus mangler både medfødte og adaptive immunitet med tabet af T-celler, B-celler og natural killer (NK) celler med reduceret makrofag og antigen-præsenterer cellefunktioner og fravær af cirkulerende supplement30. Denne protokol tillader således ikke forskere at drage konklusioner vedrørende formodede virkninger af kemoterapi i forstærkende mAb terapi ved at ændre tumor mikromiljø i vivo31. Men både formodede immunmodulerende effekter af kemoterapeutiske agent og rolle i regionen fragment-crystallizable (Fc) for mAb i styrke narkotika antitumor potens fortjener overvejelse, men disse spørgsmål kræver adgang til en syngeneic model med en intakt immunsystemet og en fysiologisk tumor mikromiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Fa., J.F. og S.B. er udpeget som opfindere af ventende patenter dækker den kliniske anvendelse af anti-O-acetyl-GD2 terapeutiske antistoffer.
Acknowledgments
Yde støtte: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan og comité de Vendée, une steg hæld S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin og la Société Française de Lutte contre les Kræftformer et les leucémies de L'Enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. og J.F. understøttes af La Ligue Contre Le Cancer. Forfatterne takke UTE-facilitet i struktur Fédérative de Recherche François Bonamy. Forfatterne også takke Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) for at give IMR5 cellerne og Ms. H. Estéphan for hendes teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation kit (MTT) | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn software | ComboSyn | Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com | |
| Electric shaver | Bioseb | BIO-1556 | |
| Fetal calf serum | Eurobio | CVFSVFF00-01 | 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ | |
| Heat lamp | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| Human neuroblastoma IMR-5 cell line | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | 2 mM in RPMI 1640 |
| Lysis solution | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | University of Nantes | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| Needle 21G 1 ½ | BD Microlance | 304432 | |
| Needle 25G 1 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG mice | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96-well microplates | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| PBS, 0,05% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| PC that runs windows 7 | Microsoft | Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640 |
| Reagent reservoir | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| Rodent restrainer | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| Syringe 1 mL | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| Topotecan | Sigma-Aldrich | T2705 |
References
- Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
- Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
- Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
- Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
- Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
- Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
- Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
- Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
- Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
- Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
- Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
- Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
- White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
- Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
- Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
- Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
- Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
- Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
- Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).
