Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Potentiering av Anticancer antikropp effekt av antineoplastiska läkemedel: Påvisande av antikropp-drogen Synergism med kombination Index formel

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver hur man skall bedöma synergier mellan en anticancer antikropp och antineoplastiska läkemedel i prekliniska modeller med hjälp av kombination index ekvation av Chou och Talalay.

Abstract

Potentiering av fientliga monoklonala antikroppar (mAb) av kemoterapeutiska medel utgör en värdefull strategi för att utforma effektivare och säkrare behandling mot cancer. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att identifiera en rationell kombination vid prekliniska steg. Först beskriver vi en cell-baserad analys för att bedöma den synergism mellan anticancer mAb och cytostatika, som använder kombination index ekvationen av Chou och Talalay1. Detta inkluderar mätning av tumör cell drog - och antikropp-känslighet med en MTT-analys, följt av en automatiserad dator analys att beräkna kombination index (CI) värdena. CI värden av < 1 indikerar synergier mellan testade mAbs och cytotoxiska medel1. För att bekräfta den in vitro- fynd i vivo, beskriver vi ytterligare en metod för att bedöma kombination regim effekten i en xenograft tumör modell. I denna modell fördröjer den kombinera behandlingen avsevärt tumörtillväxt, vilket resulterar i en signifikant förlängd överlevnad jämfört med monoterapi kontroller. Allt avslöjar i vivo experimenterandet att kombinationsbehandlingen tolereras väl. Detta protokoll tillåter effektiv utvärdering av anticancer läkemedelskombinationer i prekliniska modeller och identifiering av rationella kombination att utvärdera i kliniska prövningar.

Introduction

Den konventionella metoden för behandling av ett stort antal olika typer av cancer var baserad på monoterapi. Även om det används fortfarande i många fall, träffade denna metod flera hinder som leder till valet av kombinerade behandlingar2. Särskilt, är cancerceller mer mottagliga att utveckla motstånd när de behandlades med en enda drog genom att inducera alternativa överlevnad mekanismer3, vilket resulterar i terapeutiska misslyckande i patienter4. Dessutom i monoterapi administreras läkemedel vanligtvis vid höga doser. Denna situation ofta resulterar i förekomsten av starka dosberoende biverkningar som kan vara outhärdlig och tvinga läkarna att stoppa den behandling2. Av dessa skäl föreningen anticancer molekyler är nu föredrog att monoterapi.

Perfekt läkemedelskombinationer skulle vara de som agerar i samverkan mot tumörceller, utan ökad toxicitet mot normala celler. Synergism avser samverkan mellan två eller flera läkemedel som ger en terapeutisk effekt som är större än summan av varje enskilt läkemedel som agerar separat. Sådana interaktioner kan resultera i förbättrad klinisk terapeutiska effekt2. Den begränsar behandlingsresistens, ökar effekten och kan också minska toxicitet2. I själva verket kan doseringen av varje läkemedel sänkas för att sänka deras biverkningar genom att rikta olika vägar. Dessutom kan en av molekylerna också fungera som en sensibiliserande agent mot cancerceller. Effekten av andra läkemedel kan förstärkas på sensibiliserade celler och färre doser kan vara används5.

Kombinerad terapi kan innehålla två eller fler cytostatika och/eller biologiska läkemedel, såsom monoklonala antikroppar6. Dessa mAbs specifikt inrikta celler som uttrycker en cell ytantigen av intresse och kan döda tumörceller via immunologiska vägar, inklusive antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC), med deltagande av immun effektor celler 7och komplementberoende cytotoxicitet (CDC)6. De kan också agera via en icke-immunologiska mekanism medierad av apoptos8,9,10,11. I detta fall kan induktionen av processen för programmerad celldöd medvetandegöra cancerceller försvaga deras funktion och effektivisera det associerade kemoterapeutiska läkemedlet vid en lägre dos. Som sådan, proapoptotiska mAb är bra kandidater för att utforma kombinationsregimer med antineoplastiska läkemedel.

Olika matematiska modeller har beskrivits för att bedöma drog synergier; en av dem är baserad på kombinationen index metod1. Denna metod är baserad på principen om median-effekt utvecklats av Chou1. Median-effekt ekvationen korrelerar till läkemedelsdos och drogen effekt enligt följande.

Equation 1

Här, är D läkemedelsdos; DM är den median-effekt dosnivåer; FA är det bråk som påverkas av dosen; m är en exponent som betecknar formen av dos-effekt tomt1. Den median-effekt dosnivåer används för att beräkna dosen Dx av ett läkemedel som hämmar eller dödar ”x” procent av cellerna. CI värdet beräknas sedan för att bedöma de additiv effekten av kombinationen drog, enligt följande1.

