Summary
Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são componentes subcelulares recém-descobertas que desempenham importantes funções no biológico muitas funções de sinalização durante Estados fisiológicos e patológicos. O isolamento de EVs continua a ser um grande desafio neste campo, devido às limitações intrínsecas de cada técnica. A ultracentrifugação diferencial com método de centrifugação gradiente de densidade é uma abordagem comumente usada e é considerada o procedimento padrão ouro para isolamento de EV. No entanto, este procedimento é demorado, trabalhoso e geralmente resulta em baixa capacidade de expansão, que pode não ser adequada para amostras de pequeno volume, como o líquido de lavagem broncoalveolar. Demonstramos que um método de isolamento de centrifugação de ultrafiltração é simples e eficiente tempo - e do trabalho ainda fornece uma recuperação de alto rendimento e pureza. Propomos que este método de isolamento pode ser uma abordagem alternativa que é adequada para o isolamento de EV, particularmente para pequenos volumes de espécimes biológicos.
Introduction
Exosomes são o menor subconjunto de EVs, 50 – 200 nm de diâmetro e tem várias funções biológicas através de um diversificado leque de sinalização processos1,2,3,4,5. Eles governam a homeostase celular e tecido principalmente, facilitando a comunicação intercelular através de moléculas de carga como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos6,7,8,9 . Um passo fundamental na pesquisa de EV é o processo de isolamento. Ultracentrifugação diferencial (UC), com ou sem centrifugação gradiente de densidade (DGC), é considerada a padrão-ouro de abordagem, mas esse método carrega maiores limitações, incluindo taxas de recuperação de EV ineficientes e baixa escalabilidade10 , 11 , 12, que restringem a sua melhor utilização para amostras de volume maiores, tais como célula cultura exossomo sobrenadante ou alta produção. As vantagens e desvantagens dos outros métodos, como exclusão de tamanho por ultrafiltração ou cromatografia, immunoaffinity isolamento por grânulos ou colunas e microfluídica, são bem descritas e modernos procedimentos suplementares têm sido desenvolvidos para superar e minimizar as limitações técnicas em cada abordagem11,12,13,14,15. Outros têm mostrado que uma centrifugação de ultrafiltração (UFC), com uma membrana nanoporous na unidade de filtro é uma técnica alternativa que fornece pureza comparável a uma UC método16,17,18. Esta técnica pode ser considerada como um dos métodos alternativos de isolamento.
Líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) contém EVs que possuem inúmeras funções biológicas em várias condições respiratórias de19,20,21,22. Estudando EVs BALF-derivado implica alguns desafios devido a invasão do procedimento de broncoscopia em seres humanos, bem como uma quantidade limitada de recuperação de líquido de lavagem. Em animais de laboratório pequenos tais como ratos, apenas alguns mililitros podem ser recuperados em condições normais de pulmão, muito menos em pulmões inflamados ou fibróticas23. Por conseguinte, coletar uma quantidade suficiente de LBA para isolamento de EV por uma ultracentrifugação diferencial para aplicações a jusante pode não ser viável. No entanto, isolar populações de EV corretas é um fator crucial para o estudo de funções biológicas de EV. O delicado equilíbrio entre eficiência e eficácia continua a ser um desafio bem estabelecidos métodos de isolamento de EV.
Neste estudo atual, podemos demonstrar que uma abordagem de ultrafiltração centrífuga, utilizando uma 100 kDa peso molecular de corte (MWCO) nanomembrane unidade filtrante, é adequada para pequeno volume de amostra biológica como BALF. Esta técnica é simples, eficiente e fornece alta pureza e escalabilidade para apoiar o estudo de EVs BALF-derivado.
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Protocol
A utilização de animais e todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comitês (IACUC) no Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. preparação e coleta de fluido (LBA) murino lavagem broncoalveolar
- Coleção de LBA
- Eutanásia em ratos com um coquetel de cetamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) através da rota intraperitoneal, seguida por deslocamento cervical.
