Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generation af menneskelige primordiale kønsceller-lignende celler på overfladen af Embryoid organer fra primet pluripotency induceret pluripotente stamceller

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for både sæd og æg. Menneskelige embryonale PGCs er angivet fra pluripotente epiblast celler gennem interaktioner af cytokiner. Her beskriver vi en 13-dag protokol af inducerende menneskeceller transcriptomally ligner PGCs på overfladen af embryoid organer fra PRIMES-pluripotency induceret pluripotente stamceller.

Abstract

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler. I mus embryoner, er en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs induceret fra pluripotente epiblast celler af orkestreret engagementer med cytokiner, herunder ben morfogenetiske proteiner 4 (Bmp4). I menneskelige embryoner, de tidligste PGCs er blevet identificeret på endodermal væggen af blommesækken omkring slutningen af 3rd uge af drægtigheden, men lidt er kendt om processen med menneskelige PGC specifikation og deres tidlige udvikling. For at omgå de tekniske og etiske barrierer for at studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller været for nylig genereret fra pluripotente stamceller. Her beskriver vi en 13-dag protokol for robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) vedligeholdes i tilstanden PRIMES pluripotency er udruget i 4i naive omprogrammering medium for 48 timer, dissocieres til enkelt celler og pakket ind i microwells. Langvarig vedligeholdelse af hiPSCs i den naive pluripotency stat forårsager betydelig kromosomforandringer og bør undgås. hiPSCs i microwells vedligeholdes for en yderligere 24 timer i form embryoid organer (EBs), som derefter 4i mellemlang kulturperler i lav-overholdelse af plasticware under en vuggende tilstand i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4. EBs er yderligere kulturperler i op til 8 dage i den vuggende, ikke-tilhænger betingelse for at opnå maksimalt udbytte af hPGCLCs. HPGCLCs registreres som immunhistokemi, let som celler kraftigt udtryk for OCT4 i næsten alle EBs udelukkende på deres overflade. Da EBs er enzymatisk adskilles og underkastes FACS berigelse, hPGCLCs kan afhentes som CD38 + celler med op til 40-45% udbytte.

Introduction

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler i begge køn. De fleste af vores viden om udvikling af PGCs i pattedyr embryoner er opnået gennem at studere laboratorium mus1,2. Embryonale dag 6.0-6.5 i mus embryoner, er 6 eller lignende mindre antal PGC prækursorer placeret i epiblast, og en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs er induceret fra dem på en måde, der er afhængige af ben morfogenetiske proteiner, Bmp2 og Bmp4 udskilles fra tilstødende celler. De tidligste menneskelige PGCs hidtil identificeret i embryoner blev på endodermal væggen af blommesækken på omkring slutningen af den tredje uge af drægtigheden3. Fordi dette er det samme sted som overflytter PGCs er observeret i mus embryoner, er det sandsynligt, at de observerede menneskelige PGCs var i vejen for migration, men ikke den stiftende befolkning. Men undersøgelser sporing tilbage tidligere stadier af PGCs eller PGC prækursorer i menneskelige embryoner har manglet.

Adgang til menneskelige embryonale PGCs er udfordrende på grund af både tekniske og etiske forhindringer. For at overvinde disse forhindringer, har PGC-lignende celle kultur modeller været for nylig genereret fra humane pluripotente stamceller (PSC). Pluripotency er den cellulære evne til at differentiere i genom og tre embryonale kønscellers lag4. Der henviser til, at menneskers PSC'er vedligeholdes i mTeSR1 medium (en klar-til-brug, kommercielt tilgængelige medium formuleret til vedligeholdelse af menneskelige PSC'er i tilstanden PRIMES pluripotency) på retter belagt med det ekstracellulære matrix protein har PRIMES-state pluripotency 4, i 2013 Jacob Hanna lab viste at PRIMES pluripotency celler kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved at udsætte til det naive menneskelige stamceller medium (NHSM) der indeholder kemiske hæmmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, LUCY, ROCK, PKC, og p38 MAPK samt vækstfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Fra de naive-pluripotency menneskelige PSC'er, i 2015 gennemført en forskningsgruppe ledet af Hanna og Azim Surani første robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSC'er6. Senere, rapporteret flere andre laboratorier, herunder vores, generation af hPGCLCs fra kvikskrankerne ved hjælp af lidt forskellige protokoller7,8,9,10. Vores undersøgelse fremlagt bevis for at hPGCLCs genereret ved hjælp af forskellige protokoller (som er opsummeret i tabel S1 af vores tidligere offentliggjort undersøgelse10) er transcriptomally ligner hinanden10. Foreliggende beviser understøtter ligheden af menneskelige PGCLCs til nyuddannede menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetiske erasure7 og/eller kemotaktisk migration10.

Undersøgelser af mus embryonale PGCs, mus PGCLCs og menneskelige PGCLCs (men med kun meget begrænset adgang til menneskelige PGCs) har afsløret at molekylære mekanismer af PGC specifikation afviger betydeligt mellem mus og menneskelige1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. For eksempel, Prdm14 spiller vigtige roller i PGC specifikation i mus embryoner, men dens rolle i menneskelig PGC specifikation synes begrænset1,15. Derimod er induktion af SOX17 af EOMESODERMIN afgørende for PGC specifikation6,11,14, boer disse transkriptionsfaktorer synes undværes for musen PGC specifikation15. Disse første resultater af undersøgelser med hPGCLCs kraftigt støtter betydningen af denne celle kultur model som en surrogat af menneskelige embryonale PGCer.