Equation 2

CI värdet 1 anger en additiv effekt och CI värdet < 1 indikerar en synergistisk effekt, medan ett CI värde av > 1 indikerar antagonism1. Tillämpningen av denna metod underlättas ytterligare av tillgången till ett datorprogram, CompuSyn, som bestämmer synergier och antagonism vid alla doser eller effekt nivåer simulerade automatiskt12.

Vår grupp har utvecklat den mAb 8B6 specifikt för O-acetyl-GD2 ganglioside (OAcGD2) neuroblastom antigen13 och ytterligare visat att denna mAb skall kunna inducera celldöd med attribut av apoptos11. För att testa om mAb 8B6 kan medvetandegöra neuroblastomceller till den antineoplastiska agent topotekan, anpassade vi den ovannämnda metoden som utvecklats av Chou1. Först, vi fastställa effektiva dosen 50 (ED50) värdena för mAb 8B6 och topotecan. Därefter utsätts neuroblastomceller med ekvipotenta nyckeltal av de två substanserna baserat på ED50 värden för att bestämma CI värdena med de ovannämnda simuleringsprogram. Denna metod tillåter oss att Visa synergier mellan mAb 8B6 och topotecan in vitro. Därefter beskriver vi ett protokoll för att ytterligare bedöma styrkan och säkerheten i denna kombination regim i vivo. Detta protokoll kan appliceras enkelt markera potent och säker mot cancer mAb och kemoterapeutiska agent kombinationer i prekliniska studier. En schematisk representation av denna studie ges i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurstallar och experimentell förfarande godkändes av den franska regeringen (avtal nr C44-278 och #APAFIS 03479.01). Djurvård och förfaranden genomfördes under direktiv EU 2010/63/EU och franska lag #2013-118 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.

1. utvärdering av läkemedlet interaktion mellan mAb 8B6 och Topotecan In Vitro

  1. 96-väl provberedning
    FÖRSIKTIGHET: Samråda med kommittén för institutionens arbetsmiljö och följa lokala förordning regler relaterade till laboratoriesäkerhet. Granska informationen om Material och säkerhetsdatabladet innan du arbetar med media, cellinjer eller reagenser. Använd rätt steril teknik och arbeta i en LAF. Alla lösningar/utrustning som används för att manipulera celler måste vara sterila.
    Obs: Följande protokoll har utformats för användning med vidhäftande celler. Ändringar krävs för att använda metoden nonadherent celler växer i fjädring. Detta protokoll används fyra exemplar för varje experimentella villkor.
    1. Odla IMR5 cellerna i en T75 kolv.
    2. På den första dagen (dag 0), Observera cellkulturen i Mikroskop för att kontrollera den cell konfluens. Aspirera cell mediet från kolven, tvätta med 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och tillsätt 3 mL 0,05% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) / PBS lösning. Tillbaka kolven till inkubatorn för 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Undersöka cellkulturen under ett mikroskop för cell avlossning.
      Obs: Vid behov, tillbaka kolven till inkubatorn för en ytterligare 3-5 min, beroende på celltyp tumör.
    4. Tillsätt 10 mL av komplett cell medium till kolven och överföra cellsuspensionen till en steril 15 mL koniska rör. Centrifugera cellerna för 5 min vid 300 x g. Räkna de celler som använder en hemocytometer.
    5. Avlägsna och Kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i komplett odlingsmedium. Medelstora volymen för att erhålla en slutlig koncentration på 1 x 105 celler/mL.
    6. Utsäde 84 brunnar i en 96-väl kultur plattan med 104 celler vardera, vilket är 100 µL cellsuspension. Följ den experimental layout som visas i figur 2.
    7. Inkubera cellerna för 18 h i cell inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  2. Drogen lösning förberedelse
    Observera: För läkemedel/mAb sensibilisering studier, ändra tidpunkten, längd och koncentration behandling som passar de särskilda läkemedel/mAb i fråga. Observera att den ursprungliga koncentrationen är 3 x slutliga koncentration.
    1. Nästa morgon (dag 1), förbereda följande läkemedel lösningar med komplett odlingsmedium.
      1. mAb lösning förberedelse
        1. Späd mAb i 500 µL komplett odlingsmedium att erhålla en antikropp fungerande lösning med en mAb koncentration av 240 µg/mL.
        2. Utför fem tvåfaldiga seriella utspädningar som anges i figur 2.
      2. Topotekan lösning förberedelse
        1. Späd, som ovan, drogen i 500 µL av komplett odlingsmedium att erhålla en drog fungerande lösning med en slutlig koncentration på 120 nM.
        2. Utför fem tvåfaldiga seriella utspädningar som anges i figur 2.
      3. Antikropp och drog lösning förberedelse
        1. Späd ut drogen och mAb lösningarna i 500 µL komplett odlingsmedium att erhålla en lösning på 120 nM drog- och 240 µg/mL mAb (fungerande lösning).
        2. Utför fem tvåfaldiga seriella utspädningar som anges i figur 2.
    2. För att ankomma på slutliga koncentration, överföra 50 µL av varje drog lösning i motsvarande brunnar, som anges i experimental layout ( figur 2).
      Obs: Över 50 µL av komplett odlingsmedium i obehandlad cell brunnar, som anges i figur 2.
    3. Inkubera cellerna för 72 h i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2).
  3. MTT assay
    1. Tillsätt 10 µL av MTT reagenslösningen i varje brunn.
    2. Inkubera vid 37 ° C i 4 h.
    3. Tillsätt 100 µL av Lys lösning (10% SDS i 0,01 M HCl) i varje brunn, med hjälp av en flerkanalspipett och blanda omsorgsfullt genom pipettering.
    4. Inkubera vid 37 ° C i 4 h i en fuktig kammare (95% luftfuktighet).
    5. Läs absorbansen vid 570 nm (en570) och 620 nm (en620) med en spektrofotometer.
      Obs: Blanda varje prov igen genom pipettering innan du läser absorbansen; absorbansen vid 620 nm tillåter korrigering av ospecifik bakgrundsnivåer.
    6. Beräkna den korrigerade absorbansen: korrigerat absorbansen = en570- en620.
    7. Beräkna cellviabiliteten som följer: cellviabilitet = 100 x (prova menar korrigerade absorbansen / kontroll menar korrigerade absorbans).
    8. Beräkna bråkdel-påverkas värdena (Fa) med hjälp av följande ekvation: 1 - (prova menar korrigerade absorbansen / kontroll menar korrigerade absorbans).
  4. Läkemedel interaktion analytiska simuleringsprogram för singel och drog kombinationsstudier
    1. Kör simuleringen programvaran för att öppna startfönstret.
    2. Klicka på knappen Nytt Experiment att öppna huvudfönstret .
    3. Skriv namnet på experimentet i fönstret namn .
      Obs: Ett datum kan läggas i fönstret datum .
    4. Klicka på knappen Ny enda drog .
    5. Skriv namnet i fönstret Fullständiga namn .
    6. Skriv förkortningen i fönstret Abbrev .
    7. Skriver du drog koncentration enheten i fönstret enheter .
    8. Ange Data punkt 1 dos och Fa värde, tryck på RETUR.
    9. Upprepa detta steg tills alla datapunkter anges.
    10. Klicka på knappen färdig .
    11. Följ samma steg för att ange mAb datapunkter.
      Obs: Använd samma koncentration enhet som används av drogen.
    12. Klicka på knappen Nytt läkemedel Combo .
    13. Välj läkemedel och mAb.
    14. Välj Baserat på konstant och klicka på OK.
    15. Skriv namnet i fönstret Fullständiga namn .
    16. Skriv förkortningen i fönstret Abbrev .
    17. Skriv drog/mAb förhållandet i fönstret förhållandet .
    18. Ange Data punkt 1 dos och tryck på RETUR.
      Obs: Programmet kommer att automatiskt beräkna doserna av mAb och Combo.
    19. Ange värdet Data punkt 1 Fa och tryck på RETUR.
    20. Upprepa detta steg tills alla datapunkter anges.
    21. Klicka på knappen färdig och klicka sedan på knappen Skapa rapport .
    22. Välj läkemedel och mAb och klicka på OK.
    23. Välj Combo och klicka på OK.
    24. Välj rubrik, CI tabelloch sammanfattande tabell. Klicka på OK.
    25. Skriv filnamnet på filen analys och klicka på Spara för att generera rapporten.
      Obs: Efter att ha klickat OK, rapporten automatiskt öppnas i datorns standardwebbläsare.
    26. Om du vill skriva ut rapporten, välja Skriv ut från webbläsarens Arkiv-menyn. Rapporten innehåller en sammanfattning i tabellen som innehåller titel, datum, filnamn, beskrivning Obs, parametrar (m, Dm och r), ED50 för antingen agent används i monoterapi eller i kombination, och tabellen CI för varje kombination på ED50, ED 75, ED90och ED95.
      Obs: CI värdet < 1 indikerar synergism, CI värdet = 1 indikerar additivitet, och CI värdet > 1 indikerar antagonism.

2. generering av mänskliga neuroblastom xenograft i Nonobese diabetiker nicka Scid Gamma möss (NSG möss)

Obs: Utesluta all kontaminering av cellkulturen. Eftersom matrisen basalmembranet bildar en gel över 5 ° C, bör alla cultureware eller media kommer i kontakt med basalmembranet matrix reagens prechilled och ice-kallt. Hålla basalmembranet matrisen på is under hela processen.