- Inserir uma angiocatheter 22 G na traqueia. Anexar uma seringa de insulina contendo 1 mL (mL) de soro de tampão de fosfato de Dulbecco estéril gelada (DPBS) e instilar 1ml de DBPS em ambos os pulmões através da angiocatheter.
- Retire lentamente o êmbolo da seringa para recuperar BALF e dispense a LBA em um tubo cónico de 50 mL. Manter a LBA no gelo.
- Repita as etapas 1.1.2 e 1.1.3 3 x (4 x no total em cada rato).
Nota: Aproximadamente 0,8 mL geralmente é obtida por mililitro de instilação. Além disso, as seguintes etapas podem ser executadas para ratos individuais (ou seja, 3 mL de LBA), mas pool de amostras múltiplas de BALF irá permitir o isolamento de um lote maior de EVs para consistência em experimentos a jusante.
- Preparação do LBA
- BALF do pool de 25 ratos e divida-o em dois conjuntos iguais (~ 35 mL por alíquota).
- Centrifugue a LBA a 400 x g, a 4 ° C por 5 min, para remover as células e outros restos celulares e recolher o sobrenadante.
- Centrifugue o sobrenadante a 1.500 x g, a 4 ° C por 10 min, para remover detritos de células. Recolher o sobrenadante e avançar para as etapas de isolamento de EV.
2. isolamento de vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino
Nota: Neste estudo, técnicas de isolamento de dois EV, nomeadamente UFC e ultracentrifugação com flutuante usado para isolar EVs do LBA. O protocolo detalhado de cada método é descrito abaixo.
-
Método de enriquecimento ultrafiltração centrifugação (UFC)
Nota: Este método foi modificado de um protocolo descrito anteriormente10.- Filtrar o sobrenadante da etapa 1.2.3 através de um filtro de seringa estéril 0,2 μm e mantenha o filtrado BALF no gelo.
Nota: Este é um passo de exclusão de tamanho no qual apenas vesículas menores que 200 nm são coletados. - Equilibrar a unidade de filtro centrífugo MWCO 100 kDa com DPBS estéril durante 10 min. centrifugar a unidade centrífuga a 1.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C para descartar o DPBS.
Atenção: Uma vez que a membrana do dispositivo de filtro é incubada com DPBS, a membrana deve ser mantida molhada em todo tempo, até que o dispositivo é usado. - Encher a unidade de filtro com 15 mL da amostra BALF passo 2.1.1 e centrifugação a 3.000 x g por 30 min a 4 ° C. O fluxo através do LBA pode ser descartado ou coletado em um tubo canônico separado e armazenado a-80 ° C para uso futuro.
- Repita a etapa 2.1.3 para os restantes 0,2 µm-filtrado BALF.
Nota: Demorou três repetições de centrifugações suficientemente concentrar o SVE BALF do volume inicial original de 35 mL. Isto resultou em 1-1,5 mL de retentate. - Lave o retentate com 14 mL de DPBS estéril pipetando um suavemente repetidamente. Centrifugação a 3.000 x g, a 4 ° C por 30 min, a unidade de filtro para remover o DPBS e concentrar o retentate EV.
- Recolha o concentrado EVs BALF-derivado do dispositivo de filtro inserindo uma pipeta na parte inferior do dispositivo de filtro e retirar a amostra usando um movimento de varredura de lado a lado para garantir a recuperação total.
- Alíquota do EVs BALF-derivado e armazená-los a-80 ° C para quantificação de partículas e caracterização (ver passo 3).
- Filtrar o sobrenadante da etapa 1.2.3 através de um filtro de seringa estéril 0,2 μm e mantenha o filtrado BALF no gelo.
-
Ultracentrifugação (UC) com centrifugação gradiente de densidade flutuante (DGC)
Nota: O seguinte protocolo foi modificado do protocolo descrito anteriormente24.- Transferir o sobrenadante da etapa 2.1.1 em um tubo de 37 mL se e centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 min a 4 ° C, usando-se. Recolha o sobrenadante e centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por 60 min. Enquanto as pelotas EV são centrifugadas, prepare diferentes concentrações de buffers de gradiente de densidade flutuante (tabela 1) para etapa 2.2.3.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de EV em 200 μL de DPBS.
- Misturar a suspensão EV com 300 μL de solução de trabalho de 50% iodixanol (tabela 1) e transferir para o tubo se 15 mL. Em cima da suspensão de mistura de 50% iodixanol-EV, sequencialmente camada de solução-tampão de seguir na ordem de baixo para cima: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% de iodixanol (3ml), 15% iodixanol (2,5 mL) e 5% iodixanol (6 mL). Centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C para 230 min.
Nota: O gradiente de densidade flutuante baseia a porcentagem do iodixanol dimensionamento com a maior concentração (50%) na parte inferior para a menor concentração (5%) na parte superior. Para gerar diferentes concentrações do iodixanol, várias quantidades de meio de homogeneização (tabela 1) foram misturadas com solução de trabalho (50% iodixanol). - Coletar a fração de 15% e 25% e diluí-los em DPBS estéril para que apareça o volume de 15 mL. Transferi-los para um novo tubo pequeno se e centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por 60 min.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de EV em 50 μL de DPBS estéril para caracterização mais.
3. quantificação de vesículas extracelular
Nota: O rendimento de recuperação EVs BALF-derivado é quantificado com duas métricas.
- Nanopartículas, acompanhamento de medição de análise (NTA)
- Diluir a amostra EV em 1: 200 – 1: 500 em 1 mL de DPBS e carga da amostra em uma seringa de insulina. Anexar uma seringa de amostra para uma bomba de seringa e começar a medir os números de partículas e tamanho (ver Tabela de materiais).
- Defina o nível de câmera no 14 e o limite de deteção em 1 para todas as medições de amostra. Cinco medições repetitivas com 1.500 quadros em 30 s foram registrados para cada amostra, com um atraso de 20 s entre leituras. Combinar e média dos dados para relatórios de tamanho e concentração final.
Nota: Para capturar exato de todas as partículas, ajuste o nível de câmera conforme apropriado para visualizar todas as partículas e usar configurações semelhantes para todas as medições de amostra em cada experimento.
- Quantificação da proteína
Nota: O ensaio da proteína bicinchoninic ácido (BCA) foi usado para medir a concentração de proteína de EVs BALF-derivado.- Solubilize as amostras EV em 1 tampão de lise de x.
- Quantificar a quantidade de proteína em EVs BALF-derivado por um protocolo padrão de BCA usando Detecção colorimétrica medindo a absorbância em 560 nm em um leitor de placa.
4. detecção de vesículas extracelulares BALF-derivado
Nota: Exossomo comumente conhecido marcador de superfície proteínas (TSG101, CD63, CD81 e CD9) foram usadas para verificar as recuperações EV por análise de citometria de fluxo e immunoblotting e SDS-PAGE.
- SDS-PAGE e immunoblotting
- Dissolva uma quantidade igual de proteínas EV de cada amostra com uma mancha carregando buffer (Dodecil sulfato de lítio) e 50mm ditiotreitol (DTT) em um tubo de 1,6 mL. Aquece as amostras a 70 ° C por 10 min.
- Carregar as amostras da etapa 4.1.1 em um gel de acrilamida Bis-Tris Plus de 4 – 12% e executar eletroforese (150 volts, 35 mA) por 35 min.
- Transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, usando um método de transferência secos.
- Bloquear a membrana com leite desnatado de 5% para 60 min, balançando à temperatura ambiente (RT).
- Incube a membrana com um anticorpo de um marcador de proteína de superfície de EV, Tumor susceptibilidade genética 101 (TSG101), a diluição de 1: 500 em BSA 5% em solução tampão salino Tween-20 (TBST) a 4 ° C, durante a noite de balanço.
- No dia seguinte, lave a membrana 3 x, 10 min cada um lavar, buffer de TBST e incube-lo com anti-coelho IgG, um anticorpo HRP-lig, a diluição de 1:5,000 por 60 min em RT
- Lavar a membrana 3 x, 10 min a cada lavagem, no buffer TBST. Desenvolva a membrana com quimioluminescente reagente HRP anticorpo de detecção e imagem (consulte a Tabela de materiais para sistema de imagem).
- Citometria de fluxo
- Dilua BALF-derivado EVs em 49 μL de tampão (PBS + 5 mM EDTA + 0.5% BSA, filtrada através de uma membrana de filtro de seringa 0.1 μm) a coloração de crack.
- Adicionar cada um dos seguintes anticorpos em cada amostra individual: 1) Anticorpo de PE CD63 rato anti-rato (100 ng por reação); 2) anti-rato rato PE CD81 (500 ng); 3) anti-rato rato FITC CD9 (200 ng). Incube a 4 ° C, balançando para 60 min no escuro.
- Diluir as amostras com 450 μL de filtro de membrana de crack coloração reserva e submeter as amostras para análise de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais)25.
- Ajustar as configurações de citômetro de fluxo como segue: 1) conjunto de todos os canais no hiper log (hlog); 2) definir o gatilho no SSC em 4; 3) desliga o segundo gatilho. Executar as amostras em uma configuração de baixa velocidade e adquirir pelo menos 10.000 eventos em cada amostra.
- Realizar análise de dados de baixa citometria em cada amostra utilizando o software de análise (ver Tabela de materiais).
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Representative Results
Realizamos EV isolamento do mouse BALF usando métodos de isolamento de UFC e UC-DGC no mesmo dia. O método UFC necessário aproximadamente 2,5 – 3 h, Considerando que a técnica de UC-DGC necessários 8 h de tempo de processamento. Isto não incluíam buffers e tempo de preparação do reagente. Note-se que algumas outras tarefas podem ser realizadas durante os períodos de tempo de centrifugação. No entanto, todo o procedimento durou quase um dia inteiro para a técnica de isolamento de UC-DGC.
EVs BALF-derivado de ratos normais, isolados pelo método UFC exibido um tamanho menor e uma distribuição mais uniforme tamanho (148.8 ± 1.1 nM, figura 1A), comparado a UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, figura 1B). A técnica do UFC teve um profundo 65-fold partícula total maior conta quando comparado ao isolamento UC-DGC (29,4 ± 18,4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 partículas; p < 0,05; Tabela 2 e Figura 1). A recuperação de proteínas totais (em µ g) de UFC EVs também foi maior (3.136 ± 1.860 vs 73,7 ± 38,3 µ g; p < 0,05; Tabela 2 e Figura 1). Assim, UFC é tempo e esforço-eficiente e proporciona um maior rendimento de EV.
Caracterizar mais fenotipicamente EV BALF-derivado das populações, examinamos a presença de marcadores de superfície proteína exossomo comumente conhecidos: CD63, CD9 e CD81 por citometria de fluxo e TSG101 pelo immunoblotting. Usando análise de citometria de fluxo, demonstrámos que o UFC EVs e o UC-DGC EVs expressaram CD63 (Figura 2A -2C), CD9 (Figura 2D -2F) e CD81 (Figura 2 -2I). A expressão da média geométrica (iniciativa) de CD63 CD9 e CD81 foi quantificada e não estatisticamente diferentes entre as duas condições (Figura 3A -3F).
Em seguida, examinamos outra EV proteína, TSG101, pelo immunoblotting. Nós mostramos que a 20 µ g da amostra do UFC escoamento (UFC-FT) não continha proteínas TSG101, sugerindo que a técnica de isolamento do UFC eficientemente selecionado e manteve a população de EV da amostra BALF (Figura 4). Quando quantidades iguais de proteínas totais (20 µ g) da amostra BALF-EV foi carregado, achamos que o UFC EVs expressa um nível superior de TSG101 UC-DGC EVs (Figura 4). Também mostramos que a pureza da proteína UFC-EV era aceitável, demonstrada por uma banda única proteína isolada.
Para todos os resultados, t do estudante-teste foi utilizado para comparação de dois grupos. Os resultados são apresentados como média ± SEM (erro padrão da média), e p < 0,05 foi considerado significativo.
Figura 1: centrifugação de ultrafiltração de líquido de lavagem broncoalveolar murino (LBA)-EVs derivadas demonstraram uma distribuição de tamanho mais homogénea do que ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade de murino BALF-derivado EVs e tinha um significativamente mais elevado conteúdo de contagem e proteína total partícula. A distribuição de tamanhos de partículas de EV foi medida por nanopartículas acompanhamento análise (NTA), e o conteúdo de proteína total foi medido pelo ensaio de ácido bicinchoninic. Gráfico de distribuição dos (A) UFC-BALF EVs NTA tamanho. Gráfico de distribuição de tamanho dos EVs de UC-DGC-LBA (B). (C) contagem de partículas Total por NTA (quer dizer SEM ± x 1010 partículas; * p < 0,05). (D) teor de proteínas totais (em µ g, * p < 0,05). Os dados foram derivados de três experimentos independentes. UFC: centrifugação ultrafiltração; UC-DGC: ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade; SVE: vesículas extracelulares; SD: desvio-padrão; Conc: concentração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: lavagem broncoalveolar murino líquido derivado de EVs isolados por centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com métodos de centrifugação gradiente de densidade expressa tetraspaninas proteínas CD63, CD9 e CD81. Mostrados são percentagens de EVs manchadas positivas com os UFC e UC-DCG técnicas de isolamento, ilustradas por parcelas pseudocolorida, por (A - C) PE-CD63, (D - F) (G - eu) e FITC-CD9 CD9-PE. Os dados são derivados de três experimentos independentes. UFC = centrifugação de ultrafiltração; UC-DGC = ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade; EVs = vesículas extracelulares; SSC-A = análise de dispersão de lado; PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ultrafiltração isolada de centrifugação murino broncoalveolar líquido derivado de EVs expressa uma densidade semelhante fluorescente de proteínas tetraspaninas de isolados de ultracentrifugação EVs. (A e D) Histograma e média geométrica expressão (iniciativa) de PE-CD63+-manchado EVs. (B e E) histograma e iniciativa de FITC-CD9+-manchado EVs. (C e F) histograma e iniciativa de PE-CD81+-manchado EVs. Estes dados são derivados de três experimentos independentes. UFC: centrifugação ultrafiltração; UC-DGC = ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade; SVE: vesículas extracelulares; SSC-r: análise de dispersão de lado; PE: ficoeritrina; FITC: isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: lavagem broncoalveolar murino líquido derivado de EVs isolados por centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com métodos de centrifugação gradiente de densidade expressa a proteína de superfície exossomo, TSG101. Este painel mostra o immunoblotting de murino EVs BALF-derivado para o anticorpo TSG101 (47 kDa). UFC = centrifugação de ultrafiltração; UC-DGC = ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade; EVs = vesículas extracelulares; FT = escoamento; TSG = gene de susceptibilidade do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Trabalho solução Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Solução de trabalho (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Meio de homogeneização (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabela 1: buffers de gradiente de densidade flutuante. Esta tabela dá a proporção de composição e buffer de cada solução gradiente que foi usada para purificar a populações de derivado de fluido extracelular vesículas de lavagem broncoalveolar murino isoladas pela técnica de ultracentrifugação. A solução que trabalho era 50% iodixanol (25 mL de meio de gradiente de densidade [ver Tabela de materiais] + 5 mL de solução diluente [pH 7,4 de 0,25 M de sacarose + 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl]). * * Médio homogeneização (pH 7,4 de 0,25 M de sacarose + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)
| Métodos de | Começando o Volume (mL) | NTA* (x 108/μL) | Total de partículas† (x1010) | Proteína Conc‡ (µ g / µ l) | Proteínas totais§ (µ g) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2,6 | 29,4 ± 18,4 | 3.7 | 3.136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0,5 ± 0,1 | 0.6 | 73.7 ± 38,3 |
Tabela 2: O método de isolamento de centrifugação de ultrafiltração fornecido um rendimento de derivados de fluido extracelular vesículas de lavagem broncoalveolar murino alta. A concentração de partículas e a contagem total de partículas foram medidos por nanopartículas acompanhamento análise (NTA). A concentração de proteínas e a quantidade total de proteína foram medidos por um ensaio de proteína ácido bicinchoninic. * Concentração de partículas dos BALF EVs (média ± SEM x 108/μL de três experimentos independentes). † Partícula de total dos BALF EVs (média ± SEM x 1010 partículas de três experimentos independentes). ‡ Concentração de proteína dos BALF EVs (média ± SEM µ g / µ l de três experimentos independentes). § Proteínas totais dos BALF EVs (média ± SEM mg de três experimentos independentes).
UFC: centrifugação ultrafiltração; UC-DGC: ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade; Conc: concentração; NTA: nanopartículas rastreamento de análise; SEM: erro padrão da média.
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Discussion
Nas últimas décadas, os cientistas têm desvendados os significados de EVs na homeostase celular. Mais importante, EVs jogar papéis importantes em muitos processos de doença, modulando as células vizinhas e distantes a sua carga bioativos moléculas1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. futuro desenvolvimento e avanço neste campo profundamente dependem de confiança e eficientes métodos que não só identificam e separam corrigir subconjuntos das populações de EV, mas também preservar suas funções biológicas para aplicações a jusante 10 , 11 , 14 , 31. no estudo atual, nós descrevemos um método de centrifugação (UFC) de ultrafiltração nanomembrane para isolar EVs do rato BALF. Em concordância com outros relatórios, mostramos que UFC é simples e resulta em uma recuperação de alto rendimento e pureza e, portanto, é adequado para pequenas amostras biológicas10,17,18,32 .
UC-DGC é comumente usado e é considerada a técnica padrão-ouro para isolamento de EV porque ele fornece altamente purificada EV partículas10,14. No entanto, esse método é tecnicamente complicado, demorado, trabalhoso e tem baixa escalabilidade. As técnicas baseadas em microfluídica recém-desenvolvido superar essas limitações, mas essa abordagem requer mais validação antes de ele pode ser totalmente implementado como um método alternativo de33,34. Assim, métodos adequados que acomodar essas dificuldades sem comprometer a pureza e a escalabilidade das amostras são fisioterapia, particularmente para o pequeno volume de fluido biológico.
Demonstrámos que UFC usando um dispositivo de filtro de nanomembrane foi eficaz para o isolamento de EV de espécimes BALF. Os resultados apresentados aqui destacam a superioridade do procedimento UFC em comparação com o padrão de ouro método UC-DGC devido à sua simplicidade e maior escalabilidade. A abordagem baseada em ultrafiltração tem tornar-se amplamente adotada para isolar EV de uma variedade de espécimes biológicos: urina35, célula-condicionado mídia17e soro fetal bovino36. A outra modular baseado em tamanho EV isolamento técnica que usa a ultrafiltração como uma plataforma é exossomo total isolamento microplaqueta (exóticas)31. Este método é também adequado para amostras de tamanho de amostra pequenas. Alguns fatores, tais como material filtrante e o tamanho dos poros da nanomembranes, devem ser considerados ao usar a técnica do UFC, porque eles podem afectar as propriedades de EVs recuperados. Por exemplo, diferentes tipos de membranas de filtro resultaram em rendimentos de recuperação diferentes RNA EV-associado de urina18. Neste estudo, mostramos que a celulose regenerada (RC) com um 10 kDa MWCO desde a mais alta expressão do mRNA da NOP10, OST4, SNRPG, e TOMM7 comparado a kDa 10 Hydrosart, ou polietersulfona (PES) de 10 kDa18. Mais demonstrámos que o RC com kDa 10 teve uma recuperação de EV retentate maior do que o 100 kDa. Outros têm caracterizado o conteúdo de carga de EVs de urina que foram afetado pelo tipo de isolamento técnicas37. Nosso estudo mostrou que a membrana de MWCO RC 100-kDa forneceu um rendimento satisfatório de EV BALF-derivado com a vantagem de proteínas muito menos indesejadas no retentate devido a maior MWCO.
Este estudo demonstrou que o tamanho e a distribuição de tamanho de EVs UFC eram menores e mais homogeneamente distribuída do que aqueles de UC-DGC EVs. Agregação de vesículas, que é comum com técnicas UC, pode explicar a heterogeneidade de dimensão de UC-DGC EVs38. Avaliamos a pureza BALF-derivado EV detectando as proteínas de membrana de EV TSG101, CD63, CD9 e CD81, que confirma a presença de exosomes na retentates. Nós e os outros também têm utilizado TEM para demonstrar a morfologia do UFC EVs35,39,40,41. Liu et al usou uma abordagem similar de ultrafiltração para isolar EVs e, quando comparado ao SVE isolado por ultracentrifugação, os perfis de proteómica e transcriptomic eram semelhantes31. Assim, descrevemos um método de centrifugação de ultrafiltração usando uma membrana de celulose regenerada com um MWCO de 100 kDa como um método alternativo de isolamento EV que é adequado para pequenas amostras de fluidos biológicas como o líquido de lavagem broncoalveolar.
Os passos críticos usando esta abordagem UFC para isolar EVs de fluidos biológicos incluem filtragem inicial nanoporous membrana 0,2 µm para garantir que as partículas enriquecidas são na faixa de tamanho de exosomal e evitar a aplicação de força adicional que pode danificar ou deformar o exossomo morfologia e estruturas10,42. SVE pode aderir à membrana de filtração, que resulta em baixa escalabilidade. Portanto, o volume da amostra não deve exceder a quantidade recomendada em cada tipo de unidade de filtro. Nós escolhemos usar celulose regenerada, o que proporcionou um maior rendimento de mRNA de urina-derivado de EVs18. O tipo de membranas de filtro usado pode alterar o rendimento de recuperação e o tipo de EVs. Por último, mesmo que um MWCO de 100 kDa deve eliminar a maioria das proteínas em fluidos biológicos, alguns contaminantes de proteína que eram maiores que 100 kDa ou proteína agregados observaram-43. Neste caso, uma etapa de lavagem é fundamental para minimizar a agregação de EV e proteína. Além disso, estudos funcionais devem ser devidamente controlados para interpretar totalmente os resultados, como proteínas não-EV-associados estarão presentes em UFC EVs.
Podemos concluir que o UFC é uma abordagem alternativa é viável para isolamento de EV para amostras pequenas - ou -volume maior. As unidades disponíveis atualmente microfiltro podem acomodar até 15 mL de amostras.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O trabalho é suportado por subvenções NHLBI/NIH HL103868 (para PC) e HL137076 (para PC), o americano coração Associação Brasileira (para PC) e o prêmio de pesquisa de câncer de pulmão Samuel Oschin abrangente Cancer Institute (SOCCI) (para PC). Gostaríamos de expressar nosso grande apreço ao Instituto do coração Smidt no Cedars-Sinai Medical Center que fornece-em uma máquina de Nanosight para análise de rastreamento de nanopartículas de EV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
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