Summary
Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EVs) son recién descubiertos componentes subcelulares que desempeñan papeles importantes en muchos biológico funciones de señalización durante los Estados fisiológicos y patológicos. El aislamiento de los vehículos eléctricos continúa siendo un desafío importante en este campo, debido a las limitaciones intrínsecas a cada técnica. La ultracentrifugación diferencial con el método de centrifugación del gradiente de densidad es un enfoque utilizado y se considera que el procedimiento estándar de oro para el aislamiento de EV. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo, mano de obra intensiva y generalmente resulta en baja escalabilidad, que puede no ser adecuado para muestras de pequeño volumen como el lavado broncoalveolar. Demostramos que un método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración es simple y tiempo y mano de obra eficiente todavía proporciona un rendimiento de alta recuperación y pureza. Proponemos que este método de aislamiento podría ser una alternativa adecuada para el aislamiento de EV, particularmente para pequeño volumen de especímenes biológicos.
Introduction
Exosomas son el subconjunto más pequeño de los vehículos eléctricos, 50-200 nm de diámetro y tienen múltiples funciones biológicas a través de una amplia gama de señalización de procesos1,2,3,4,5. Gobiernan la homeostasis celular y el tejido sobre todo facilitando la comunicación intercelular a través de moléculas de carga tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos6,7,8,9 . Un paso crítico en la investigación EV es el proceso de aislamiento. Ultracentrifugación diferencial (UC), con o sin centrifugación de gradiente de densidad (DGC), se considera el enfoque de patrón oro, pero este método tiene limitaciones importantes, incluidos los porcentajes de recuperación de EV ineficientes y escalabilidad baja10 , 11 , 12, restringir su mejor utilización para muestras de volumen más grandes, tales como muestras de la célula cultura exosomas sobrenadante o alta producción. Las ventajas y desventajas de otros métodos, como la exclusión del tamaño por ultrafiltración o cromatografía de inmunoafinidad aislamiento por granos o columnas y microfluídica, están bien descritas, y se han desarrollado modernos procedimientos suplementarios para superar y minimizar limitaciones técnicas en cada enfoque11,12,13,14,15. Otros han demostrado que una centrifugación ultrafiltración (UFC) con una membrana nanoporosa en la unidad de filtración es una técnica alternativa que proporciona pureza comparable a una UC método16,17,18. Esta técnica podría considerarse como uno de los métodos de aislamiento alternativos.
Lavado broncoalveolar (BALF) contiene EVs que poseen numerosas funciones biológicas en diferentes afecciones respiratorias19,20,21,22. Estudio de EVs BALF derivados conlleva algunos problemas debido a la invasividad del procedimiento de broncoscopia en los seres humanos, así como una cantidad limitada de recuperación de líquido de lavado. En animales de laboratorio pequeños tales como ratones, sólo unos pocos mililitros pueden recuperarse en afecciones pulmonares normales, mucho menos en los pulmones inflamados o fibrótica23. Por lo tanto, recoger una cantidad suficiente de BALF para aislamiento de EV por una ultracentrifugación diferencial para aplicaciones posteriores puede no ser factible. Sin embargo, aislando poblaciones EV correcto es un factor crucial para el estudio de las funciones biológicas de la EV. El delicado equilibrio entre la eficiencia y eficacia continúa siendo un desafío en métodos de aislamiento de EV bien establecidos.
En este estudio, demostramos que un enfoque de ultrafiltración centrífugo, utilizando una unidad de filtro del 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte nanomembrane, es conveniente para pequeño volumen de muestra biológica como BALF. Esta técnica es simple, eficaz y proporciona escalabilidad para apoyar el estudio de los vehículos eléctricos derivados de BALF y alta pureza.
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Protocol
La utilización de animales y animales todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités del uso (IACUC) en el centro médico Cedars-Sinai (CSMC).
1. preparación y murino el lavado broncoalveolar (BALF) de líquido colección
- Colección de BALF
- Eutanasia a ratones con un cóctel de ketamina (300 mg/kg) y xilacina (30 mg/kg) vía intraperitoneal seguido por dislocación cervical.
- Inserte un angiocatéter de 22 G en la tráquea. Conecte una jeringa de insulina 1 ml (mL) de fosfato buffer salino de helado Dulbecco estéril (DPBS) e infundir 1 mL de SPD en ambos pulmones a través del angiocatéter.
- Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar BALF y dispensar el BALF en un tubo cónico de 50 mL. Mantenga el BALF en hielo.
- Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 3 x (4 en total en cada ratón).
Nota: Aproximadamente 0,8 mL es obtenido generalmente por mililitro de la instilación. También, pueden realizar los siguientes pasos para ratones individuales (es decir, 3 mL de BALF) y agrupación de múltiples muestras BALF permitirá el aislamiento de un lote mayor de EVs para la consistencia en experimentos posteriores.
- Preparación de BALF
- BALF de la piscina de 25 ratones y dividirla en dos grupos iguales (~ 35 mL por alícuota).
- Centrifugue el BALF x 400 g, a 4 ° C por 5 min, para eliminar las células y otros desechos celulares y recoger el sobrenadante.
- Centrifugar el sobrenadante a 1.500 xg a 4 ° C durante 10 min, para eliminar restos celulares. Recoger el sobrenadante y proceder a las medidas de aislamiento de EV.
2. aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino
Nota: En este estudio, EV dos técnicas de aislamiento, es decir, UFC y ultracentrifugación con boyante utilizan para aislar EVs de BALF. El protocolo detallado de cada método se describe a continuación.
-
Método de enriquecimiento de centrifugado (UFC) de ultrafiltración
Nota: Este método fue modificado del protocolo descrito anteriormente10.- Filtrar el sobrenadante del paso 1.2.3 a través de un filtro de jeringa estéril 0,2 μm y mantener el filtrado BALF en hielo.
Nota: Este es un paso de la exclusión de tamaño por el que sólo vesículas más pequeñas de 200 nm se recogen. - Equilibrar la unidad de filtro centrífugo de 100 kDa MWCO con DPBS estéril durante 10 minutos, centrifugar la unidad centrífuga a 1.500 x g por 10 min a 4 ° C para descartar la DPBS.
PRECAUCIÓN: Una vez que la membrana en el dispositivo de filtro es equilibrada con DPBS, la membrana debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que el dispositivo se utiliza. - Llenar el filtro con 15 mL de muestra de BALF de paso 2.1.1 y centrifugar a 3.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Flujo BALF puede desechado o recogido en un separado tubo canónico y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.
- Repita el paso 2.1.3 para el restante 0,2 μm filtrado BALF.
Nota: Tuvo tres repeticiones de centrifugados para concentrar suficientemente la EVs BALF del volumen original a partir de 35 mL. Esto dio lugar a 1 – 1,5 mL de retenido. - Lave el retenido con 14 mL de DPBS estéril transfiriendo un suavemente repetidamente. Centrifugue la unidad filtrante a 3.000 x g, a 4 ° C por 30 min, para eliminar la DPBS y concentrar el retentate EV.
- Recoger el servicio voluntario europeo derivado de BALF concentrado desde el dispositivo de filtro por insertar una pipeta en la parte inferior del dispositivo de filtro y retirar la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado para asegurar la recuperación total.
- Alícuota del SVE derivados de BALF y almacenarlas a-80 ° C por más partículas cuantificación y caracterización (ver paso 3).
- Filtrar el sobrenadante del paso 1.2.3 a través de un filtro de jeringa estéril 0,2 μm y mantener el filtrado BALF en hielo.
-
Ultracentrifugación (UC) con centrifugación de gradiente de densidad boyante (DGC)
Nota: El siguiente protocolo fue modificado del protocolo descrito previamente24.- Transfiera el sobrenadante del paso 2.1.1 en un tubo de ultracentrífuga 37 mL y centrifugar la muestra a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C utilizando la ultracentrífuga. Recoger el sobrenadante y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos. Mientras que las pelotillas de EV se centrifugaron, se preparan diferentes concentraciones de búferes de gradiente de densidad boyante (tabla 1) para paso 2.2.3.
- Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 200 μL de DPBS.
- Mezclar la suspensión de la EV con 300 μL de solución de trabajo de 50% iodixanol (tabla 1) y transferir al tubo de ultracentrífuga de 15 mL. Sobre la suspensión de mezcla de 50% EV iodixanol, secuencialmente la siguiente solución tampón en la orden de la parte inferior de la parte superior de la capa: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% de iodixanol (3 mL), iodixanol (2,5 mL) de 15% y 5% iodixanol (6 mL). Centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por min 230.
Nota: El gradiente de densidad boyante se basa en el porcentaje de iodixanol escalar con la mayor concentración (50%) en la parte inferior a la menor concentración (5%) en la parte superior. Para generar diferentes concentraciones de iodixanol, varias cantidades de medio de homogeneización (tabla 1) se mezclaron con solución de trabajo (50% iodixanol). - Recoger la fracción del 15% y 25% y diluir en DPBS estéril para subir el volumen a 15 mL. Transferirlos a un nuevo tubo de ultracentrífuga pequeño y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos.
- Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 50 μL de DPBS estéril para mayor caracterización.
3. cuantificación de vesícula extracelular
Nota: El rendimiento de recuperación derivados de BALF EVs es cuantificado con dos métricas.
- Nanopartícula seguimiento medición análisis (NTA)
- Diluir la muestra de EV a 1: 200, 1: 500 en 1 mL de DPBS y carga la muestra en una jeringa de insulina. Conecte una jeringa de muestra a una bomba de jeringa y comience a medir el número de partículas y el tamaño (véase Tabla de materiales).
- Establecer el nivel de la cámara en el 14 y el umbral de detección en 1 para todas las mediciones de la muestra. Cinco mediciones repetitivas con 1.500 fotogramas de 30 s se registraron para cada muestra, con un retraso de 20 s entre lecturas. Combinar y promedio de los datos de concentración final y tamaño informes.
Nota: Para la captura precisa de todas las partículas, ajustar el nivel de la cámara como apropiado para visualizar todas las partículas y use similares para todas las mediciones de la muestra en cada experimento.
- Cuantificación de proteína
Nota: Ensayo de proteína (BCA) ácido bicinchoninic fue utilizado para medir la concentración de proteína de la EVs derivados de BALF.- Solubilizar las muestras EV en tampón de lisis de x 1.
- Cuantificar la cantidad de proteína en la EVs BALF derivado según el protocolo estándar BCA con detección colorimétrica midiendo la absorbancia a 560 nm en un lector de placas.
4. detección de vesículas extracelulares derivadas de BALF
Nota: Exosomas comúnmente conocido marcador superficial proteínas (TSG101, CD63, CD81, CD9) fueron utilizadas para verificar EV recuperaciones por SDS-PAGE y el immunoblotting y el flujo cytometry análisis.
- SDS-PAGE e immunoblotting
- Disolver una cantidad igual de proteínas de EV de cada muestra con una carga de buffer (dodecil sulfato de litio) y 50 mM Ditiotreitol (DTT) en un tubo de 1,6 mL de borrar. Calentar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos.
- Cargar las muestras en el paso 4.1.1 en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus 4 – 12% y ejecutar electroforesis (150 voltios, 35 mA) durante 35 minutos.
- Transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa, usando un método de transferencia en seco.
- Bloquear la membrana con 5% leche desnatada durante 60 min, oscilación en la temperatura ambiente (RT).
- Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína de la superficie de EV, Tumor susceptibilidad genética 101 (TSG101) a dilución 1: 500 en 5% de BSA en Tris-buffer salina Tween-20 (TBST) a 4 ° C, oscilando durante la noche.
- Al día siguiente, lavar la membrana 3 x 10 min cada uno Lave, en buffer TBST e incubar con anti-conejo IgG, un anticuerpo ligados por la HRP, en dilución de 1:5,000 durante 60 min a TA.
- Lavar la membrana 3 x 10 minutos cada lavado, en buffer TBST. Desarrollo de la membrana con quimioluminiscencia reactivo de detección de anticuerpos HRP y la imagen (véase Tabla de materiales para sistema de imagen).
- Citometría de flujo
- Diluir el EVs derivados de BALF en 49 μL de buffer (PBS + EDTA 5 mM + 0,5% BSA, filtrada a través de una membrana de filtro de jeringa de 0.1 μm) la coloración de la Junta.
- Añadir a cada uno de los siguientes anticuerpos en cada muestra individual: 1) anticuerpo de rata anti-ratón CD63 PE (100 ng por reacción); 2) anti-mouse rata PE CD81 (500 ng); 3) anti-mouse rata CD9 FITC (200 ng). Incubar a 4 ° C, oscilación de 60 minutos en la oscuridad.
- Diluir las muestras con 450 μL de filtrado de membrana PEB tampón de tinción y someter las muestras a análisis de citometría de flujo (véase Tabla de materiales)25.
- Ajustar la configuración de citómetro de flujo de la siguiente manera: 1) activado todos los canales de registro hyper (hlog); 2) Coloque el gatillo en SSC en 4; 3) Apague el gatillo secundario. Ejecutar los ejemplos en un entorno de baja velocidad y adquirir por lo menos 10.000 eventos en cada muestra.
- Realizar citometría bajo análisis de los datos en cada muestra utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales).
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Representative Results
Realizamos aislamiento de EV de ratón BALF utilizando métodos de aislamiento de UFC y UC-DGC en el mismo día. El método UFC requiere aproximadamente 2.5-3 h, mientras que la técnica de la UC-DGC requiere 8 horas de tiempo de procesamiento. Esto no incluye los amortiguadores y los reactivo tiempo de preparación. Cabe señalar que algunas de las tareas pueden realizarse en los períodos de tiempo de centrifugación. Sin embargo, todo el procedimiento duró casi un día entero para la técnica de aislamiento de UC-DGC.
EVs BALF derivadas de ratones normales aislados por el método UFC muestran un tamaño más pequeño y una distribución más uniforme de tamaño (148.8 ± 1.1 nM, figura 1A) en comparación con el UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, figura 1B). La técnica UFC tuvo un profundo 65-fold partícula total mayor cuenta en comparación con el aislamiento de la UC-DGC (29,4 ± 18.4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 partículas; p < 0.05; Tabla 2 y figura 1). La recuperación de proteína total (en μg) de los vehículos eléctricos de la UFC fue mayor (3.136 ± 1.860 vs 73,7 ± 38.3 μg; p < 0.05; Tabla 2 y figura 1). Así, UFC es tiempo y esfuerzo eficiente y proporciona un mayor rendimiento de EV.
Para caracterizar fenotípicamente las poblaciones derivadas de BALF EV, se examinó la presencia de marcadores de proteínas de superficie de exosomas conocida: CD63, CD9 y CD81 por citometría de flujo y TSG101 immunoblotting. Usando análisis de citometría de flujo, demostramos que UFC EVs y UC-DGC EVs expresaran CD63 (figura 2A -2 C), CD9 (Figura 2D -2F) y CD81 (figura 2 -2I). La expresión de la media geométrica (gMFI) de CD63, CD9 y CD81 fue cuantificada y no estadísticamente diferentes entre las dos condiciones (Figura 3A -3F).
A continuación, examinamos otro EV proteína marcador, TSG101, immunoblotting. Demostró que los 20 μg de la muestra de UFC a través de flujo (UFC-FT) no contenían proteínas TSG101, sugiriendo que la técnica de aislamiento de UFC eficientemente seleccionado y había conservado la población de EV de la muestra BALF (figura 4). Cuando igual cantidad de proteína total (20 μg) de la muestra de BALF-EV fue cargado, nos encontramos con que UFC EVs expresa un mayor nivel de TSG101 que UC-DGC EVs (figura 4). También demostramos que la pureza de la proteína de la UFC-EV fue aceptable, demostrado por una banda de solo proteína aislada.
Para todos los resultados, de Student t-test se utilizó para la comparación de dos grupos. Los resultados se presentan como media ± SEM (error estándar de la media), y p < 0.05 se consideró significativo.
Figura 1: centrifugación ultrafiltración de murino de lavado broncoalveolar (BALF)-EVs derivadas demostraron una más homogénea distribución de tamaño de ultracentrifugación con la centrifugación de gradiente de densidad de murinos derivados de BALF EVs y tenía un significativamente mayor partícula total recuento y proteína contenido. La distribución de tamaños de partícula de EV se midió por nanopartículas seguimiento análisis (NTA) y el contenido de proteínas totales fue medido por el ensayo ácido bicinchoninic. Gráfico de distribución de tamaño NTA de EVs de la UFC-BALF (A). Gráfico de distribución de tamaño de EVs de la UC-DGC-BALF (B). Recuento de partículas totales (C) por NTA (media ± SEM x 1010 partículas; * p < 0.05). (D) contenido de proteína Total (en μg, * p < 0.05). Los datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC: ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; EVs: vesículas extracelulares; SD: desviación; Conc: concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: lavado broncoalveolar murinas derivadas líquido EVs aislados por centrifugación ultrafiltración y ultracentrifugación con métodos de centrifugación del gradiente de densidad expresa proteínas tetraspanina CD63, CD9 y CD81. Demostrado son porcentajes de EVs mancharon el positivos por las técnicas de aislamiento de UFC y UC-DCG, ilustradas por parcelas de pseudocolor, para (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 yG - PE-CD9. Los datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC = centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; SVE = vesículas extracelulares; SSC-A = lado análisis de dispersión; PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: el lavado broncoalveolar murino aislado por centrifugación ultrafiltración líquido derivado de EVs expresó una similar densidad fluorescente de tetraspanina proteínas aisladas de ultracentrifugación EVs. (A y D) Expresión (gMFI) del histograma y la media geométrica de PE-CD63+-manchado EVs. (B y E) histograma y gMFI de FITC-CD9+-manchado EVs. (C y F) histograma y gMFI de PE-CD81+-manchado EVs. Estos datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; EVs: vesículas extracelulares; SSC-A: Análisis de dispersión de lado; PE: ficoeritrina; FITC: isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: lavado broncoalveolar murinas derivadas líquido EVs aislados por centrifugación ultrafiltración y ultracentrifugación con métodos de centrifugación del gradiente de densidad expresa la proteína de la superficie de los exosomas, TSG101. Este panel muestra el immunoblotting de murinos derivados de BALF EVs para el anticuerpo TSG101 (47 kDa). UFC = centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; SVE = vesículas extracelulares; FT = flujo a través; TSG = gen de susceptibilidad tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Iodixanol solución de trabajo (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Solución de trabajo (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Medio de homogeneización (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabla 1: buffers gradiente densidad boyante. Esta tabla muestra la relación entre composición y buffer de cada solución de gradiente que se utiliza para purificar poblaciones de vesícula extracelular líquido derivado de lavado broncoalveolar murino aisladas por la técnica de ultracentrifugación. * La solución de trabajo fue 50% iodixanol (25 mL de medio de gradiente de densidad [véase Tabla de materiales] + 5 mL de solución diluyente [pH 7.4 de sacarosa de 0,25 M + 120 mM HEPES + 0,9 M de NaCl]). ** Medio de homogeneización (pH 7.4 de sacarosa de 0,25 M + 20 mM HEPES, 150 mM NaCl)
| Métodos | A partir de volumen (mL) | NTA* (x 10 de8de /μL) | Total partículas† (x1010) | Proteína Conc‡ (μg/μl) | Proteínas totales§ (μg) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29,4 ± 18,4 | 3.7 | 3.136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0,5 ± 0,1 | 0.6 | 73,7 ± 38.3 |
Tabla 2: el método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración proporciona un rendimiento de derivados del líquido extracelular vesícula lavado broncoalveolar murino alta. La concentración de partículas y recuento de partículas totales se midieron por nanopartículas seguimiento análisis (NTA). La concentración de la proteína y la cantidad total de proteína se midieron por un análisis de proteína ácido bicinchoninic. * Concentración de partículas de BALF EVs (media ± SEM x 108/μL de tres experimentos independientes). † Partículas total de BALF EVs (media ± SEM x 1010 partículas de tres experimentos independientes). ‡ Concentración de la proteína de BALF EVs (media ± SEM μg/μl de tres experimentos independientes). § Proteína total de BALF EVs (media ± SEM mg de tres experimentos independientes).
UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC: ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; Conc: concentración; NTA: nanopartículas seguimiento análisis; SEM: error estándar de la media.
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Discussion
En las últimas décadas, los científicos han desentrañando los significados de EVs en la homeostasis celular. Más importante aún, EVs desempeñan un papel importante en muchos procesos de la enfermedad mediante la modulación de las células vecinas y distantes a través de sus bioactivos carga moléculas1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. futuro desarrollo y progreso en este campo confían profundamente en confiable y métodos eficaces que no sólo identifican y separaran subconjuntos de poblaciones EV de corregir pero también preservan sus funciones biológicas para aplicaciones posteriores 10 , 11 , 14 , 31. en el presente estudio, describimos un método de centrifugación (UFC) de ultrafiltración nanomembrane para aislar EVs de ratón BALF. En concordancia con otros informes, nos demostró que UFC es simple y resulta en un rendimiento de alta recuperación y pureza y, por lo tanto, es adecuado para muestras biológicas pequeñas10,17,18,32 .
UC-DGC es muy frecuente y es considerado la técnica gold estándar para el aislamiento de EV porque proporciona altamente purificada EV partículas10,14. Sin embargo, este método es técnicamente complicado, desperdiciador de tiempo, mano de obra intensiva y tiene baja escalabilidad. Las técnicas basadas en microfluídica desarrolladas recientemente superar estas limitaciones, pero este enfoque requiere mayor validación antes de que puede ser completamente implementado como un método alternativo de33,34. Así, los métodos adecuados que acomodar esas dificultades sin comprometer la pureza y la escalabilidad de las muestras se necesitan urgentemente, particularmente para pequeño volumen de líquido biológico.
Hemos demostrado que UFC utilizando un dispositivo de filtro nanomembrane era eficaz para el aislamiento de la EV de los especímenes BALF. Los resultados aquí presentados destacan la superioridad del procedimiento UFC en comparación con el estándar de oro método de UC-DGC debido a su simplicidad y escalabilidad superior. El enfoque basado en la ultrafiltración ha convertido en ampliamente adoptado para aislar la EV de una variedad de muestras biológicas: orina35, acondicionado de célula medios17y suero bovino fetal36. La otra modular basado en el tamaño EV aislamiento técnica que utiliza la ultrafiltración como plataforma es exosomas total aislamiento chip (exóticos)31. Este método también es adecuado para muestras pequeñas de tamaño de la muestra. Algunos factores, como material filtrante y el tamaño del poro de la nanomembranes, necesitan ser considerados cuando se utiliza la técnica UFC ya que pueden afectar las propiedades de los vehículos eléctricos recuperados. Por ejemplo, diferentes tipos de membranas de filtro resultaron diferentes rendimientos de recuperación de RNA asociado EV de orina18. En este estudio, mostramos que celulosa regenerada (RC) con un 10 kDa MWCO la más alta expresión del mRNA de NOP10, OST4, SNRPG y TOMM7 frente a Hydrosart de 10 kDa o polyethersulfone (PES) de 10 kDa18. Además demostramos que la RC con kDa 10 tuvo una mayor recuperación de EV retenido que el kDa 100. Otros han caracterizado contenido de carga de EVs de orina que fueron afectado por el tipo de aislamiento técnicas37. Nuestro estudio mostró que la membrana de MWCO RC 100-kDa proporciona un satisfactorio rendimiento derivados de BALF EV con la ventaja de proteínas menos no deseadas en el retenido por el MWCO más grande.
Este estudio demostró que los tamaños y la distribución del tamaño de los vehículos eléctricos de la UFC eran más pequeños y más homogéneamente distribuidos que los del EVs de UC-DGC. Agregación de la vesícula, que es común con las técnicas de la UC, puede explicar la heterogeneidad de la dimensión de la UC-DGC EVs38. Se evaluó la pureza derivados de BALF EV mediante la detección de las proteínas de membrana EV TSG101, CD63, CD9 y CD81, que confirma la presencia de exosomas en el retentates. Nosotros y otros hemos utilizado también el TEM para demostrar la morfología de la UFC EVs35,39,40,41. Liu et al utiliza un enfoque similar de ultrafiltración para aislar EVs y, en comparación con EVs aisladas por ultracentrifugación, los perfiles proteómicos y transcriptómicos fueron similares31. Así, describimos un método de centrifugación ultrafiltración utilizando una membrana de celulosa regenerada con un MWCO de 100 kDa como un método alternativo de aislamiento de EV que es adecuado para pequeñas muestras de fluidos biológicas como el lavado broncoalveolar.
Los pasos críticos con este enfoque UFC para aislar EVs de fluido biológico incluyen la filtración de μm membrana 0.2 nanoporosos inicial para asegurar que las partículas enriquecidas en el rango de tamaño de exosomal y la evitación de la aplicación de fuerza adicional que puede dañar o deformar los exosomas morfología y estructuras10,42. EVs puede adherirse a la membrana de filtración, que se traduce en menor escalabilidad. Por lo tanto, el volumen de la muestra no debe exceder la cantidad recomendada en cada tipo de filtro. Optamos por utilizar celulosa regenerada, que proporciona un mayor rendimiento de mRNA de orina deriva EVs18. El tipo de membranas de filtro utilizado puede alterar el rendimiento de recuperación y el tipo de vehículos eléctricos. Por último, aunque un MWCO de 100 kDa debería eliminar la mayoría de las proteínas en los fluidos biológicos, algunos contaminantes de la proteína que eran más grandes que 100 agregados kDa o proteína se observaron43. En este caso, un paso de lavado es esencial para minimizar la agregación EV y proteína. Por otra parte, estudios funcionales deben ser adecuadamente controlados para interpretar completamente los resultados, como proteínas asociadas de EV no estará presentes en la EVs de UFC.
Concluimos que la UFC es una alternativa que es factible para el aislamiento de la EV para muestras de volumen pequeño o más grande. Las unidades disponibles en la actualidad microfiltro pueden acomodar hasta 15 mL de las muestras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo es apoyado por las donaciones NHLBI/NIH HL103868 (para PC) y HL137076 (para PC), el americano corazón Asociación subvenciones (para PC) y el Premio de investigación de cáncer de Samuel Oschin integral cáncer Institute (SOCCI) pulmón (para PC). Nos gustaría expresar nuestro gran agradecimiento al Instituto del corazón de Smidt en el Cedars-Sinai Medical Center que nos proporciona una máquina Nanosight para EV nanopartículas análisis de seguimiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
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