  1. Beredning av cellsuspensionen IMR5
    1. Tina basalmembranet matrix reagens över natten genom att dränka injektionsflaskan i is i kylskåp 4 ° C före användning.
    2. Dag 0, skörda de odlade IMR5 cellerna som beskrivs ovan.
    3. Överföra cellerna till en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter.
    4. Kassera supernatanten. Tvätta cellerna 2 x med 15 mL iskallt PBS, och förbereda en cellsuspension på 5 x 107 celler/mL i iskall PBS.
      Obs: Vid behov överföra cellsuspensionen till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
    5. Snurra injektionsflaskan basalmembranet matris.
      Obs: Basalmembranet matrix reagens bör Tinas och spridda.
    6. Lägga till en volym av basalmembranet matrix reagens och blanda det genom pipettering för att erhålla en cellsuspension av 2,5 x 107 celler/ml.
    7. Hålla cellsuspension på is.
  2. Beredning av möss
    Obs: Möss bör vara sex till sju veckor gamla.
    1. Upprätthålla möss under ett specifikt patogenfria tillstånd.
    2. Tillåta en tre till fem - dagars acklimatisering period efter mössen har anlänt.
    3. På dagen för inympning, raka flanken var injektionen ska göras (se steg 2.3.6).
  3. Beredning av tumör cell injektionen
    Obs: Håll iskall basalmembranet matrix cellsuspensionen aseptisk under hela förfarandet.
    1. Blanda cellerna och noggrant rita cellsuspensionen i en 1 mL spruta med en 21 G nål monterat.
    2. Kontrollera att det inte finns några luftbubblor i sprutan.
    3. Desinficera området inympning av musen med en antiseptisk lösning.
    4. Kläm försiktigt musens huden på flanken mellan fingrarna, på injektionsstället.
    5. Stick in nålen exakt i hudvecket. Placera inte nålen djupt in i vävnaden att säkerställa en subkutan injektion.
    6. Injicera 100 µL av IMR5 cellsuspension (dvs.2,5 x 106 celler) subkutant i den nedersta högra flanken av möss.
    7. Rotera sprutan för att förhindra läckage och dra ut injektionsnålen.
  4. Övervakning av kroppsvikten och tumörtillväxt
    1. Mät längden (A) och bredden (B) av tumören med ett skjutmått.
    2. Beräkna tumör volymen med hjälp av formel (A x B2) x 0,5.
    3. Starta behandlingen när tumörer har nått en genomsnittlig volym av ~ 50-60 mm3.

3. läkemedel och antikropp Administration hos möss

  1. Intravenös administrering av mAb 8B6
    1. Noggrant fylla en 1 mL spruta monteras med en 25 G nål med mAb lösning.
    2. Placera musen under en värmelampa för 10 min att vidga svans venen.
    3. Hindra musen i en gnagare fasthållning.
    4. Desinficera området inympning av musen med en antiseptisk lösning.
    5. För in nålen parallellt till svans ven, genomträngande 2-4 mm i lumen samtidigt fasningen av nålen ansiktet uppåt (figur 3A).
    6. Injicera 100 μl av antikropp lösning intravenöst (i.v.).
    7. När injektionen är klar, tryck försiktigt injektionsstället att förhindra blödning.
  2. Intraperitoneal administrering av topotecan
    1. Rita den drog lösningen i en 1 mL spruta monterad med 25 G nål.
    2. Håll musen i ryggläge, med dess bakre änden något förhöjd.
    3. Desinficera området inympning av musen med en antiseptisk lösning.
    4. Leta upp musens buken mittlinjen och mentalt dela buken i kvadranter. Leta upp injektionsstället i den vänstra eller högra nedre kvadranten (figur 3B).
    5. Stick in nålen i buken (5 mm djup) ~ 10° vinkel, i den vänstra eller högra nedre kvadranten.
    6. Injicera 100 µL av drogen lösning intraperitonealt (i.p.).
    7. Desinficera inokuleringsstället.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den representativa resultat och siffror är anpassad med tillstånd från tidigare publicerade arbete14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 förbättrar synergistiskt de hämmande effekterna av Topotecan på neuroblastom celltillväxt linje:

Att etablera drogen och antikropp koncentrationerna användas för bedömning av synergier mellan topotekan och mAb 8B6, drogen och antikropp känsligheten av mänskliga IMR5 neuroblastomceller mättes först med en MTT-analys. Exponering för antingen mAb 8B6 eller topotekan ensam för 72 h resulterade i en koncentrationsberoende hämning av IMR5 cellernas viabilitet (figur 4A). Dos-responskurvor tillåtna beräkningen av ED50 värden för varje förening. I detta syfte beräknades Fa värden med hjälp av analys simulering programvara. Värdena som beräknats ED50 befanns vara 10 nM ± 1 för topotecan (figur 4B) och 18 µg/mL ± 3 för mAb 8B6 (inga data anges).