Nyligt offentliggjorte undersøgelser, der involverer vores lab dyb sekventering evaluering af genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist, at langvarig vedligeholdelse af PSC'er i tilstanden naive pluripotency betydeligt øger risikoen for kromosomale ustabilitet og strukturelle misdannelser. Dette fænomen blev observeret med både mus18 og menneskelige19 PSC'er. Den oprindelige hPGCLC produktion protokol rapporteret af Hanna/Pacôme blev udviklet til menneskelige PSC'er vedligeholdes i 4i naive pluripotency medium for mindst 2 uger6. For at bevare den normale diploide karyotype menneskelige PSC'er og PGCLCs, udviklede vi en modificeret protokol som menneskelige kvikskranker er udsat for 4i medium for kun 72 timer10, som er fremlagt i denne artikel. Menneskelige iPSCs (hiPSCs) vedligeholdes under PRIMES pluripotency staten. Umiddelbart før EB dannelse inkuberes cellerne i 4i naive omprogrammering medium (en modificeret NHSM medium) i 48 timer. Celler er derefter adskilles og pakket ind i microwells til at danne EBs et ekstra døgn i 4i medium. EBs er fastholdt i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4 under en vuggende betingelse for ikke-attachment kultur i op til 8 dage at få det maksimale udbytte af hPGCLCs. Efter 8 dages EB kultur, kan hPGCLCs være isoleret fra dissocierede EB celler af FACS som CD38 + celler med op til ~ 40% udbytte i FACS-sorterbare enkelt cellesuspension. Mens andre offentliggjort generere metoder7,8,9, herunder den originale protokol før vores ændringer6, typisk hPGCLCs i spontant dannede celle aggregater uden specifik lokalisering, hPGCLC produceret af vores protokol er observeret på overfladen af embryoid organer (EBs).

Protocol

1. celle kultur af hiPSCs i Primed Pluripotency tilstand

  1. Forberedelse af ekstracellulære matrix protein-coated retter
    1. Optø Matrigel (ekstracellulære matrix protein) på is i et køleskab eller et kølerum natten (ikke tø op ved stuetemperatur eller ved hjælp af et varmt vandbad). Alikvot matrix protein (~ 200 μl; en alikvot mængde er bestemt af fabrikanten for hver batch og angivet på etiketten på hætteglasset) i sterilt lav-binde centrifugeglas eller celle kryopræservering rør på is. Det er vigtigt at holde ekstracellulære matrix protein iskold under udlevering for at undgå størkning. Gemme alikvoter ved-80 ° C.
    2. For at pels celle kultur plastic retter med ekstracellulære matrix protein, fortynde en alikvot med 25 mL iskold DMEM/F12 og spredning til tre 10-cm retter (~ 8 mL/parabol). Inkuber retter ved stuetemperatur i mindst 1 time. Efter belægning, kan retter forseglet, ved hjælp af Parafilm og opbevares ved stuetemperatur i op til en uge.
    3. Opsug medium fra retter umiddelbart før podning af PRIMES pluripotency hiPSCs. Det er ikke nødvendigt at vaske de coatede retter med medium eller calcium/magnesium-gratis fosfatbufferet saltopløsning [PBS(-)].
  2. Indledning af hiPSC kultur i tilstanden PRIMES pluripotency
    1. Tilsættes 2 µL af 50 mM Y27632 [hæmmer af Rho-forbundet protein kinase (ROCK)] 10 mL af mTeSR1 medium i en 15 mL centrifugeglas. Forbered to rør af ROCK-hæmmer-suppleret 10 mL medium at indlede cellekultur i en 10-cm parabol fra 1 mL frosne celle lager. Brug Y27632-suppleret medium på samme dag. Prewarm Y27632-suppleret medium i et 37 ° C vandbad i 5 min.
      Bemærk: Denne protokol fungerer godt med hiPSCs fastholdt i mTeSR1. Når hiPSCs er opretholdt i andre medier understøtter menneskelig PSC vækst med varierende grader af primet eller naive pluripotency, udbytte af hPGCLCs varierer betydeligt.
      Bemærk: Komplet mTeSR1 holdbarhed er 2 uger ved 4 ° C og 6 måneder på-20 ° C, men igen indefrysning forårsager dårlig ydeevne. Vi fryser 40 mL alikvoter af mTeSR1 ved-20 ° C indtil brug.
    2. Optø et hætteglas med PRIMES pluripotency hiPSC frosne stock (1.0-3.0 x 106 celler i 1 mL kryopræservering medium) ved hjælp af et 37 ° C vandbad. Umiddelbart efter afslutningen af optøning, overføre hele indholdet af et hætteglas ind i et rør (10 mL) af forvarmet Y27632-suppleret medium.
    3. Centrifuge cellesuspension ved stuetemperatur, 300 x g forvarmet 8 min. kassere supernatanten og resuspend celle pellet med 10 mL Y27632-suppleres fra andre røret.
    4. Jævnt fordelt cellesuspension til en ekstracellulær matrix protein-coated 10-cm parabol. Placer fadet i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Opretholde hiPSC kultur under en lav ilt pres.
    5. Ændre medium (mTeSR1 uden Y27632) hver dag. ROCK-hæmmer (Y27632) er afgørende for hiPSC overlevelse umiddelbart efter dissociation til enkelt celler. Når hiPSCs overholde på ekstracellulære matrix protein-coated overflade som jævnt fordelte lille aggregater med > 10% confluency, (som typisk er afsluttet inden for 16 timer efter podning), Y27632 er undværes. For tidligt medium ændring efter podning af dissocierede hiPSCs uden Y27632 kan forårsage næsten komplet celledød.
  3. Passaging primet pluripotency hiPSCs
    Bemærk: Passage primet pluripotency hiPSCs når kolonier besætte ~ 80% af den effektive vækstområde. Korrekt passaging procedurer og tætheder er vigtigt for eksperimenterende reproducerbarhed. Vi har set, at effektiviteten af hPGCLC induktion ikke er signifikant forskellig mellem hiPSC kulturer 6 dage efter indledningen af en frossen lager (der involverer en eller to passager) eller en måned (der involverer > 10 passager). Induktion af hPGCLC blev med held udført fra hiPSCs vedligeholdes i over to måneder, selv om effektiviteten ikke var kvantitativt vurderes.
    1. Tage 4 mL af celle dissociation enzym blandingen i en 15 mL centrifugeglas, og Blandingen henstår til stuetemperatur i 5 min.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15 mL centrifugeres rør for > 5 min. ved 37 ° C i et vandbad.
    3. Tilføj 2 µL af 50 mM Y27632 (ROCK hæmmer) til 10 mL mTeSR1 medium i en 15 mL centrifugeglas. Forbered to rør af ROCK-hæmmer-suppleret 10 mL medium og bruge i samme dag. Tage 5 mL mTeSR1 i en anden 15 mL centrifugeglas, uden at tilføje Y27632. Prewarm medium +/-Y27632 i et 37 ° C vandbad i 5 min.
      Bemærk: Alle mellemstore delprøver forberedt i trin 1.3.3 kan indeholde Y27632.
    4. Opsug gamle medium fra et 10-cm parabol og skyl celler med forvarmet 10 mL PBS(-). Kassere PBS(-) og tilsættes 4 mL af dissociation enzym til fadet. Placer fadet i en CO2 inkubator (tri-gas inkubator virker, men ikke nødvendigt) for ~ 4 min. indtil celler løsnes fra bunden. Forsigtigt afpipetteres celler op og ned for at gøre enkelt-celle suspension.
    5. Overfør hiPSC encellede suspension til det prewarmed rør, der indeholder 5 mL medium uden Y27632 (samlede volumen i en 15 mL tube er omkring 9 mL). Centrifuge cellesuspension ved stuetemperatur, 300 x g for 8 min.
    6. Kassér supernatanten og resuspend celle pellet med 10 mL af prewarmed medium medium indeholdende Y27632.
    7. Fjerne celle aggregater ved hjælp af en 40-µm celle si og bestemme celle tæthed ved hjælp af en Coulter counter.
    8. Fortyndet cellesuspension med forvarmet Y27632-suppleret medium til at opnå 3.0 x 106 celler i 10 mL til podes en ekstracellulære matrix protein-coated 10-cm parabol. Placer den podet skål i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2).
    9. Ændre medium (mTeSR1 uden Y27632) hver dag.

2. generation af hPGCLCs

Bemærk: Indlede følgende trin, når hiPSC celler i en 10 cm parabol (mTeSR1 medium, ekstracellulære matrix protein-coated) når til ~ 80% confluency (cirka 107 celler).

  1. Forberedelse af ekstracellulære matrix protein-coated retter (dag 1)
    1. Tø en alikvot af ekstracellulære matrix protein på is og fortyndes i 25 mL iskold DMEM/F12.
    2. Dispensere fortyndet ekstracellulære matrix protein til 6-godt plader (1 mL/hul). En delprøve er tilstrækkelig til at belægge 24 wells (4 plader). Inkuber plader ved stuetemperatur i mindst 1 time. Ubrugte overtrukne plader kan forseglet og opbevares ved stuetemperatur i op til en uge.
    3. Opsug medium fra plader umiddelbart før podning af PRIMES pluripotency hiPSCs. Det er ikke nødvendigt at vaske de coatede retter med medium eller PBS(-).
  2. Podning af PRIMES pluripotency hiPSCs i ekstracellulær matrix protein-coated plader (dag 1)
    1. Tage 4 mL af celle dissociation enzym i en 15 mL centrifugeglas, og Blandingen henstår til stuetemperatur i 5 min.
    2. Prewarm 10 mL PBS(-) i en 15 mL centrifugeres rør for > 5 min. ved 37 ° C i et vandbad.
    3. Tilføje 7 µL af 50 mM Y27632 (ROCK hæmmer) til 35 mL mTeSR1 medium i et 50 mL-centrifugerør. Brug Y27632-suppleret medium i samme dag. Gøre to rør for samlede 70 mL Y27632-suppleret medium og prewarm medium i et 37 ° C vandbad i 15 min.
    4. Opsug gamle medium fra et 10-cm parabol og skyl celler med forvarmet 10 mL PBS(-). Kassere PBS(-) og tilsættes 4 mL af celle dissociation enzym til fadet. Placer fadet i en CO2 inkubator (tri-gas inkubator virker, men ikke nødvendigt) for ~ 4 min. indtil celler løsnes fra bunden. Forsigtigt afpipetteres celler op og ned for at gøre enkelt-celle suspension.
    5. Overfør hiPSC encellede suspension til det prewarmed rør, der indeholder 10 mL Y27632-suppleret medium. Centrifuge cellesuspension ved stuetemperatur, 300 x g for 8 min.
    6. Kassér supernatanten og resuspend celle pellet med 10 mL forvarmet Y27632-suppleret medium.
    7. Filtrer cellesuspension gennem en celle si (40 µm porestørrelse) at fjerne celle aggregater og tælle celler ved hjælp af en Coulter counter.
    8. Fortynd hiPSC enkelt cellesuspension til 5,0 x 106 celler i 50 mL forvarmet Y27632-suppleret medium.
    9. Podes 2 mL cellesuspension (2.0 x 105 celler) i hvert hul i de belagt 6-godt plader (4 plader, 24 wells). Kontroller, at cellerne er jævnt fordelt i hver brønd. Placer celle kultur plader i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2).
      Bemærk: Inokulum celle tæthed og jævn fordeling i hver godt er kritisk. Fordi podning af hiPSCs til 10 cm retter kan forårsage betydeligt højere celle tæthed end andre områder. Selv celle tæthed af encellede hiPSCs kan opnås lettere med 6-godt plader.
    10. Ændre medium med 2 mL/hul mTeSR1 (uden Y27632) 24 timer efter podning.
  3. Konvertering af PRIMES pluripotency tilstand hiPSCs til 4i-naive (ERK-uafhængig) pluripotente celler (dag 3 og dag 4)
    1. Forberede 4i komplet naive pluripotency medium i et 50 mL centrifugeglas, som følger (dag 3 og dag 4): 50 mL af 4i basal medium, 5 µL 30 mm CHIR99021, 5 µL af 10 mM PD0325901, 5 µL af 20 mM BIRB796, 5 µL af 50 mM SP600125 , og 5 µL af 50 mM Y27632.
      Bemærk: Gemme 4i basal medium på-80 ° C og tø i køleskab natten over. Forberede frisk 4i komplet medium umiddelbart før brug. Undgå eksponering af 4i kemikalier (CHIR, PD, BIRB og SP) til stærkt lys. Opbevar ikke 4i komplet medium ved 4 ° C eller frosne natten over eller længere.
    2. Varm 50 mL 4i komplet medium i et 37 ° C vand parti for 15 min. ændring medium med forvarmet 4i komplet medium (2 mL/hul) ved 48 og 72 timer efter podning. Nøjagtige timing af medium forandring er vigtigt at opnå høj hPGCLC udbytte og eksperimenterende reproducerbarhed.
      Bemærk: Tæthed af 4i hiPSC kultur er høj under denne betingelse og blive sammenflydende 48-72 timer efter podning, men dette er normal.
  4. EB formation bruger microwell plader (dag 5)
    1. Forberede 50 mL af 4i komplet medium i et 50 mL centrifugeglas og prewarm det i et 37 ° C vandbad for ~ 15 min før brug.
    2. Prewarm 35 mL DMEM/F12 i et 50 mL centrifugeglas i et 37 ° C vandbad for ~ 15 min før brug.
    3. Forberede en microwell plade
      1. Tilsæt 5% (w/v) filter-steriliseret Pluronic F-127 vaskemiddel i 8 aktive brønd af en microwell plade (Se Tabel af materialer; 0,5 mL/hul).
      2. Der centrifugeres microwell pladen ved stuetemperatur, 1.000 x g, i 5 min. inspicere microwells med en inverteret mikroskop for at sikre fravær af luftbobler. Forlade microwell pladen i 30 min. ved stuetemperatur til pels microwells med vaskemiddel.
      3. Kassér rengøringsmiddel fra pladens huller microwell af pipettering og skyl brønde med forvarmet DMEM/F12 (2 mL/hul).
      4. Der centrifugeres microwell pladen ved stuetemperatur, 1.000 x g i 5 min. inspicere microwells med en inverteret mikroskop for at sikre fravær af luftbobler.
        Bemærk: Når luftbobler overholdes stadig i microwells, undersøge hvis arket microwell er stadig fast limet til bunden af brønden.
      5. Kassere DMEM/F12 fra pladens huller microwell af pipettering og skyl brønde med forvarmet DMEM/F12 (2 mL/hul).
      6. Gentag trin 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Tilsæt 4i komplet medium i de skylles brønd af microwell pladen (1 mL/hul). Holde den resterende 4i komplet medium i et 37 ° C vandbad.
      8. Der centrifugeres microwell pladen ved stuetemperatur, 1.000 x g i 5 min. inspicere microwells med en inverteret mikroskop for at sikre fravær af luftbobler.
      9. Placere microwell pladen i en tri-gas inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2) indtil podning af 4i hiPSCs.
    4. Podning af 4i iPSCs i en microwell plade
      1. Tage 13 mL af celle dissociation enzym i en 15 mL centrifugeglas, og Blandingen henstår til stuetemperatur i 5 min.
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) i en 50 mL centrifugeres rør for > 5 min. ved 37 ° C i et vandbad.
      3. Opsug gamle medium fra 24 wells af naive hiPSC celle kultur og skyl celler med forvarmet 2 mL/godt PBS(-). Slette PBS(-) og tilføje 0,5 mL/hul dissociation enzym. Placer celle kultur plader i en CO2 inkubator (37 ° C) for ~ 4 min, indtil celler løsnes fra bunden. Forsigtigt afpipetteres celler op og ned for at gøre enkelt-celle suspension.
      4. Overfør hiPSC encellede suspension til forvarmet 20 mL 4i komplet medium. Centrifuge cellesuspension ved stuetemperatur, 300 x g for 8 min.
      5. Kassér supernatanten og resuspend celle pellet med 5 mL forvarmet 4i komplet medium.
      6. Filtrer cellesuspension gennem en celle si (40 µm porestørrelse) at fjerne celle aggregater. Vask celle si 3 gange med 1 mL forvarmet 4i komplet medium. Tælle celler ved hjælp af en Coulter counter.
      7. Fortynd enkelt cellesuspension af 4i naiv hiPSCs til 27,0-32,4 x 106 celler i 9 mL forvarmet 4i komplet medium. Bemærk at 4i komplet medium indeholder allerede Y27632.
      8. Tage den microwell plade indeholdende 1 mL af 4i komplet medium i 8 godt fra en tri-gas inkubator (2.4.3.9). Podes 1 mL 4i naiv hiPSC suspension (3.0-3,6 x 106 celler/brønd) i hver brønd. Denne celle massefylde er kritisk. Kontroller, at cellerne er jævnt fordelt i hver brønd ved forsigtigt pipettering.
      9. Der centrifugeres microwell pladen ved stuetemperatur, 100 x g i 3 min.
      10. Microwell pladen anbringes i en tri-gas CO2 inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Forstyr ikke celler pelleted i microwells. Inkuber celler i 24-30 timer. En natten inkubation (~ 16 timer) er typisk utilstrækkelige for dannelsen af stramme EBs.
  5. Overførsel af EBs til lav monteringsbeslag for vuggende kultur (dag 6)
    1. Forberede hPGCLC komplet medium i et 50 mL centrifugeglas som følger (dag 6 - dag 13):
      20 mL hPGCLC basal medium, 4 μL af 500 mM 2-Mercaptoethanol, 50 μL af 20 mg/mL L-ascorbinsyre, 4 μL af 50 mM Y27632, 50 μL 100 μg/ml rekombinant human BMP4, 4 μL af 500 μg/mL menneskelige SCF, 4 μL af 250 μg/mL menneskelige EGF , og 8 μL af 250 μg/mL menneskelige LIF.
      Bemærk: Forberede friske hPGCLC komplet medium umiddelbart før brug og undgå udsættelse for lys. Opbevar ikke hPGCLC komplet medium ved 4 ° C eller frosne natten over eller længere.
      Bemærk: Koncentrationen af BMP4 er meget høje. Den optimale BMP4 koncentration kan variere mellem partier af BMP4. Lot-for-lot forskellen i BMP4 stærkt påvirker hPGCLC produktion. I fravær af BMP4 på mellemlang og komplet hPGCLC er udbyttet af hPGCLCs meget lav6. Betydningen af andre cytokin på mellemlang og komplet hPGCLC blev beskrevet af Hanna/Pacôme6.
      Bemærk: I denne protokol, den endelige koncentration af menneskelige LIF i komplet hPGCLC medium er 100 ng/mL6,10. Den endelige LIF koncentration til tidligere offentliggjorte undersøgelser, herunder vores, var 1 μg/mL. Når den specifikke aktivitet af menneskelige LIF reagens er > 10.000 enheder/μg (ED50 < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF er tilstrækkeligt til at understøtte hPGCLC generation fra EBs.
    2. Overførsel af EBs
      1. Prewarm 5 mL hPGCLC basal medium og 20 mL hPGCLC komplet medium for > 5 min. ved 37 ° C i et vandbad.
      2. Omhyggeligt placere en celle si op og ned på toppen af en 50 mL polypropylen koniske rør.
      3. Med pipette overfoeres hvert hul i microwell plade meget forsigtigt plade at løsrive EBs fra microwells. Filtrere alle indholdet af hver brønd gennem celle si at fjerne celler ikke indarbejdet i EBs.
      4. Vaske EBs bevaret på celle sien med 1 mL af forvarmet hPGCLC basal medium. Forsigtigt Gentag vask 5 gange.
      5. Vasket EBs er nu bevaret på membranen af en si, der er på en 50 mL konisk røret på hovedet. Placer en frisk 50 mL konisk slange på celle sien, så celle sien er normalt placeret i det nye rør. Derefter vendes hurtigt celle sien med nye rør. Celle sien og røret er nu i de normale brugsstillinger, og EBs er under membran af cellen si.
      6. Indsamle EBs i den koniske rør ved at tilføje 18 mL forvarmet hPGCLC komplet medium ovenfra membran af cellen si. Således vil medium gå gennem membranen og indsamle EBs fastgjort på den nederste side af membranen ned til bunden i centrifugeglasset.
      7. Plade suspension af EBs i wells af en lav-attachment 6-godt plade (3 mL/hul).
      8. Lav-attachment pladen anbringes på en vippe-move rocker i en tri-gas inkubator (37 ° C, 6,5% O2, 5% CO2). Sæt den vuggende hastighed på ~ 20 omgange pr. min.
        Bemærk: Anvend ikke hvirvlende bevægelse, fordi EBs samlet på midten af brønde og lunte. Justere omhyggeligt vuggende hastighed, så EBs ikke samlet. For kraftig vuggende vil fysisk skade EBs.
        Bemærk: Lav ilt pres er stærkt anbefales til EB kultur.
  6. Generation af hPGCLCs på overfladen af EBs (dag 7 - dag 13)
  7. Frisk forberede 20 mL hPGCLC komplet medium hver dag. Uden vuggende, EBs vil synke i bunden af brønde i ~ 1 min. Fjern gamle medium uden tørring EBs (~0.2 mL/hul gamle medium kan forblive) og tilføje frisk hPGCLC komplet medium hver dag (3 mL/hul).

3. immunhistokemisk farvning af EBs (dag 10 – dag 13)

  1. Indlejring EBs i ekstracellulær matrix protein blokke for formaldehyd-fast, paraffin-embedded (FFPE) immunfarvning
    1. At identificere hPGCLCs som OCT4+ celler, høste EBs i 1,5 mL lav-binde microcentrifuge rør. Lad EBs synke til bunds eller kortvarigt centrifugeres (2 sekunder) ved stuetemperatur og kassér medium. Skyl EBs med iskold PBS(-).
    2. Fjern PBS(-) og inkuberes EBs i 1 mL iskold 1%(w/v) natriumazid i PBS(-) i 5 min på is. Lad EBs synke til bunds eller kortvarigt centrifugeres (2 sekunder) ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, og skyl EBs med iskold PBS(-).
      Bemærk: Tilsætning af natriumazid bremser nedbrydningen af intracellulære proteiner og RNA udskrifter.
    3. Tø 200 µL af ekstracellulære matrix protein på isen og tilføje til det microcentrifuge rør indeholdende EBs. Forlade røret ved stuetemperatur for ~ 10 min indtil gelen er størknet.
    4. Der tilsættes 1 mL af 4% formaldehyd i PBS(-) og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. med blid vuggende.
      Bemærk: Begge EBs og ekstracellulære matrix protein er fastgjort under dette trin. Uden fiksation, kan gel blokke nedbrydes i løbet af processen af dehydrering. Hvis forhånd fastsat EBs er indlejret i gelen blok, EBs er fast igen med gel blok og kan være over fast.
    5. Kassér formaldehyd, og skyl EBs engang med iskold PBS(-). Der tilsættes 1 mL af 70% ethanol. Gel-embedded EBs kan opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C i en uge.
    6. Behandle den gel-embedded EBs med en standard FFPE protokol. Forberede 5 μm tykkelse FFPE dias. Lad dias tørre natten over og gemme dem ved stuetemperatur indtil immunfarvning.
      Bemærk: Vores rutinemæssige FFPE protokol er som følger: 70% ethanol, to ændringer, 1 time hver; 80% ethanol, en ændring, 1 time; 95% ethanol, en ændring, 1 time; 100% ethanol, tre ændringer, 1,5 time hver; xylen, tre ændringer, 1,5 time hver; paraffin voks (58-60 ° C), to ændringer, 2 timer. Dehydreret væv er indlejret i paraffinblokke og skæres på 3-10 μm (typisk 5 μm).
    7. Til farvning, helt tørre dias i 56 ºC ovn i mindst 30 min. Deparaffinize og fugte dias med xylener og sorterede alkohol serien. Derefter vaskes dias i vand fra hanen i 5 min.
    8. For at inaktivere endogene peroxidases, Ruger rehydreret dias med BLOXALL blokerer løsning ved stuetemperatur i 10 min. Derefter vask dias med PBS i 5 min.
    9. Blok dias med Normal hest Serum (eller normal sera af andre arter genereret sekundære antistoffer) ved stuetemperatur i 20 min.
    10. Inkuber dias med en anti-OCT-3/4 ged primære antistof fortyndet med 0,1% BSA i PBS(-) ved 4 ° C natten over (optimere fortynding og inkubering betingelser for hver primære antistof). Derefter vask dias med PBS(-) tre gange ved stuetemperatur, 5 min.
    11. Inkuber dias med anti-ged IgG (peberrod peroxidase-konjugeret sekundær antistof genereret af hest; Se Tabel af materialer) ved stuetemperatur i 30 min. Derefter vask dias med PBS(-) tre gange ved stuetemperatur, 5 min.
    12. Bland nødvendige beløb DAB farvning substrater (Se Tabel af materialer) umiddelbart inden brug og inkuberes dias i komplet DAB farvning løsning ved stuetemperatur for 5 min. skærm DAB farvning ved hjælp af en omvendt mikroskop og reaktionen standses Når OCT4+ celler er visualiseret hurtigt skylles dias i strømmende vand fra hanen.
    13. Dehydrere dias med sorterede alkohol og xylener serien. Diasene er klar til laser-fange microdissection. Forberede permanent FFPE dias ved hjælp af montering medium (Se Tabel af materialer) for høj opløsning mikroskopiske observationer.

4. FACS berigelse af hPGCLCs fra EBs (dag 10 – dag 13)

  1. Forberede enzym blanding af Embryoid krop Dissociation Kit
    1. Forbered enzym Mix 1 ved at tilføje 50 µL enzym P til 1.900 µL af Buffer X og vortex. Prewarm enzym Mix 1 i et 37 ° C vandbad i 15 min.
    2. Forberede enzym Mix 2 ved at tilføje 10 µL enzym A 20 µL Buffer Y.
    3. Bland enzym blander 1 og 2 for at forberede komplet EB Dissociation enzym Mix.
  2. Miljøomkostningerne EBs
    1. Høst EBs fra lav monteringsbeslag og centrifugeres ved stuetemperatur i en 15 mL centrifugeglas, 300 x g i 2 min. kassere supernatanten og resuspend EBs med 10 mL PBS(-). Centrifuge igen.
    2. Kassér supernatanten og resuspend EBs med komplet EB Dissociation enzym Mix (4.1.3). Inkuber EB suspension i et 37 ° C vandbad i 15-20 min. indtil EBs der dissocieres. Under inkubation, forsigtigt afpipetteres EBs hvert 3-5 min. at lette dissociation. Alternativt kan du bruge en automatiseret dissociator med Embryoid krop Dissociation Program.
    3. Tilføje iskold 8 mL PBS(-) til dissocierede EB cellesuspension. Filtrere cellesuspension gennem en 40-µm celle si. Vask celle si med 1 mL iskold PBS(-) tre gange.
    4. Tælle celler i filtreret cellesuspension ved hjælp af en Coulter counter.
    5. Centrifugeres cellesuspension på ved 4 ° C, 300 x g for 8 min og kassér supernatanten. Resuspend celle pellet med iskold 10 mL PBS(-).
    6. Opdele cellesuspension i to rør, et for ikke-farvning kontrol (~ 105 celler) og den anden for anti-CD38 farvning (alle resterende celler).
    7. Der centrifugeres de to rør ved 4 ° C, 300 x g for 8 min.
  3. Anti-CD38 farvning og FACS berigelse af hPGCLCs
    1. Resuspend celle pellet for ikke-farvning kontrol med 200 µL iskold 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) natriumazid i PBS(-). Anbring på is indtil flowcytometri.
      Bemærk: Tilsætning af natriumazid sinker internalisering af CD38 fra cellens overflade.
    2. Resuspend celle pellet for anti-CD38 farvning med iskold 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) natriumazid i PBS(-) til 1 x 106 celler pr. 100 µL.
    3. Tilsæt 10 µL pr. 1 x 106 celler af en FACS-grade, APC-konjugerede anti-CD38 antistof. Dække tube med aluminiumsfolie at undgå udsættelse for lys. Der inkuberes ved 4 ° C i 45 min med blid vuggende.
    4. Der tilsættes 5 mL iskold PBS(-) og centrifugeres ved 4 ° C, 300 x g i 8 min. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet med 5 mL iskold PBS(-). Gentag vask med PBS(-) tre gange i alt.
    5. Resuspend celle pellet med 500 μL iskold 3% (w/v) BSA og 1% (w/v) natriumazid i PBS(-) til en celle tæthed tilstrækkelig til FACS.
    6. Berige hPGCLCs som CD38+ celler, der typisk udgør klart adskilles celle befolkning. Brug no-farvning kontrol for at sikre identifikation af CD38+ celler. Typisk udbytte af hPGCLCs er 1-5% af alle FACS-undersøgt enkelte celler fra dag 10 EBs og 20-40% fra dag 13 EBs.

Representative Results

Microwell pladen benyttes her er i formatet 24-godt og har 8 boringer holding microwell plader, hvoraf hver støtter dannelsen af op til 1.200 EBs. Fra ca. 24 millioner af 4i naive pluripotency celler, denne microwell plade typisk genererer ~ 8.000 EBs bestående af ~ 3.000 celler pr. EB. Under ikke-tilhænger kultur af EBs med konstant vuggende, antallet af intakt EBs gradvist aftager på grund af spontane selv demontering, og ~ 3.000 EBs overleve indtil dag 13 i protokollen. De fleste af disse overlevende EBs har 50-200 hPGCLCs på deres overflade (anslået af immunhistokemisk påvisning af OCT4 + celler i serie sektioner af EBs, se figur 8), hvilket giver ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs i alt. Enzymatisk nedbrydning af EBs i enkelte celler er en relativt ineffektive proces, reducere udbyttet af FACS-beriget CD38 + hPGCLCs til 9.000-47.000 celler. I vores hænder var gennemsnitligt seks uafhængige, men på hinanden følgende partier af eksperimenter 14,038 ± 5,731 (mener ± SEM). Fordi CD38-negative EB celler celler express OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (Immunhistokemi) kun meget svagt, hvis ikke helt fraværende, alle EB celler kraftigt udtryk for OCT4 protein er næsten svarer til hele befolkningen i CD38 + hPGCLCs.

Den kritiske parameter i denne protokol indeholder celle tæthed. Når 2.0 x 105 menneskelige iPSCs podes i en ekstracellulære matrix protein-coated godt af 6-godt celle kultur plade (9,60 cm2 vækstområde pr. brønd) med 2 mL Y27632-suppleret medium (2.2.9), celler vil nå til omkring 20-30% confluency på 24 timer efter podning (figur 1). Efter en yderligere 24-timers kultur i mTeSR1 medium i mangel af Y7632, celler samlede og form kolonier, besætter ~ 30% af den vækst (figur 2). Celler er derefter kulturperler i 4i omprogrammering medium (2.3.2). Efter 24 timer af kultur i 4i medium, celler blive sammenflydende (figur 3). En yderligere 24-timers kultur på mellemlang og 4i gør cellerne tæt pakket (figur 4). Den præcise timing af medium forandring (hver 24 timer +/-4 timer) og celle tætheder er afgørende for vellykket dannelsen af EBs og hPGCLCs.

Efter 48-timers kultur i 4i medium, celler adskilles og podes til den microwell plade, som har wells 400 µm i størrelse (2.4). Selv om denne kommercielt tilgængelig microwell plade er belagt anbefales lav friktion af fabrikanten, frisk igen belægning med vaskemiddel (2.4.3) til at reducere risikoen for uønskede celle vedhæftning. 800 µm microwells resulteret i reduceret udbytte af hPGCLCs, hvilket tyder på betydningen af EB størrelse for korrekt instrueret differentiering. Celler podes i 4i medium vil danne EBs i microwells på 24-30 timer, som kan overholdes ved hjælp af en standard, omvendt fase kontrast mikroskop (figur 5). Cirkulær konturen af EBs bliver klart synlige på og efter 24 timers inkubation. Høst EBs på et tidligere tidspunkt (fx 16 timer efter podning) før deres cirkulære contour er klart synlig anbefales ikke, fordi sådanne EBs er meget sårbare over for mekaniske skader og let afmontere. Bemærk, at betydelige mængder af naive hiPSCs ikke er indarbejdet i EBs, som er normal. Disse personlige celler vil blive vasket væk før indledningen af vuggende kultur af EBs på lav-tilhænger overflade (2.5.2). Bemærk også, at EBs i vores protokol, der dannes i 4i naive pluripotency medium - ikke i hPGCLC medium. Før dannelsen af solid EBs i 4i medium før eksponering for hPGCLC medium er vigtig for fordeling af hPGCLCs på overfladen af EBs.

EBs vedligeholdes i hPGCLC medium under en vuggende, ikke-tilhænger kultur tilstand vil bevare deres kugleform uden sammenlægning eller fusion (figur 6 og figur 7). Alt for svage vuggende tilstand vil forårsage EB sammenlægning og fusion, men for hård tilstand vil afvikle EBs. Menneskelige PGCLCs fremstå som udtryk for OCT4 celler på overfladen af EBs efter så tidligt som den 5-dages kultur i hPGCLC medium, og deres antal øges indtil 8 dages kultur (figur 8). Yderligere inkubation af EBs kan medføre afvikling af EBs og tab af hPGCLCs. Menneskelige PGCLCs kan forbedres fra enzymatisk dissocierede EB celler efter 5-8 dage af kultur i hPGCLC medium af FACS som CD38 + celler (figur 9).

Figure 1
Figur 1: menneskelige iPSC cellekultur i Y27632-suppleret medium 24 timer efter podning. Celle densitet er omkring 20-30% sammenflydende. I nærværelse af ROCK hæmmer Y27632, celler har tendens til at sprede godt med lange, piglignende brudforlængelse. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: menneskelige iPSC cellekultur 48 timer efter podning. Celler samlede til form kolonier, besætter ~ 30% af vækstområde. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: menneskelige iPSC cellekultur inkuberes i 4i omprogrammering medie i 24 timer. Celler nå til confluency. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: menneskelige iPSC cellekultur inkuberes i 4i omprogrammering mediet i 48 timer. Konfluerende celler er tæt pakket. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: menneskelige iPSC EBs dannet i microwells efter 24 timers inkubation i 4i omprogrammering medium. Cirkulær konturen af EBs bliver synlige på 24-30 timer efter podning. Når konturerne er bekræftet under en fase kontrast mikroskop, EBs er klar til overførsel til en vuggende kultur tilstand. Skalalinjen = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: menneskelige iPSC EBs inkuberes i 24 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs i høj grad bevare deres kugleform. Skalalinjen = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: menneskelige iPSC EBs inkuberes i 192 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs er udvidet i forhold til deres udseende på 24-timers kultur, men de stadig i vid udstrækning opretholde sfæriske figurer uden sammenlægning eller fusion. Skalalinjen = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: menneskelige PGCLCs udtryk for OCT4 er lokaliseret på overfladen af hiPSC EBs inkuberes i 192 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs blev integreret i ekstracellulær matrix protein og forarbejdet til FFPE dias immunhistokemisk farvning af OCT4 (DAB substrat). Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Menneskets PGCLCs er beriget fra enzymatisk dissocierede EB celler af FACS som CD38+ celler. Efter inkubation i hPGCLC medium for 5-8 dage, kan EBs adskilles ved enzymatisk fordøjelsen at forberede enkelt cellesuspension. hPGCLCs kan blive beriget som CD38+ celler ved FACS (røde prikker). EB celler, der ikke udtrykke CD38 (blå prikker) der bør også indsamles som negativ kontrol. FACS gates CD38-positive og CD38-negative celler skal adskilles med en bred margin (grønne prikker) at undgå kontaminering af hver type af celler. De øvre og nedre paneler viser FACS profiler uden eller med anti-CD38 antistof farvning, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Robust produktion af hPGCLCs ved hjælp af protokollen beskrevet her blev bekræftet med tre uafhængige kloner af menneskelige iPSCs med normal diploide karyotype10. Disse iPSC kloner var afledt af den samme neonatal dermal menneskehud fibroblast celle kultur10. De vil blive leveret af forfatterne til denne artikel til efterforskere efter anmodning og under passende materialer overførsel aftale og shipping arrangement af frosne levende menneskeceller. Det er i øjeblikket uvist om hvorvidt normale karyotype er nødvendige for robust hPGCLC produktion ved hjælp af vores protokol eller dem, der indberettes af andre laboratorier.

Nylige undersøgelser har vist, at produktionen af hPGCLCs fra hiPSCs11 eller europæiske sektorråd14 ved hjælp af en protokol, der er beskrevet af Saitous gruppe af Kyoto University8 er afhængig af udtryk for EOMESODERMIN, kræves en T-box transkriptionsfaktor for Induktion af SOX17. SOX17 synes at fungere som master slægt afgørende transskription faktor i kønscelleoverførsel differentiering af humane pluripotente stamceller6. EOMESODERMIN er kodet af genet EOMES og CRISPR/Cas9 knockout af EOMES forårsaget næsten komplet fravær af SOX17 induktion i hPGCLC producerer betingelse11og udtryk for andre gener fulgt det samme mønster af den SOX17-null knockout celler. Overekspression af EOMESODERMIN fra en inducerbar vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produktion samt induktion af kønscelleoverførsel gener, herunder SOX17. Derimod induceret overekspression SOX17 også reddet de robuste PGCLC produktion, men uden at fremkalde EOMES. Således, EOMESODERMIN er en kritisk opstrøms inducer af SOX17, og dette synes enkelt vigtigste rolle EOMESODERMIN i hPGCLC induktion fra humane pluripotente stamceller. Vores protokol inducerer SOX17 i hiPSCs10, men dens afhængighed af EOMESODERMINE induktion venter skal fastlægges.

Denne protokol konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs fastholdt i mTeSR1 medium til ERK-uafhængig naive pluripotency for 96 timer i 4i omprogrammering medium6, som er en modificeret naive menneskelige stamceller medium (NHSM)5. Vores forsøg på at generere hPGCLCs begyndende med de samme menneskelige iPSC kloner, men fastholdt i andre kommercielt tilgængelige menneskelige iPSC vækst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterede i varierende grader af lavere hPGCLC udbytter. Selv om langsigtede tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produktion eller ikke forbliver bestemmes i fremtidige undersøgelser, denne bemærkning tyder på, at nøjagtige tilstand af den PRIMES pluripotency af menneskelige iPSCs før 4i omprogrammering betydeligt nedslag EB dannelse i 4i medium og EB differentiering i hPGCLC medium.

Produktion af hPGCLCs fra hiPSCs efter vores protokol er robust og meget reproducerbar, dels på grund af brugen af de microwell plader, der giver effektiv produktionen af et stort antal EBs (~ 8.000 EBs pr. batch) med en ensartet størrelse (3.000 hiPSCs pr. EB). Antallet af EBs let produceret i en enkelt batch af eksperiment ved hjælp af vores protokol kan være langt større end metoder med regelmæssig U-nederste celle kultur brøndene. Produktion af et stort antal lige store EBs ensartet spækket med hPGCLCs kan give unikke muligheder for høj overførselshastighed kemiske screeninger til at identificere små molekylvægt aktivatorer eller påvirker PGC specifikation-hæmmere eller deres biologiske egenskaber såsom epigenetiske omprogrammering. Sådanne EBs kan også være nyttigt for toksikologiske vurderinger af stort antal kønscelleoverførsel celle giftige stoffer, herunder ikke kun miljøforurenende stoffer, men også klinisk ordineret medicin såsom kemoterapeutika.

De kritiske faktorer af robust og reproducerbare produktion af hPGCLCs ved hjælp af præsenteres protokollen omfatter (i) anvendelse af sunde hiPSCs fastholdt i mTeSR1 på ekstracellulære matrix protein, (ii) til podes nøjagtige antal celler som angivet og strengt Følg tider af medium forandring og subkultur, (iii) at vælge en god masse humane rekombinante BMP4, og (iv) at minimere fysiske skader af EBs under den vuggende kultur. Det er vores erfaring, at den bedste masse BMP4 reagens arbejdede ved 100 ng/mL koncentration, mens andre masse BMP4 reagenser kræves 2 X eller større doser. På anden side udbyttet af hPGCLCs produktion ved hjælp af den bedste masse BMP4 snarere faldt ved højere doser af BMP4 (fx 200 ng/mL). Vi anbefaler at teste flere forskellige masser af rekombinant human BMP4 reagenser fra flere leverandører af deres ydeevne ved at støtte hPGCLC generation og sikre en stor mængde af de bedste parti.

En unik feature i vores hPGCLC protokol er at hPGCLCs er lokaliseret på den yderste overflade lag af EBs10 (figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i midten af cellen aggregater6,8. Embryoid organer har tendens til at danne flere adskilte lag som overflade, yderstof, indre shell og kerne, og regionerne central kerne er ofte nekrotisk på grund af begrænsede udbud af næringsstoffer, ilt, samt pro-overlevende vækstfaktorer forudsat form kultur medium af diffusion20. Lokalisering af hPGCLCs på overfladen af EBs uden mulige begrænsninger på grund af begrænset udbredelse mod center EBs kan være gavnligt for direkte, tid - og dosis-kontrollerede eksponering af hPGCLCs stoffer eller giftige stoffer for farmakologiske eller toksikologiske undersøgelser.

Der henviser til, at mus PGCLCs Vis robust genome-wide DNA demetylering involverer prægning styre regioner i det mindste delvis synes7,19,20, graden af globale gDNA demetylering i hPGCLCs svagere end mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på, at hPGCLCs kan ligne en tidligere fase af embryonale PGCs end mus PGCLCs10. Det er blevet rapporteret, at langvarig kultur af EBs under betingelse af hPGCLC produktion forårsaget en øget grad af gDNA demetylering7; men om en længere periode med kultur af hPGCLCs i EBs eller som isolerede celler kan opnå mere fremskredne stadier af kønscelleoverførsel differentiering skal bestemmes ved fremtidige undersøgelser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender Shiomi Yawata og Chie Owa til teknisk bistand under indledende undersøgelser. Denne undersøgelse blev støttet af NIEHS/NIH tilskud R01 ES023316 og R21ES024861 til TS, og stewardesse Medical Research Institute (FAMRI) tilskud til JHH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
  2. Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
  3. De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
  4. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
  5. Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  6. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
  7. von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
  8. Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
  9. Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
  10. Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
  11. Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
  12. Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
  13. Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
  14. Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
  15. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  16. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
  17. Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
  18. Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  19. Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
  20. Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 143 primordiale kønsceller primordiale kønsceller-lignende celler (PGCLCs) inducerede pluripotente stamceller celler PRIMES pluripotency og naive pluripotency embryoid organer
Generation af menneskelige primordiale kønsceller-lignende celler på overfladen af Embryoid organer fra primet pluripotency induceret pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitsunaga, S., Shioda, K.,… More

Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter