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Cancer Research

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Synergien zwischen einem Anti-Krebs-Antikörper und Zytostatika in präklinischen Modellen zu bewerten, indem Sie unter Verwendung der Kombination Index Gleichung von Chou und Talalay.

Abstract

Potenzierung der feindlichen monoklonaler Antikörper (mAb) durch Chemotherapeutika stellt eine sinnvolle Strategie für die Gestaltung effektiver und sicherer Therapie gegen Krebs. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine vernünftige Kombination in der präklinischen Phase zu identifizieren. Zunächst beschreiben wir eine zellbasierte Assays um den Synergismus zwischen Anti-Krebs-mAb und Zytostatika, zu beurteilen, der die Kombination Index Gleichsetzung von Chou und Talalay1verwendet. Dazu gehören die Messung des Tumor Zelle Droge - und Antikörper-Empfindlichkeit mit einem MTT-Assay, gefolgt von einer automatisierten Computeranalyse die Kombination Index (CI) Werte berechnen. CI-Werte der < 1 Synergismus zwischen getesteten mAbs und Zytostatika1anzugeben. Um die in-vitro- Ergebnisse in Vivobestätigen, beschreiben wir weiter eine Methode zur Bestimmung der Kombination Therapie Wirksamkeit in einem Xenograft-Tumor-Modell. In diesem Modell verzögert die kombinierte Therapie deutlich Tumorwachstum, führt zu einer erweiterten signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zu Single-Agent-Steuerelemente. Wichtig ist, zeigt der in-Vivo -Experimente, dass die Kombinationstherapie gut vertragen wird. Dieses Protokoll ermöglicht die effektive Bewertung der Anti-Krebs-Medikamenten-Kombinationen in präklinischen Modellen und die Identifizierung von rationalen Kombination, in klinischen Studien zu bewerten.

Introduction

Der konventionelle Ansatz bei der Behandlung einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Krebs beruhte auf Monotherapie. Auch wenn es noch in vielen Fällen verwendet wird, erfüllt diese Methode mehrere Hindernisse zu entscheiden sich für kombinierte Therapien2. Insbesondere sind Krebszellen anfälliger für Widerstand, wenn ein einzelnes Medikament behandelt, durch Induktion alternative überleben Mechanismen3, was zu therapeutischen Scheitern in Patienten4zu entwickeln. Darüber hinaus werden in Monotherapie, Medikamente in der Regel in einer hohen Dosis verwaltet. Diese Situation oft führt das Auftreten von starken dosisabhängige Nebenwirkungen, die Ärzte die Behandlung2stoppen erzwingen und unerträglich werden können. Aus diesen Gründen ist der Verband der Anti-Krebs-Moleküle nun lieber Monotherapie.

Ideale Wirkstoffkombinationen wäre diejenigen, die in Synergie gegen Tumorzellen, ohne erhöhte Toxizität gegen normale Zellen handeln. Synergismus bezieht sich auf die Interaktion von zwei oder mehr Medikamenten, die eine therapeutische Wirkung mehr als die Summe jedes einzelne Medikament handeln separat produziert. Solche Interaktionen können erweiterte klinische therapeutische Wirksamkeit2führen. Es begrenzt Therapieresistenz, erhöht die Wirksamkeit und Toxizität2auch verringern kann. In der Tat kann die Dosierung der einzelnen Drogen reduziert werden, um ihre Nebenwirkungen zu senken, indem Sie auf verschiedenen Wegen. Darüber hinaus kann eines der Moleküle auch als eine sensibilisierende Mittel gegen Krebszellen dienen. Die Wirkung des zweiten Medikaments kann auf sensibilisierte Zellen verstärkt werden und weniger Dosierungen können gebrauchte5.

Kombinierte Therapie kann zwei oder mehrere Chemotherapeutika und/oder Biologics wie monoklonale Antikörper6enthalten. Diese mAbs gezielt Zellen mit dem Ausdruck einer Zelle Oberflächenantigen von Interesse und sind in der Lage, Tumorzellen durch immunologische Wege einschließlich Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC), töten unter Einbeziehung der immun Effektorzellen 7und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC)6. Sie können auch über einen nicht-immunologischen Mechanismus vermittelt durch Apoptose8,9,10,11agieren. In diesem Fall kann die Induktion des Prozesses des programmierten Zelltods Krebszellen zu sensibilisieren, Schwächen ihre Funktion und der damit verbundenen Chemotherapeutikum mit einer niedrigeren Dosierung effektiver zu gestalten. Als solche Proapoptotic mAb sind gute Kandidaten für die Gestaltung von Kombination Therapien mit Zytostatika.

Verschiedene mathematische Modelle sind beschrieben worden, um Droge Synergismus zu beurteilen; eine davon basiert auf der Kombination Index Methode1. Diese Methode basiert auf dem Median-Wirkung-Prinzip von Chou1entwickelt. Die Median-Effekt-Gleichung korreliert die Medikamentendosis und Drogenwirkung wie folgt.

Equation 1

Dabei ist D die Medikamentendosis; DM ist die Median-Effekt-Dosis; FA ist der Bruchteil der Dosis davon betroffen; m ist ein Exponent, die die Form der Dosis-Wirkungs-Plot-1bedeutet. Die Median-Effekt-Dosis wird verwendet, um die Dosis Dx eines Medikaments zu berechnen, die hemmt oder tötet "X" Prozent der Zellen. Der CI-Wert errechnet dann um die additive Wirkung der Droge Kombination,1folgendermaßen zu bewerten.

Equation 2

CI der Wert 1 gibt an, eine additive Wirkung und einem CI-Wert von < 1 zeigt einen synergistischen Effekt, während ein CI-Wert von > 1 zeigt Antagonismus1. Die Anwendung dieser Methode wird weiter durch die Verfügbarkeit eines Computerprogramms, CompuSyn, die bestimmt Synergismus und Antagonismus bei allen Dosen erleichtert oder Effektstufen simulierte automatisch12.

Unsere Gruppe entwickelt die mAb 8B6 speziell für O-Acetyl-GD2 Gangliosid (OAcGD2) Neuroblastom Antigen13 und weiter gezeigt, dass diese mAb Zelltod mit Attributen der Apoptose11induzieren kann. Um zu testen ob mAb 8B6 Neuroblastom-Zellen, die antineoplastische Agenten Topotecan sensibilisieren können, haben wir die oben genannten Methode, entwickelt von Chou1angepasst. Zunächst bestimmen wir die wirksame Dosis 50 (ED50) Werte der mAb 8B6 und Topotecan. Als nächstes sind die Neuroblastom-Zellen mit zwar Verhältnisse der beiden Wirkstoffe basierend auf ED50 Werte ausgesetzt, um die CI-Werte mit den oben genannten Simulations-Software zu ermitteln. Diese Methode ermöglicht uns, Synergien zwischen mAb 8B6 und Topotecan in Vitrozu demonstrieren. Wir beschreiben Sie anschließend ein Protokoll, um weiter die Wirksamkeit und die Sicherheit dieser Kombination Therapie in Vivozu beurteilen. Dieses Protokoll kann leicht angewendet werden, um starke und sichere Anti-Krebs-mAb und Chemotherapeutikum Kombinationen in präklinischen Studien auszuwählen. Eine schematische Darstellung dieser Studie ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

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Protocol

Tierhaltung und experimentelle Verfahren wurden von der französischen Regierung (Vereinbarungen #C44-278 und #APAFIS 03479.01) genehmigt. Tierbetreuung und Verfahren wurden unter Richtlinie EU 2010/63/EU und Französisch Gesetz #2013-118 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt.

1. Bewertung der Droge Interaktion zwischen mAb 8B6 und Topotecan In Vitro

  1. 96-Well-Probenvorbereitung
    Achtung: Wenden Sie sich an die Institution Arbeitsschutzausschuss und lokale Vorschriften Regeln im Zusammenhang mit Sicherheit im Labor. Überprüfen Sie die Material- und Sicherheitsdatenblatt Informationen vor der Arbeit mit Medien, Zell-Linien oder Reagenzien. Verwenden Sie korrekten sterilen Technik und arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube. Alle Lösungen/Geräte, die verwendet werden, um Zellen zu manipulieren müssen steril sein.
    Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die Verwendung mit adhärenten Zellen entwickelt. Änderungen sind erforderlich, um die Methode auf nonadherent Zellen in Suspension wachsen anzuwenden; Dieses Protokoll verwendet für jede Versuchsbedingung vervierfacht.
    1. Wachsen Sie IMR5 Zellen in einem T75 Kolben.
    2. Am ersten Tag (Tag 0) beobachten Sie die Zellkultur unter dem Mikroskop, die Zelle Konfluenz zu überprüfen. Aspirieren der Zelle Medium aus der Flasche, waschen Sie es mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 3 mL 0,05 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) / PBS-Lösung. Den Kolben in den Inkubator für 3 min (37 ° C, 5 % CO2) zurück.
    3. Prüfen der Zellkultur unter dem Mikroskop für Zelle ablösen.
      Hinweis: Bei Bedarf zurück der Küvette in den Inkubator für eine zusätzliche 3 bis 5 min, je nach Zelltyp Tumor.
    4. Die Flasche 10 mL Medium vollständige Zelle hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 300 X g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
    5. Entfernen und entsorgen des Überstands. Die Zelle Pellet in komplette Wachstumsmedium aufzuwirbeln. Die mittlere Lautstärke um eine Endkonzentration von 1 x 105 Zellen/mL zu erhalten.
    6. Samen 84 Brunnen einer 96-Well-Kultur-Platte mit 104 Zellen jeweils 100 µL Zellsuspension ist. Folgen Sie der experimentellen Layout in Abbildung 2dargestellt.
    7. Inkubieren Sie die Zellen für 18 h in der Zelle-Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).
  2. Vorbereitung der Droge-Lösung
    Hinweis: Für Drogen/mAb Sensibilisierung Studien, ändern Sie das Timing, die Länge und die Konzentration Behandlung entsprechend der bestimmten Medikament/mAb in Frage. Beachten Sie, dass die Ausgangskonzentration 3 x die Endkonzentration.
    1. Bereiten Sie am nächsten Morgen (Tag 1), die folgenden Medikament Lösungen mit vollständigen Wachstumsmedium.
      1. Vorbereitung der mAb-Lösung
        1. Verdünnen Sie mAb in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Antikörper funktionierende Lösung mit einer Konzentration von mAb von 240 µg/mL zu erhalten.
        2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
      2. Vorbereitung der Topotecan-Lösung
        1. Verdünnte, als über das Medikament in 500 µL des vollständigen Wachstumsmedium zu einem Medikament funktionierende Lösung mit einer Endkonzentration von 120 nM.
        2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
      3. Antikörper und Drogen Vorbereitung der Lösung
        1. Verdünnen Sie die Droge und mAb Lösungen in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Lösung auf 120 nM Drogen- und 240 µg/mL mAb (Arbeitslösung) zu erhalten.
        2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
    2. Um die Endkonzentration ankommen, übertragen Sie 50 µL jeder Medikamentenlösung in die entsprechenden Vertiefungen, wie angegeben im experimentellen Layout ( Abbildung 2).
      Hinweis: Übertragen Sie 50 µL kompletten Wachstumsmedium in den unbehandelten Zellen Vertiefungen, wie in Abbildung 2gezeigt.
    3. Inkubieren Sie die Zellen für 72 h im Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).
  3. MTT-assay
    1. Fügen Sie 10 µL MTT Reagenzlösung in jede Vertiefung.
    2. Inkubation bei 37 ° C für 4 h.
    3. 100 µL der Lyse-Lösung (10 % SDS in 0,01 M HCl) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette, und gründlich mischen durch pipettieren.
    4. Inkubation bei 37 ° C für 4 h in eine feuchte Kammer (95 % Feuchtigkeit).
    5. Lesen Sie die Extinktion bei 570 nm (eine570) und 620 nm (ein620) mit einem Spektralphotometer.
      Hinweis: Mischen Sie jede Probe wieder durch Pipettieren vor dem Lesen der Extinktion; Extinktion bei 620 nm ermöglicht die Korrektur von unspezifischen Hintergrund Werten.
    6. Berechnen Sie die korrigierte Extinktion: korrigierte Extinktion = eine570- ein620.
    7. Die Zellviabilität wie folgt zu berechnen: Zelle überleben = 100 X (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).
    8. Der Bruchteil betroffen Werte (Fa) unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: 1 - (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).
  4. Droge Interaktion analytische Simulationssoftware für Single und Kombination Medikamentenstudien
    1. Starten Sie die Simulationssoftware um das Startfenster zu öffnen.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Experiment , das Main -Fenster zu öffnen.
    3. Geben Sie den Namen des Experiments im Fenster " Namen ".
      Hinweis: Im Fenster " Datum " kann ein Datum hinzugefügt werden.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue einziges Medikament ".
    5. Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".
    6. Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .
    7. Geben Sie das Medikament Konzentration Gerät im Fenster " Einheiten ".
    8. Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis und Fa Wert, drücken Sie die Eingabetaste.
    9. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.
    10. Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ".
    11. Die gleichen Schritte zum mAb-Daten-Punkte eingeben.
      Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Konzentration Einheit wie durch Medikament verwendet wird.
    12. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue Droge-Combo ".
    13. Wählen Sie Droge und mAb.
    14. Wählen Sie Konstantes Verhältnis , und klicken Sie auf "OK".
    15. Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".
    16. Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .
    17. Geben Sie das Medikament/mAb-Verhältnis im Verhältnis der Fenster.
    18. Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis ein und drücken Sie die Eingabetaste.
      Hinweis: Das Programm berechnet automatisch die Dosen von mAb und Combo.
    19. Geben Sie die Daten Punkt 1 Fa -Wert, und drücken Sie die Eingabetaste.
    20. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.
    21. Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " Bericht erstellen ".
    22. Wählen Sie Medikament und mAb aus, und klicken Sie auf "OK".
    23. Wählen Sie Combo , und klicken Sie dann auf OK.
    24. Header, CI-Tabelleund zusammenfassende Tabelleauswählen. Klicken Sie auf "OK".
    25. Geben Sie den Dateinamen des Analyse-Datei und klicken Sie auf Speichern , um den Bericht zu generieren.
      Hinweis: Nach einem Klick auf "OK", wird der Bericht im Standard-Webbrowser des Computers automatisch geöffnet.
    26. Um den Bericht zu drucken, wählen Sie Drucken aus dem Web-Browser-Menü "Datei". Der Bericht enthält eine Zusammenfassung Tabellenabschnitt, die Titel, Datum, Dateiname, Beschreibung Hinweis, Parameter ("m", "Dm" und "R"), ED50 für entweder Agent verwendet in Monotherapie oder in Kombination und der CI-Tabelle für jede Kombination bei ED50, ED enthält 75, ED90und ED95.
      Hinweis: Ein CI-Wert von < 1 zeigt Synergismus, CI Wert = 1 bedeutet Additivität und einem CI-Wert von > 1 bedeutet Antagonismus.

2. Generation des menschlichen Neuroblastoma Xenotransplantate in Nonobese diabetische NOD Scid Gamma Mäuse (NSG Mäuse)

Anmerkung: Ohne jegliche Verunreinigung der Zellkultur. Da die Basalmembran Matrix eine Gel über 5 ° C bildet, sollten alle Cultureware oder Medien kommen in Kontakt mit der Basalmembran Matrix Reagenz prechilled/Eis-kalt sein. Halten Sie die Basalmembran Matrix auf dem Eis während des gesamten Prozesses.

  1. Vorbereitung der Zellsuspension IMR5
    1. Tauen Sie die Basalmembran Matrix Reagenz über Nacht durch Eintauchen der Durchstechflasche im Eis im Kühlschrank 4 ° C vor dem Gebrauch auf.
    2. Am Tag 0 ernten Sie die kultivierten IMR5 Zellen wie oben.
    3. Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.
    4. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen 2 X mit 15 mL eiskaltem PBS und bereiten eine Zellsuspension von 5 x 107 Zellen/mL in eiskaltem PBS.
      Hinweis: Bei Bedarf übertragen Sie die Zellsuspension zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    5. Schwenken Sie die Basalmembran Matrix Durchstechflasche.
      Hinweis: Die Basalmembran Matrix Reagenz sollte aufgetaut und zerstreut werden.
    6. 1 Volumenteil Basalmembran Matrix Reagenz und mischen Sie es durch Pipettieren um eine Zellsuspension von 2,5 x 107 Zellen /mL zu erhalten.
    7. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
  2. Vorbereitung der Mäuse
    Hinweis: Die Mäuse sollte sechs bis sieben Wochen alt sein.
    1. Pflegen Sie Mäuse unter einer bestimmten Bedingung Pathogen-freies.
    2. Lassen Sie ein drei bis fünf Tagen Eingewöhnungszeit, nachdem die Mäuse angekommen sind.
    3. Am Tag der Impfung, rasieren die Flanke, wo werden die Injektion (siehe Punkt 2.3.6).
  3. Vorbereitung der Tumor Zelle Injektion
    Hinweis: Halten Sie die eiskalte Basalmembran Matrix Zellsuspension aseptischen während des Verfahrens.
    1. Mischen Sie die Zellen und ziehen Sie vorsichtig die Zellsuspension in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 21 G montiert.
    2. Vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen in der Spritze befinden.
    3. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
    4. Drücken Sie vorsichtig die Maus Haut an der Flanke zwischen den Fingern, an der Injektionsstelle.
    5. Stechen Sie die Nadel genau in die Hautfalte. Stellen Sie die Nadel nicht tief in das Gewebe um eine subkutane Injektion zu gewährleisten.
    6. Injizieren Sie 100 µL Zellsuspension IMR5 (d.h., 2,5 x 106 -Zellen) in der unteren rechten Flanke der Mäuse subkutan.
    7. Drehen Sie die Spritze um auslaufen zu verhindern und ziehen Sie die Nadel heraus.
  4. Überwachung von Gewichtsveränderungen und Tumorwachstum
    1. Messen Sie die Länge (A) und die Breite (B) des Tumors mit einer Zange.
    2. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit Hilfe der Formel (A x B2) x 0,5.
    3. Therapie zu beginnen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von ~ 50-60 mm3erreicht haben.

3. Drogen und Antikörper-Verwaltung bei Mäusen

  1. Die intravenöse Gabe von mAb 8B6
    1. Füllen Sie vorsichtig eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel mit mAb Lösung montiert.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer Wärmelampe für 10 min, die Rute Vene zu dehnen.
    3. Die Maus in einem Nagetier Restrainer zurückhalten.
    4. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
    5. Stechen Sie die Nadel parallel zur Rute Vene, durchdringenden 2-4 mm in das Lumen unter Beibehaltung der Schräge der Nadel Gesicht nach oben (Abb. 3A).
    6. 100 µL Antikörper-Lösung intravenös zu injizieren (i.v.).
    7. Nach Beendigung die Injektion sanft Druck der Injektionsstelle Blutungen zu verhindern.
  2. Intraperitoneale Gabe von topotecan
    1. Zeichnen Sie die Wirkstofflösung in eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel montiert.
    2. Halten Sie die Maus in Rückenlage, mit seinem hinteren Ende leicht erhöht.
    3. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
    4. Suchen Sie die Maus Bauch Mittellinie und geistig teilen Sie sich den Bauch in Quadranten. Suchen Sie die Injektionsstelle im rechten oder linken unteren Quadranten (Abb. 3 b).
    5. Stechen Sie die Nadel in die Bauchhöhle (5 mm tief) in ~ 10°-Winkel, im rechten oder linken unteren Quadranten.
    6. 100 µL Medikamentenlösung intraperitoneale Injektion (i.p.).
    7. Desinfizieren Sie die Impfung-Website.

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Representative Results

Die repräsentative Ergebnisse und Zahlen werden mit freundlicher Genehmigung von früher veröffentlichten Arbeit14angepasst.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 fördert synergistisch hemmende Effekte von Topotecan auf Neuroblastom Zellwachstum Linie:

Herstellen der Droge und die Antikörper-Konzentrationen verwendet werden, für die Beurteilung der Synergismus zwischen Topotecan und mAb 8B6, das Medikament und die Antikörper Befindlichkeiten der menschlichen IMR5 Neuroblastom-Zellen wurden zuerst, gemessen mit einem MTT-Assay. Exposition gegenüber mAb 8B6 oder Topotecan allein 72 h führte zu einer Konzentration abhängig Hemmung der IMR5 Zellviabilität (Abb. 4A). Dosis-Wirkungs-Kurven erlaubt die Berechnung der ED50 Werte für jede Verbindung. Zu diesem Zweck wurden Fa-Werte berechnet mit der Analyse-Simulations-Software. Die berechneten ED50 Werte erwiesen sich 10 nM ± 1 für Topotecan (Abbildung 4 b) und 18 µg/mL ± 3 für mAb 8B6 (Daten nicht gezeigt).

Basierend auf diesen ED50 Werte, als nächstes die Potenz der sechs kombinatorische zwar, die Verhältnisse von mAb 8B6 und Topotecan wurden getestet (Abbildung 2). Die Verschiebung der Kombination Dosis-Wirkungs-Kurve in Richtung der sensiblen Seite des Graphen zeigt, dass die Kombinationstherapie stärker als jede Monotherapie (Abb. 4A ist). Um die entsprechenden ED50 und CI-Werte zu erhalten, wurden Fa-Werte berechnet. Der ED50 Werte von Topotecan lagen deutlich im Beisein von mAb 8B6 (p < 0,05, Abbildung 4 b), darauf hinweist, dass mAb 8B6 sensibilisiert die Tumorzelle zu Topotecan. Wichtig ist, waren die CI-Werte deutlich kleiner als 1,0 (p < 0,05), zeigen eine synergistische Interaktion (Abbildung 5). So hat mAb 8B6 das Potenzial als eine adjuvante Therapeutikum für Topotecan Chemotherapie.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 verbessert die Antitumor-Aktivität von Topotecan In Vivo

Da in-vitro- Modelle weder das Medikament Half-Life noch den Arzneimittelstoffwechsel berücksichtigen, ist es notwendig, die in-vitro- Ergebnisse in Vivozu untermauern. Darüber hinaus sind in Vivo Modellen sehr nützlich, um die Kombination Therapie Sicherheit bewerten. Um sicherzustellen, dass der Synergismus zwischen Topotecan und mAb 8B6 für Krebszellen spezifisch war, wurden die antineuroblastoma Wirkung der Kombinationstherapie in einem Tumor-Xenograft-Modell bewertet. Hierzu wurde die schwere immungeschwächte NSG Maus Belastung ausgewählt. Diese Mäuse fehlt eine angeborene und eine adaptive Immunsystem15und damit Forscher schließen jede immunmodulatorische Effekte induziert durch Topotecan-Therapie, die mAb Potenz beeinflussen können. Behandlung wurde begonnen, sobald die Tumoren eine mittlere Lautstärke von 50 ± 2,5 mm3 (Abb. 6A) angezeigt. Die Behandlung bestand aus beiden mAb 8B6 (150 µg i.v., Tag 7 und Tag 11), Topotecan (0,36 mg/kg i.p, 7-11 Tage), oder eine Kombination von mAb 8B6 und Topotecan. Die Tumor-Bände wurden im Verlauf des Experiments überwacht. Alle Therapien führten zu Tumor retardiertes Wachstum im Vergleich zu Kontrollgruppen (Abb. 6A). Die Kombinationstherapie induziert jedoch den stärksten Effekt (Abb. 6A).

Wachstum des Tumors kann weiter analysiert werden, um die Überlebensrate bei der Behandlung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde das Ereignis was Maus Euthanasie aus ethischen Gründen als Tumor Band ≥ 1 cm3 definiert. Dies erlaubt uns, eine Kaplan-Meyer Überlebensanalyse durchführen und die mediane Überlebenszeit für jede Versuchsgruppe zu berechnen. Wie in Abbildung 6gezeigt, beide Monotherapien Event-freies Überleben (EFS) deutlich verbessert im Vergleich zu Kontrollgruppen (Median EFS der Fahrzeug-behandelten Gruppe betrug 21 Tage der Antikörper Kontrollgruppe, 22 Tage; der Topotecan-Gruppe, 26 Tage ; der mAb 8B6 Gruppe, 29 Tage [Abbildung 6 b]). Die kombinierte Therapie galt jedoch den stärksten Einfluss auf das Überleben der Mäuse, mit einer medianen EFS verlängert bis 39,5 Tage (p < 0,05, mAb 8B6 vs. Kombination; p < 0,01, Topotecan vs. Kombination [Abbildung 6 b]).

Da erhöhte Toxizität synergistische Wechselwirkungen führen können, muss die Kombination Therapie Sicherheit beurteilt werden. Als solche wird Gewichtsverlust häufig als ein sensitiver Marker für die Gesundheitsüberwachung in Nagetieren16verwendet. So, Gewicht Verlust-gemessen als ein Rückgang in Prozent von der ursprünglichen Gewichts-wurde als Indikator für die systemische Verträglichkeit jedes getestete Therapie beibehalten. Kein Verlust von Körpergewicht wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Behandlung gut toleriert (Abbildung 7). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Kombination von Topotecan plus mAb 8B6 ein potenter Antitumor-Wirkung in Vivo als entweder alleine, ohne erkennbare Toxizität Agent darstellt.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Studie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Layout der Kombination Experiment auf einer 96-Well-Platte mit Verhältnissen von Topotecan-mAb 8B6, als sechs Lösungen vorbereitet. Die Lösungen wurden vorbereitet, wie im Protokoll beschrieben. Brunnen mit der Bezeichnung 1 bis 4 dienen als mAb 8B6 Lösungen, Brunnen mit der Bezeichnung 5 bis 8 dienen als Topotecan Lösungen und Brunnen mit der Bezeichnung 9 bis 12 dienen als mAb 8B6 und Topotecan (Kombination) Lösungen. Wells, A und H dienen als Steuerelemente bezeichnet; Brunnen mit der Bezeichnung B dienen als 0,125 x ED50 Konzentration Droge Lösungen; Brunnen mit der Bezeichnung C dienen als 0,25 x ED50 Konzentration Droge Lösungen; Brunnen mit der Bezeichnung D dienen als 0,5 x ED50 Konzentration Droge Lösungen; Brunnen mit der Bezeichnung E dienen als ED50 Konzentration Droge Lösungen; Brunnen mit der Bezeichnung F dienen als 2 x ED50 Konzentration Droge Lösungen; Brunnen mit der Bezeichnung G dienen als 4 x ED50 Konzentration Droge Lösungen, wie angegeben. Therapeutika mit zwei unterschiedlichen Maßeinheiten (d.h.µg/mL für mAb 8B6 und nM für Topotecan) werden in einem festen Verhältnis Kombination (0,075, Topotecan/8B6) analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Injektionen. (A) intravenöse Injektion in die Vene der Schweif einer zurückhaltenden Maus, mit einer Insulin-Spritze von 27 X 1/2 Zoll, 1 mL. (B) intraperitoneale Injektion an den unteren rechten Quadranten von der Maus Bauch, mit einer 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel montiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Dosis-Wirkungs-Beziehung von Topotecan, mAb 8B6 und deren Kombination auf Lebensfähigkeit Wachstumshemmung von IMR5 Neuroblastom-Zellen nach 72 h Exposition. Ein MTT-Assay wurde durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. (A) die Dosis-Wirkungs-Kurven dargestellt sind Vertreter der drei unabhängige Wiederholungen, jeweils in Quadruplicates ausgeführt. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt; p < 0,001. (B) ED50 Topotecan als Monotherapie oder in Kombination mit mAb 8B6 verwendet. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM vorgestellt Diese Zahl wurde von Faraj Et Al. modifiziert 14. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 5
Abbildung 5 : Kombination Indexwerte. Prozentwerte überleben waren Bruchteil betroffen (Fa) Werte umgewandelt und zur Berechnung des Indexes Kombination (Maß für Synergie, Additivität und Antagonismus) mittels Computersoftware, wie im Text angegeben. In der Kombination-Index-Parzellen sind Daten dargestellt, da ± SD für drei unabhängige Wiederholungen bedeuten. Ergebnisse zeigen, dass mAb 8B6 hatte einen synergistischen Effekt mit Topotecan (CI < 1). Diese Zahl wurde von Faraj Et Al. modifiziert 14. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Kombinationsbehandlung von IMR5 Xenotransplantate im NSG Mäuse mit mAb 8B6 plus Topotecan. (A) Mäuse mit menschlichen Neuroblastoma IMR5 Xenotransplantate wurden mit Fahrzeug (PBS, i.p.) behandelt, Topotecan allein (0,36 mg/kg, i.p.), Steuern, IgG allein (150 µg, i.v.), mAb 8B6 allein (i.v.) oder Topotecan und mAb 8B6 kombiniert, wie angegeben. Die Verwaltung der mAb 8B6 oder Kontrolle Antikörper-Behandlung begann am 7. Tag nach der Inokulation IMR5 Zelle und wurde einmal am Tag 11 wiederholt. Die Topotecan oder PBS Behandlung startete am 7. Tag und für fünf aufeinander folgenden Tagen gegeben. Das Tumorwachstum wurde überwacht und Tumor Volumina berechnet wurden. Die mittlere Tumor Volumen ± SEM von jeder Behandlungsgruppe (PBS-Gruppe, 9 Mäuse; alle anderen Gruppen 10 Mäuse) dargestellt (* p < 0,05 für mAb 8B6 gegen mAb 8B6 und Topotecan zusammen, ** p < 0,01 für Topotecan gegen mAb 8B6 und Topotecan zusammen), als angegeben. Eine deutliche Reduzierung Xenograft Volumen wurde für die mAb 8B6/Topotecan Kombination, im Vergleich zu dem Medikament allein Kontrollen wie angegeben (p < 0,05) beobachtet. (B) Event-freies Überleben Kaplan-Meyer-Kurven verschiedener Gruppen behandelt werden angezeigt. Diese Zahl wurde von Faraj Et Al. modifiziert 14. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Gewicht für jede Behandlungsgruppe bedeuten, wie angegeben. Das mittlere Gewicht der Mäuse am Tag 0 wurde als 100 % Gewicht definiert. Das Gewicht in jeder Gruppe für die Dauer der Behandlung stabil geblieben. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM vorgestellt Diese Zahl wurde von Faraj Et Al. modifiziert 14. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Um die Auswirkungen von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten vorherzusagen, drei Methoden können verwendet werden: die Isobologram Methodik17, nichtlineare Mischung Modell18und die Kombination index1. Indexanalyse Kombination wird am häufigsten verwendet, da seine Anwendung durch die Verfügbarkeit eines benutzerfreundlichen Computerprogramms vereinfacht wird. Zu diesem Zweck gekennzeichnet wir zuerst die Dosis-Wirkungs-Antwort von jeder Agent verwendet, allein oder in Kombination, durch ausführen ein MTT-Assay-19. Diese Methode beruht auf der Fähigkeit der lebensfähigen Zellen um das Tetrazoliumsalz Salz in ein lila gefärbten Formazan-Produkt mit einer Extinktion maximal 570 nm19zu reduzieren. Bei Tod verlieren die Zellen die Fähigkeit, MTT in Formazan umzuwandeln. So ist die Menge des Produkts farbigen Formazan proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen in Kultur19. In der Tat, wählten wir diese Methode als nicht radioaktiven Alternative zu gegebenenfalls Thymidin Gesellschaftsgründung in DNA zur Messung der Zelle Verbreitung19. Als solche MTT-Assays wurden weit angenommen und bleiben populär in wissenschaftlichen Labors, wie Tausende von veröffentlichten Artikeln belegt. Während die Menge der Formazan gemessen wird, durch aufnehmen der Extinktion bei 570 nm mit einer Platte-Lesung-Spektralphotometer, eine Referenzwellenlänge von 620 nm wird manchmal verwendet, aber nicht notwendig für die meisten Assay-Bedingungen. Unter Berücksichtigung der entscheidende Schritt, die hier beschriebenen fanden wir, dass die Kulturbedingungen verwendet, um Zellen wachsen die Ergebnisse der MTT-Assays beeinflussen können. Wir fanden, dass die Zellanzahl der lebensfähigen, die Zelle Stoffwechselaktivität, alter Kulturen und die Anzahl der Durchgänge und der Wachstum Medienangaben alle wichtigen Faktoren sein können. Also, sie müssen berücksichtigt werden bei der Wiederholung des Tests und Analyse von Daten. Darüber hinaus unterscheiden sich die Zelle Kulturbedingungen für jede Zell-Linien. Es ist so kompliziert, klare Angaben über die Zelle Dichte Aussaat zu bieten. Als Faustregel gilt eine durchschnittliche Anzahl von Zellen zwischen 2.000-10.000 Zellen pro Bohrloch wird empfohlen, eine optimale Zelldichte innerhalb 72 h vor allem erreichen, MTT-Reduktion tragfähige Zellstoffwechsel widerspiegelt und nicht, speziell, Zell-Proliferation oder Zelltod. MTT-Assays sollte daher weder als Messung beschrieben werden Handy-Verbreitung noch Zell-Zytotoxizität20,11. Die Erkennung des Zelltods stützt sich auf spezifische zellbasierte Assays. Zum Beispiel in den vorhergehenden Studien verwendet wir western-Blot Analyse erkennen Caspase 3 Aktivierung und/oder flow Cytometry Analyse zur Erkennung von Phosphatidylserin in das äußere Plasmamembran Merkblatt zum Nachweis der Proapoptotic Aktivität von mAb 8B613.

Wenn Kombination zu testen Drogen, können sie zusammen oder nacheinander in der Zeit geliefert werden. Angesichts der Vielfalt der Wirkmechanismus, ist es schwierig, genaue Richtlinien für die entsprechende experimentelle Einstellung bereitzustellen. Dennoch nutzen die meisten Ermittler direkte Prüfung von Medikamenten-Kombinationen. Darüber hinaus sind die Konzentrationen, die eine definierte Single-Agent-von 50 % Zelle Wachstumshemmung Wirkung gebräuchlich. Medikament Konzentrationen reflektieren Plasmakonzentrationen bei Patienten erreichbare gelten häufig klinisch als relevant. So erfolgt die Kombination-Dosis-Wirkungs-Analyse für mehrere Dosen, Konstanthaltung der Kombination Verhältnis mit einer seriellen Verdünnung (ED50)mAb/ (ED50)Medikament Verhältnis, obwohl es keine absolute Voraussetzung ist 1. Note, die CI-Werte berechnet werden soll auch an verschiedenen ED getestet (z.B., ED50ED75und ED90), da sie mit dem Fa in einem Linear1ändern können. Nach durchführen der automatischen Analyse der CI-Werte, der lineare Korrelationskoeffizient R-Wert geschätzt, indem die Algorithmen sollte > 0,9, die Güte der Anpassung der experimentellen Daten zu reflektieren. CI-Werte der < 1 angeben, Synergie, CI-Werte der = 1 angegeben, Additivität und CI-Werte von > 1 bezeichnen Antagonismus1. Aufgrund der Variabilität in der experimentellen Methoden und das biologische System sollten die berechneten CI weitere statistische Betrachtung unterzogen werden. Als solche ist eine einfache Methode, das Medikament Kombination Experiment mehrere Male gefolgt von der Berechnung der resultierenden CI-Werte vor der Bestimmung der statistischen Mittelwert ± SD1wiederholen. Es ist auch ratsam, um die Kombination zu testen, in die größte mögliche Panel Zelllinien, die Variabilität berücksichtigen, die zwischen ihnen besteht.

Wichtig ist, sind mehrere Parameter in der in-vitro- Studie nicht für die in-Vivo -Hochrechnung berücksichtigt. Zum Beispiel die in-vitro- Lebensfähigkeit Assays, die weder in Betracht ziehen, die in Vivo Halbwertszeit von der Droge, noch die in Vivo Arzneimittelstoffwechsel, die Droge Inaktivierung führen kann. So sollte die Extrapolation von in Vitro , in Vivo bleibt eine gesonderte Frage, und die wohltuende Droge Interaktion belegt in Vitro weiter bestätigte in Vivo. Als solche ist ein klarer Beweis für Synergie bei Mäusen mit Tumor Xenografts, mit der Kombination-Index-Methode veröffentlicht21gewesen. Doch in Vivo Studien erfordern eine große Zahl von Tieren Synergie genau definiert und sind teurer und zeitaufwändiger. Die alternative wirksames Modell F-Test erfordert noch erhebliche Mittel22. Ein anderen Ansatz zur Beschränkung der Nutzung einer großen Anzahl von Tieren besteht die Droge Synergie in Zellmodellen Kultur folgte die Beweise für eine erhöhte Antitumor-Reaktion der Kombination in einem begrenzten Xenograft Studie14zu demonstrieren, haben wir die menschlichen Neuroblastoma IMR5 Zellen als Tumor-Ziel für die in-Vivo -Studie. Wir behielten IMR5 Zellen, weil sie tumorigenic immungeschwächte Mäuse23sind. Während menschlichen Tumormodellen Xenograft wertvolle Modelle bieten für das Testen von Medikamenten-Kombinationen in Vivo24, kann es schwierig, solche Modelle aus einer Vielzahl von Zelle Linien25festzustellen sein. Um die Inzidenz von Tumorbildung bei Mäusen zu erhöhen, können Zellen in Mäusen mit einer Membran-Keller-Matrix als ein Fahrzeug25injiziert werden. Wichtig ist, da Membran Keller Matrix polymerisiert und bei Temperaturen über 5 ° C erstarrt, alle Cultureware oder Medien kommen in Kontakt mit der Membran-Keller-Matrix prechilled/Eis-kalt sein sollte, und die Membran Keller Lösungen aufbewahrt werden, auf während des gesamten Prozesses25Eis. Mit dem Einsatz der Membran Keller Matrix, beobachteten wir eine 100 % nehmen-Rate mit IMR5 Zellen, während bei fehlender Membran Keller Matrix, diese Zelllinie demonstriert ein < 80 % nehmen Rate (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus kann Membran Keller Matrix um die Inzidenz von Tumor Transplantat zu erhöhen, auch der Tumor Wachstum Rate25erhöhen. Wir beobachteten, dass alle Xenotransplantate tagsüber 11 erschienen war. Jedoch konnte in den ersten sieben Tagen nach dem Tumor Zelle Foulspiel, das Vorhandensein von Klumpen beobachtet werden die durch die Anwesenheit von der anfänglichen Inokulum (Daten nicht gezeigt) verursacht werden können. So haben wir nicht Messungen der Größe des Tumors sinnvoll vor dieser Zeit berücksichtigt. Über die Membran Keller Matrix machte es möglich, die Anzahl der Mäuse in der experimentellen Einstellung zu reduzieren und die in-Vivo -Experiment innerhalb von drei Monaten durchführen.

Medikament/Antikörper Dosierungen variieren je nach der Zelle Linie und Maus-Stamm. Aufgrund der Einschränkung des in-vitro- Lebensfähigkeit Assays für die Extrapolation der in Vivo Medikament/Antikörper-Dosierung oben beschriebenen wurden klinisch relevante Dosierungen für Topotecan und mAb 8B6 in der in-Vivo -experimentelle Einstellung beibehalten, basierend auf den Daten von anderen Benutzern veröffentlicht26,27. Um die menschlichen Dosierung Einstellung, um Mäuse zu extrapolieren, waren zuvor veröffentlichten Leitlinien28 gefolgt. Per Se wir 150 µg der Antikörper 8B6 i.v. an Tag 7, gefolgt von einer zweiten Injektion fünf Tage später injiziert (Gesamt-Dosis/Maus = 300 µg). Topotecan Behandlung begonnen am selben Tag wie die erste mAb 8B6 Injektion durch die Injektion von 0,36 mg/kg Topotecan oder PBS Kontrolle i.p an fünf aufeinander folgenden Tagen. Unter Berücksichtigung der entscheidende Schritt, die hier beschriebenen empfehlen wir Ihnen, Antikörper Infusionen beginnen, wenn der Tumor Xenografts ~ 50 mm3erreichen. Höhere Tumor Xenograft Volumen führt eine geringere Ansprechrate weil Tumor Belastungen deutlich umgekehrt mit Antikörperkonzentration, Antikörper-Exposition und Antikörper Wirksamkeit29korrelieren. Wir erhalten auch Gewichtsverlust als Indikator für systemische Verträglichkeit jedes getestete Therapie16. Aber die Interpretation der gesammelten Gewichte kann nicht hilfreich sein, mit einem großen Tumor Masse. In diesem Fall wird die Körper Zustand scoring, wie an anderer Stelle beschrieben16, empfohlen.

Tumoren können gesammelt werden, zu verschiedenen Zeitpunkten für Immunchemie Analyse bieten weitere Informationen über den Mechanismus der Aktion in Vivoausgelöst. In einer früheren Arbeit wurde der Tumor Apoptotic Index nach mAb 8B6 Infusion13bewertet. Zu diesem Zweck wurden apoptotischen Tumorzellen nachgewiesen anhand einer TUNEL-Test13. Darüber hinaus war der Anteil der Tumor Zellkerne erzielte mit Ki67 Antigen-Positive Färbung um den Tumor Verbreitung Index13zu analysieren.

Stark immungeschwächte Mäuse fehlen angeborenen und der adaptiven Immunität mit dem Verlust von T-Zellen, B-Zellen und natürlichen killer (NK) Zellen mit reduzierten Makrophagen und Antigen-präsentierenden Zellfunktionen und das Fehlen der zirkulierenden Ergänzung30. So erlaubt dieses Protokoll nicht Forscher, keine Schlüsse hinsichtlich der vermeintlichen Auswirkungen der Chemotherapie in potenzierende mAb-Therapie durch die Veränderung der Tumor Mikroumgebung in Vivo31. Vermeintliche immunmodulatorische Effekte von dem Chemotherapeutikum sowohl die Rolle der Fragment-kristallisierbares (Fc) und Umgebung: die mAb bei der Verbesserung der Droge Antitumor-Potenz verdienen Beachtung, aber diese Fragen erfordern die Verfügbarkeit einer Phänomen-Modell mit einem intakten Immunsystem und eine physiologische Tumor Mikroumgebung.

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Disclosures

S.Fa., j.f. und S.B. werden als Erfinder des angemeldeten Patenten für die klinische Anwendung von therapeutischen Antikörpern Anti-O-Acetyl-GD2 bezeichnet.

Acknowledgments

Unterstützung gewähren: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, Les Bagouz' À Manon, La Ligue Contre le Cancer Comité de Loire-Atlantique, Comité du Morbihan und Comité de Vendée, Une rose Gießen S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin und la Société Française de Lutte Contre Les Krebsarten et Les Leucémies de l ' Enfant et de L'adolescent (SFCE). M.b. und j. F. werden von La Ligue Contre Le Cancer unterstützt. Die Autoren danken die UTE-Anlage von der Struktur Fédérative de Recherche François Bonamy. Die Autoren danken auch Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) für die Bereitstellung der IMR5 Zellen und Frau H. Estéphan für ihre technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

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