Baserat på dessa ED50 värden, sedan testade styrkan av sex Idå ekvipotenta nyckeltal mAb 8B6 och topotecan var (figur 2). Förskjutningen av kombinationen dos-respons kurva mot den känsliga sidan av diagrammet indikerar att kombinationsbehandlingen är mer potent än varje monoterapi (figur 4A). För att få motsvarande ED50 och CI värden, beräknades Fa värden. ED50 värdena för topotecan var betydligt lägre i närvaro av mAb 8B6 (p < 0,05, figur 4B), vilket indikerar att mAb 8B6 väcker intresse tumör cellen till topotekan. Ännu viktigare, var de CI-värdena betydligt mindre än 1,0 (p < 0,05), visar en synergistisk interaktion (figur 5). Således har mAb 8B6 potential adjuvant terapeutisk agent för topotecan kemoterapi.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 förbättrar antitumöreffekt verksamhet av Topotecan In Vivo

Eftersom in vitro- modeller inte heller beaktar drog halveringstiden heller i läkemedelsmetabolism, är det nödvändigt att bekräfta in vitro- fynd i vivo. Dessutom är i vivo modeller mycket användbart för att bedöma kombination regim säkerhet. För att bekräfta att synergism mellan topotekan och mAb 8B6 var specifika för cancerceller, bedömdes antineuroblastoma effekter av kombinationsbehandlingen i en tumör xenograft modell. För detta valdes den grava nedsatt immunförsvar NSG mus stammen. Dessa möss saknar både en medfödd och en adaptiva immunsystemet15, och därför göra det möjligt för forskare att utesluta någon immunmodulerande effekter induceras av topotecan terapi som kan påverka mAb potens. Behandling inleddes när tumörer visas en genomsnittlig volym av 50 ± 2,5 mm3 (figur 6A). Behandlingarna bestod av antingen mAb 8B6 (150 µg i.v., dag 7 och dag 11), topotekan (0,36 mg/kg i.p., dagar 7-11), eller en kombination av mAb 8B6 och topotekan. Tumör volymerna övervakades under experimenterandet. Alla behandlingar ledde till tumör tillväxthämning jämfört med kontrollgrupper (figur 6A). Kombinationsbehandlingen ska framkallas emellertid den starkaste effekten (figur 6A).

Tumörtillväxt kan analyseras ytterligare för att studera överlevnaden vid behandling. I detta syfte definierades händelsen vilket resulterar i mus dödshjälp som tumör volym ≥ 1 cm3 av etiska skäl. Detta tillät oss att utföra en Kaplan-Meyer överlevnadsanalys och beräkna händelsen-fri Medianöverlevnaden för varje experimentella gruppen. Som visas i figur 6B, båda monoterapierna förbättrades händelse-fri överlevnad (EFS) avsevärt jämfört med kontrollgrupper (median EFS-behandlade gruppen var 21 dagar av antikropp kontrollgruppen, 22 dagar; av topotekan-gruppen 26 dagar ; i mAb 8B6 gruppen, 29 dagar [figur 6B]). Ändå, den kombinerade behandlingen hade den starkaste effekten på möss överlevnad, med en median EFS förlängas till 39,5 dagar (p < 0,05, mAb 8B6 vs. kombination; p < 0,01, topotekan vs. kombination [figur 6B]).

Eftersom synergistiska interaktioner kan resultera i ökad toxicitet, behöver kombination regim säkerhet bedömas. Som sådan, används viktminskning ofta som en känslig markör för hälsoövervakning i gnagare16. Således, vikt förlust-mätt som en nedgång i procent från de ursprungliga vikten-behölls som en indikator på systemisk toleransen för varje testad regim. Ingen förlust av kroppsvikt observerades, vilket tyder på att behandlingen var väl tolereras (figur 7). Dessa data tyder på att kombinationen av topotekan plus mAb 8B6 representerar en mer potent antitumöreffekt effekt i vivo än antingen agent ensam, utan påvisbar toxicitet.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk representation av studien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Layout av kombinationen experiment på en plattan med 96 brunnar med nyckeltal för topotekan-till-mAb 8B6, beredda som sex lösningar. Lösningarna var beredda som beskrivs i protokollet. Brunnar som heter 1 till 4 fungera som mAb 8B6 lösningar, brunnar märkt 5 till 8 tjäna som topotecan lösningar och brunnar märkt 9 till 12 tjäna som mAb 8B6 och topotecan (kombination) lösningar. Wells märkt A och H serve som kontroller. Wells märkt B fungera som 0,125 x ED50 koncentration läkemedel lösningar; Wells märkt C tjäna som 0,25 x ED50 koncentration läkemedel lösningar; Wells märkt D utgöra 0,5 x ED50 koncentration läkemedel lösningar; Wells märkt E serven som ED50 koncentration läkemedel lösningar; Wells märkt F fungera som 2 x ED50 koncentration läkemedel lösningar; Wells märkt G fungera som 4 x ED50 koncentration läkemedel lösningar, som anges. Terapeutiska medel med två olika enheter (i.e., µg/mL för mAb 8B6 och nM för topotecan) analyseras i ett fast förhållande kombination (0,075, topotecan/8B6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Injektioner. (A) intravenös injektion i svansen ven en återhållen musen, använder en insulinspruta på 27 G x 1/2 i, 1 mL. (B) Intraperitoneal injektion till den nedre högra kvadranten av musens buken, med en 1 mL spruta monterad med 25 G nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Dos-effekt förhållandet mellan topotekan, mAb 8B6 och deras kombination på livskraft tillväxthämning av IMR5 neuroblastomceller efter 72 h exponering. En MTT-analys utfördes som beskrivs i protokollet. (A) dos-respons kurvor visas är representativa för tre oberoende replikat, varje köras i quadruplicates. Data presenteras som den medelvärde ± SD; p < 0,001. (B), ED50 av topotekan som monoterapi eller i kombination med mAb 8B6. Data presenteras som den medelvärde ± SEM. Denna siffra har ändrats från Faraj o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 : Kombination indexvärden. Procentvärden överlevnad var förvandlas till bråkdel-drabbade (Fa) värden och används för att beräkna indexet kombination (mått på synergy, additivitet och antagonism) använder datorprogram, som anges i texten. I kombination index tomterna presenteras data som genomsnitt ± SD för tre oberoende replikat. Resultaten visar att mAb 8B6 hade en synergistisk effekt med topotekan (CI < 1). Denna siffra har ändrats från Faraj o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Kombinationsbehandling med IMR5 xenograft i NSG möss med mAb 8B6 plus topotekan. (A) möss med mänskliga neuroblastom IMR5 xenograft behandlades med fordon (PBS, i.p.), topotekan ensam (0,36 mg/kg, i.p.), styra IgG ensam (150 µg, i.v.), mAb 8B6 ensam (i.v.) eller topotekan och mAb 8B6 kombineras, som anges. Administrering av mAb 8B6 eller kontroll antikropp behandling startade på dag 7 efter IMR5 cell inympning och upprepades gång på dag 11. Den topotekan eller PBS behandling påbörjas på dag 7 och ges under fem dagar. Tumörtillväxt övervakades och tumör volymer beräknades. Den genomsnittliga tumör volym ± SEM i varje behandlingsgrupp (PBS grupp, 9 möss; alla andra grupper, 10 möss) skildras (* p < 0,05 för mAb 8B6 mot mAb 8B6 och topotecan tillsammans, ** p < 0,01 för topotecan mot mAb 8B6 och topotecan grupp), som anges. En betydande minskning xenograft volym observerades för mAb 8B6/topotekan kombinationen, jämfört med de drog-alone kontrollerna, som anges (p < 0,05). (B) Event-free survival Kaplan-Meyer kurvor för olika grupper behandlas visas. Denna siffra har ändrats från Faraj o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Betyder vikt för varje behandlingsgrupp, såsom anges. Medelvikten hos mössen på dag 0 definierades som 100% vikt. Vikten i varje grupp var stabil under behandling. Data presenteras som den medelvärde ± SEM. Denna siffra har ändrats från Faraj o.a. 14. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att förutsäga effekten av läkemedelsinteraktioner, tre metoder kan användas: den isobologram metod17, ickelinjära blandning modell18och kombinationen index1. Kombination index analys används ofta eftersom dess tillämpning är förenklad av tillgången till ett användarvänligt datorprogram. För detta ändamål kännetecknas vi första dos-effekt svar varje agent används ensamt eller i kombination, genom att utföra en MTT assay19. Denna metod bygger på förmågan av viabla celler att minska tetrazolium saltet i en lila-färgade formazan produkt med en absorbans högst 570 nm19. Vid döden förlorar cellerna förmågan att omvandla MTT till formazan. Således, kvantiteten av den färgade formazan produkten är proportionell mot antalet livskraftiga celler i kultur19. Faktiskt, vi valde denna metod som ett nonradioactive alternativ till tritiummärkt tymidin införlivande i DNA för att mäta cell spridning19. Som sådan, MTT analyser har allmänt antagits och fortfarande är populära i akademiska labs vilket framgår av tusentals publicerade artiklar. Medan mängden formazan mäts genom inspelning absorbansen vid 570 nm med en tallrik-läsning spektrofotometer, referens våglängden 620 nm är ibland användas men inte nödvändigt för de flesta assay förhållanden. Med tanke på den kritiska steg som beskrivs här, hittade vi att de odlingsbetingelser som används för att odla cellerna kan påverka resultaten av MTT-analyser. Vi fann att antalet livskraftiga cell, cell metaboliska aktiviteten, en ålder av kulturer och antalet passager och detaljer av odlingsmedium kan alla viktiga faktorer. Således, de måste beaktas när Upprepa analysen och analysera data. Dessutom cell kultur förutsättningarna skiljer sig för varje cell linjer. Det är alltså komplicerat för att ge några tydliga indikationer om cellen sådd densitet. Som en tumregel, ett genomsnittligt antal celler mellan 2 000-10 000 celler per brunn rekommenderas att uppnå en optimal cell densiteten inom 72 h. allt, MTT-reduktion återspeglar livskraftig cellernas ämnesomsättning och inte specifikt cell spridning eller celldöd. MTT analyser bör därför varken beskrivas som att mäta cell spridning eller cell cytotoxicitet20,11. Påvisande av celldöd är beroende av specifika cellbaserade analyser. Till exempel i tidigare studier har använt vi western blot analys att upptäcka kaspas 3 aktivering eller flow flödescytometri analys för att upptäcka fosfatidylserin i yttre plasmamembranet bipacksedeln, till bevis den proapoptotiska aktiviteten mAb 8B613.

När kombination testa droger, kan de levereras tillsammans eller successivt i tid. Med tanke på mängden verkningsmekanismen, är det svårt att ge precisa riktlinjer för relevanta experimentella inställningen. Men utnyttja de flesta utredarna direkt testning av läkemedelskombinationer. Dessutom används ofta koncentrationer som producerar en definierad monoterapi effekt av 50% cell tillväxthämning. Läkemedelskoncentrationen återspeglar plasmakoncentrationer uppnås hos patienter anses vanligen relevanta kliniskt. Som sådan, kombinationen dos-effekt-analys utförs flera doser, att hålla förhållandet kombination konstant med en seriell utspädning av den (ED50)mAb/ (ED50)drog förhållande, även om det inte är ett absolut krav 1. Notera, CI värdena bör också beräknas vid olika ED testas (t.ex., ED50, ED75och ED90) eftersom de kan ändra med Fa i ett ickelinjärt sätt1. Efter att ha utfört den automatiserad analysen av CI värden, den linjära korrelationskoefficient r-värdet uppskattas av algoritmer ska vara > 0,9, att återspegla godhet passform av experimentella data. CI värden av < 1 indikerar synergi, CI värden = 1 indikerar additivitet, och CI värden av > 1 betecknar antagonism1. På grund av variationerna i både de experimentella metoderna och det biologiska systemet, bör beräknade CI ytterligare genomgå statistiska övervägande. Som sådan, är en enkel metod att upprepa drog kombination experimentet flera gånger följt av beräkningen av CI resultatvärdena före fastställande av statistiken för medelvärde ± SD1. Det är också klokt att testa kombinationen i den största möjliga panelen i cellinjer, att ta hänsyn till den variation som finns mellan dem.

Allt beaktas flera parametrar i in vitro- studie inte för en in-vivo -extrapolering. Exempelvis in vitro- livskraft analyserna varken beaktas i vivo halveringstiden av drogen, och inte heller den i vivo läkemedelsmetabolism som kan resultera i drogen inaktivering. Således en extrapolering från in vitro att in vivo förblir en separat fråga, och välgörande läkemedel interaktion framgår i vitro bör ytterligare bekräftade i vivo. Som sådan, varit en tydlig demonstration av synergy i möss med tumör xenograft, med metoden kombination index publicerad21. Men in-vivo studier kräver ett stort antal djur att exakt definiera synergy och är dyrare och mer tidskrävande. Den alternativa effektiva modellen F-testet fortfarande kräver betydande resurser22. Som en annan strategi att begränsa användningen av ett stort antal djur består i visar drog synergin i cell kultur modeller följt av bevis för en ökad antitumöreffekt respons av kombinationen i en begränsad xenograft studie14, använde vi de mänskliga IMR5 neuroblastomceller som tumör mål för in-vivo studier. Vi behöll IMR5 celler eftersom de är tumörframkallande immunsupprimerade möss23. Medan mänskliga tumör xenograft-modeller ger värdefulla modeller för att testa läkemedel kombinationer i vivo24, kan det vara svårt att fastställa sådana modeller från en mängd cell linjer25. För att öka förekomsten av tumörbildning hos möss, kan celler injiceras i möss med en matris med membran i källaren som ett fordon25. Ännu viktigare, eftersom membranet källaren matrix polymerizes och stelnar vid temperaturer över 5 ° C, alla cultureware eller media kommer i kontakt med matrisen membran källare bör vara prechilled och ice-kallt, och membran källaren lösningarna bör hållas is under hela processen25. Med hjälp av matrisen membran källaren, vi observerade en 100% ta kurs med IMR5 celler, medan, i avsaknad av membran källaren matris, denna cellinje visat en < 80% ta priset (inga data anges). Dessutom, för att öka förekomsten av tumör transplantat, kan membran källaren matris också öka tumör tillväxt takt25. Vi observerade att alla xenograft hade synts av dag 11. Dock under de första sju dagarna efter tumör cell utmaningen, kunde förekomsten av klumpar observeras, vilket kan orsakas av närvaron av den inledande inokulatet (inga data anges). Således, vi ansåg inte att mätningar av tumörstorlek meningsfull före denna tid. Med hjälp av matrisen membran källaren gjorde det möjligt att minska antalet möss i inställningen experimentella och utföra det i vivo -experimentet inom tre månader.

Drog/antikropp doser kan variera beroende på cell linje och mus stam. På grund av begränsningen av in vitro- lönsamhet analysen för extrapolera i vivo drog/antikropp doseringen ovan, behölls kliniskt relevanta doser för både topotekan och mAb 8B6 i vivo experimentella i inställningen baserat på de uppgifter som publiceras av andra26,27. För att extrapolera inställningen mänskliga dosering till möss, följdes tidigare publicerade riktlinjer28 . Per se, vi injiceras 150 µg av antikropp 8B6 i.v. dag 7, följt av en andra injektion fem dagar senare (total dos/mus = 300 µg). Topotekan behandling började samma dag som den första mAb 8B6 injektionen genom att injicera 0,36 mg/kg topotekan eller PBS kontroll i.p. under fem dagar. Med tanke på den kritiska steg som beskrivs här, rekommenderar vi att du börjar antikropp infusioner när de tumör xenograft når ~ 50 mm3. Högre tumör xenograft volymer kommer att resultera i en lägre svarsfrekvens eftersom tumören bördor korrelerar klart omvänt med antikroppskoncentrationen, antikropp exponering och antikropp effekt29. Vi har även kvar viktminskning som en indikator på systemisk tolerabilitet för varje testad regim16. Tolkningen av insamlade vikter kan dock inte bra med en stor tumör massa. I det här fallet rekommenderas body condition scoring, som beskrivs på andra ställen16.

Tumörer kan samlas vid olika tidpunkter för immunkemi analys, att ge ytterligare information om mekanism av åtgärd utlösas i vivo. I ett tidigare arbete bedömdes tumör apoptotiska indexet efter mAb 8B6 infusion13. För detta ändamål upptäcktes tumör apoptotiska celler använder en TUNEL assay13. Dessutom var procentandelen av tumör cellkärna gjorde Ki67 antigen-positiv färgning för att analysera den tumör spridning index13.

Gravt nedsatt immunförsvar möss saknar både medfödd och adaptiv immunitet med förlusten av T-celler, B-celler och naturliga killer (NK) celler med reducerad makrofag och antigen-presenterande cellfunktioner och frånvaro av cirkulerande komplement30. Sålunda, detta protokoll inte tillåter forskare att dra några slutsatser om förmodade effekterna av kemoterapi i potentierande mAb terapi genom att förändra den tumör närmiljön i vivo31. Men både förmodad immunmodulerande effekter av kemoterapeutiska agent och rollen i regionen fragment-crystallizable (Fc) i mAb öka drogen antitumöreffekt styrkan komma i fråga, men dessa frågor kräver tillgång till en syngena modell med ett intakt immunsystem och en fysiologisk tumör mikromiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.Fa., J.F. och S.B. designeras som uppfinnarear av väntande patent omfattar kliniska tillämpningen av anti-O-acetyl-GD2 terapeutiska antikroppar.

Acknowledgments

Bevilja stöd: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan och comité de Vendée, une ros Häll S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin och la Société Française de Lutte contre les Cancerformer et les leucémies de L'Enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. och J.F. stöds av La Ligue Contre Le Cancer. Författarna vill tacka UTE-anläggningen av den struktur Fédérative de Recherche François Bonamy. Författarna också tacka Dr S. Suzin (Inserm, Paris) för att tillhandahålla de IMR5 cellerna och Ms. H. Estéphan för hennes tekniskt bistånd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
  2. Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
  3. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
  4. Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
  5. Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
  6. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
  7. Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
  8. Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
  9. Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
  10. Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
  11. Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
  12. Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
  13. Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
  14. Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
  15. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  16. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  17. Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
  18. White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
  19. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  20. Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
  21. Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
  22. Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
  23. Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
  24. Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
  26. Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
  27. Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
  28. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  29. Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
  30. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  31. Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).

Tags

Cancerforskning fråga 143 cancerforskning läkemedelsutveckling antikropp-drogen kombination antikropp-läkemedelsinteraktion MTT assay antikropp-drogen synergy kombination index ekvation in vitro cell line modell tumör xenograft modell
Potentiering av Anticancer antikropp effekt av antineoplastiska läkemedel: Påvisande av antikropp-drogen Synergism med kombination Index formel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter