Summary
Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn pas ontdekte subcellular componenten die spelen een belangrijke rol in vele biologische functies signalering tijdens fysiologische en pathologische staten. Het isolement van het EVW blijft een grote uitdaging op dit gebied, als gevolg van beperkingen die inherent is aan iedere techniek. De differentiële ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methode is een veel gebruikte aanpak en wordt beschouwd als de gouden standaard procedure voor EV isolatie. Deze procedure is echter tijdrovend, arbeidsintensief, en over het algemeen resulteert in lage schaalbaarheid, die mogelijk niet geschikt voor kleine aantallen monsters zoals bronchoalveolar lavage vloeistof. We laten zien dat een ultrafiltratie centrifugeren isolatie methode eenvoudig is en tijd en arbeid-energiezuinige nog een hoge herstel opbrengst en zuiverheid biedt. Wij stellen voor dat deze isolatie-methode kan een alternatieve benadering die geschikt is voor EV isolatie, met name voor kleine hoeveelheden biologische specimens.
Introduction
Exosomes zijn de kleinste deelverzameling van het EVW, 50-200 nm in diameter, en meerdere biologische functies overal een veelzijdige signalering processen1,2,3,4,5. Ze regelen cellulaire en weefsel homeostase voornamelijk doordat intercellulaire communicatie via lading moleculen zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren6,7,8,9 . Een kritieke stap in EV-onderzoek is het proces van isolement. Differentiële ultracentrifugatie (UC), met of zonder dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC), wordt beschouwd als de gouden standaard aanpak, maar deze methode draagt grote beperkingen, met inbegrip van inefficiënte EV herstel tarieven en lage schaalbaarheid10 , 11 , 12, beperken die het beste gebruik te groter volume monsters, zoals cel cultuur bezinken of hoge exosome productie exemplaren. De voor- en nadelen van andere methoden, zoals grootte uitsluiting door ultrafiltratie of chromatografie, immunoaffinity isolatie door kralen of meer sorteerkolommen en microfluidics, worden goed beschreven, en moderne aanvullende procedures zijn ontwikkeld om overwinnen en technische beperkingen in elke aanpak11,12,13,14,15te minimaliseren. Anderen hebben aangetoond dat een ultrafiltratie centrifugeren (UFC) met een nanoporeuze membraan in de filter-eenheid is een alternatieve techniek waarmee vergelijkbare zuiverheid een UC methode16,17,18. Deze techniek kan worden beschouwd als een van de methoden van alternatieve isolatie.
Bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) bevat EVs die talrijke biologische functies in verschillende luchtwegen19,20,21,22 bezitten. Studeren BALF afkomstige EVs houdt sommige uitdagingen als gevolg van de invasiviteit van de bronchoscopie procedure bij de mens, alsmede een beperkte hoeveelheid lavage vloeistof herstel. In kleine laboratoriumdieren zoals muizen, alleen een paar milliliter in normale longaandoeningen kunnen worden hersteld, zelfs minder in longen ontstoken of fibrotische23. Bijgevolg, het verzamelen van een voldoende hoeveelheid BALF voor EV isolatie door een differentiële ultracentrifugatie voor downstream toepassingen kan niet haalbaar. Isoleren van juiste EV populaties is echter een cruciale factor voor het bestuderen van de biologische functies van de EV. Het delicate evenwicht tussen efficiëntie en werkzaamheid blijft een uitdaging in gevestigde EV isolatie methoden.
In deze huidige studie, wij laten zien dat een centrifugaal ultrafiltratie benadering, met gebruikmaking van een 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) nanomembrane filter unit, geschikt voor kleine hoeveelheden biologische specimen zoals BALF. Deze techniek is eenvoudig, efficiënt en biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid ter ondersteuning van de studie van het EVW BALF-afgeleide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) bij het Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof (BALF) verzameling en voorbereiding
- BALF collectie
- Euthanaseren muizen met een cocktail van ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) via de intraperitoneaal route gevolgd door cervicale dislocatie.
- Plaats een 22 G-angiocatheter in de luchtpijp. Een insuline spuit 1 mL (mL) ijskoude steriele Dulbecco fosfaat buffer zoutoplossing (DPBS) met hechten en inboezemen 1 mL van DBPS in beide longen via de angiocatheter.
- Langzaam trekt de plunjer van de injectiespuit te halen BALF en afzien van de BALF in een conische buis van 50 mL. Houd de BALF op ijs.
- Herhaal stap 1.1.2 en 1.1.3 3 x (4 x in totaal in elke muis).
Opmerking: Ongeveer 0,8 mL is over het algemeen herstellen per milliliter van instillation. Ook de volgende stappen kunnen worden uitgevoerd voor individuele muizen (dat wil zeggen, 3 mL BALF), maar de isolatie van een grotere partij van EVs voor consistentie in downstream experimenten bundeling van meerdere BALF monsters zal toestaan.
- BALF voorbereiding
- BALF zwembad van 25 muizen en verdeel het in twee gelijke sets (~ 35 mL per hoeveelheid).
- Centrifugeer het BALF bij 400 x g, bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijderen van cellen en andere cellulaire puin te verzamelen van de bovendrijvende substantie.
- Centrifugeer het supernatant bij 1.500 x g, bij 4 ° C gedurende 10 min, schakel cel puin. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en gaat u verder met de stappen van de isolatie EV.
2. isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof
Opmerking: In deze studie, twee EV isolatie technieken, namelijk UFC en ultracentrifugatie met uitbundige gebruikt om te isoleren van de EVs van BALF. Het gedetailleerd protocol van elke methode vindt u hieronder.
-
Ultrafiltratie centrifugeren (UFC) verrijking methode
Opmerking: Deze methode werd gewijzigd van een eerder beschreven protocol10.- De bovendrijvende vloeistof uit stap 1.2.3 door een 0,2 micrometer steriele injectiespuit filter filteren en houden de gefilterde BALF op ijs.
Nota: Dit is een stap grootte uitsluiting waarbij alleen de blaasjes die kleiner is dan 200 nm worden verzameld. - Equilibreer de 100 kDa MWCO centrifugaal filter unit met steriele DPBS voor 10 min. Centrifuge de centrifugaal eenheid bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C als u wilt verwijderen van de DPBS.
Let op: Zodra het membraan in de filter-apparaat wordt geëquilibreerd met DPBS, het membraan moet worden gehouden natte te allen tijde totdat het apparaat wordt gebruikt. - Vul de filter eenheid met 15 mL BALF monster uit stap 2.1.1 en centrifuge op 3000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De doorstroming BALF kan worden weggegooid of verzameld in een aparte canonieke buis en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.
- Herhaal stap 2.1.3 voor de resterende 0,2 µm-gefilterd BALF.
Opmerking: Het duurde drie herhalingen van centrifugations voldoende concentreren de EVs BALF van het oorspronkelijke uitgangspunt volume van 35 mL. Dit resulteerde in 1-1.5 mL retentate. - De retentate met 14 mL steriele DPBS door een zacht pipetteren herhaaldelijk wassen. Centrifugeer de filter-unit 3000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten, te verwijderen van de DPBS en te concentreren van de EV-retentate.
- De geconcentreerde BALF afkomstige EVs ophalen door het filter apparaat door het invoegen van een pipet in de onderzijde van het apparaat van de filter of de intrekking van het monster met behulp van een side-to-side ingrijpende motie om ervoor te zorgen volledige terugvordering.
- Aliquot de EVs BALF-afgeleide en bewaar ze bij-80 ° C voor verdere kwantificering van de deeltjes en karakterisering (zie stap 3).
- De bovendrijvende vloeistof uit stap 1.2.3 door een 0,2 micrometer steriele injectiespuit filter filteren en houden de gefilterde BALF op ijs.
-
Ultracentrifugatie (UC) met uitbundige dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC)
Opmerking: Het volgende protocol werd gewijzigd van de eerder beschreven protocol24.- Het supernatant van stap 2.1.1 overboeken naar een buis 37 mL ultracentrifuge samen en Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C met behulp van de ultracentrifuge. De bovendrijvende vloeistof en centrifuge bij 100.000 x g, bij 4 ° C gedurende 60 minuten te verzamelen. Terwijl de EV-pellets worden gecentrifugeerd, voorbereiden op verschillende concentraties van uitbundige dichtheid kleurovergang buffers (tabel 1) stap 2.2.3.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de EV-pellets in 200 μL van DPBS.
- Meng de EV schorsing met 300 μL van 50% iodixanol werkoplossing (tabel 1) en het overbrengen van de ultracentrifuge tube van 15 mL. Op de top van de 50% iodixanol-EV mengsel schorsing, laag achtereenvolgens de volgende bufferoplossing in de volgorde van de bodem naar de top: 30% iodixanol (4.5 mL), 25% van de iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2,5 mL) en 5% iodixanol (6 mL). Centrifugeer bij 100.000 x g, bij 4 ° C voor 230 min.
Opmerking: Het verloop van de uitbundige dichtheid is gebaseerd op het percentage van iodixanol schalen met de hoogste concentratie (50%) aan de onderkant bij de laagste concentratie (5%) aan de bovenkant. Voor het genereren van verschillende concentraties van iodixanol, werden verschillende hoeveelheden van homogenisering medium (tabel 1) gemengd met werkoplossing (50% iodixanol). - Verzamelen van de 15% en 25% breuk en vul ze in steriele DPBS om het volume tot 15 mL. Overbrengen naar een nieuwe kleine ultracentrifuge buis en centrifuge bij 100.000 x g, bij 4 ° C gedurende 60 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de EV-pellets in 50 μl van steriele DPBS voor verdere karakterisering.
3. de extracellulaire vesikel kwantificering
Opmerking: De EVs BALF afkomstige herstel opbrengst is quantitated met twee statistieken.
- Nanoparticle tracking analyse (NTA) meting
- Verdun het EV monster bij 1:200-1:500 in DPBS en belasting van het monster af in een insuline spuit 1 mL. Een monster spuit hechten aan een spuitpomp en beginnen de deeltje nummers en grootte (Zie Tabel van materialen) te meten.
- Vastgesteldop de camera recht op 14 en de detectie drempel 1 voor alle monster metingen. Vijf herhaalde metingen met 1.500 frames in 30 s werden opgenomen voor elk monster, met een vertraging van 20 s tussen leest. Combineer en gemiddelde van de gegevens voor de eindconcentratie en grootte rapporten.
Opmerking: Voor het nauwkeurig vastleggen van alle deeltjes, pas het niveau van de camera zo nodig om te visualiseren van alle deeltjes en soortgelijke instellingen gebruiken voor alle monster metingen in elk experiment.
- Eiwit kwantificering
Opmerking: De bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling werd gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie van het EVW BALF-afgeleide.- Solubilize de EV monsters in 1 x lysis-buffermengsel.
- Kwantificeren van de hoeveelheid eiwit in de EVs BALF afkomstige per BCA standaardprotocol colorimetrische detectie met door het meten van de absorptie bij 560 nm in een afleesapparaat.
4. detectie van extracellulaire blaasjes BALF-afgeleide
Opmerking: Algemeen bekende exosome oppervlakte marker eiwitten (TSG101, CD63, CD81 en CD9) werden gebruikt om te controleren of EV terugvorderingen van SDS-pagina en immunoblotting en stroom cytometry analyse.
- SDS-pagina en immunoblotting
- Los een gelijke hoeveelheid van EV eiwitten van elk monster met een bevlekken laden 50 mM dithiothreitol (DTT) in een 1.6 mL tube en een buffer (lithium dodecyl sulfaat). Verwarm de monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- De monsters van stap 4.1.1 in een 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel laden en uitvoeren van elektroforese (150 volt, 35 mA) voor 35 min.
- Eiwitten overbrengen in een membraan van de nitrocellulose met een droge overdrachtmethode.
- Het blokkeren van het membraan met 5% magere melk voor 60 min, rocken bij kamertemperatuur (RT).
- Incubeer het membraan met een antilichaam aan een EV oppervlakte-proteïne marker, Gene 101 (TSG101), van de gevoeligheid van de Tumor bij 1:500 verdunning in 5% BSA in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween-20 (TBST) bij 4 ° C, 's nachts schommelen.
- De volgende dag was het membraan 3 x, 10 minuten elk, in buffer TBST wassen en Incubeer het met anti-konijn IgG, een HRP-linked antilichaam, bij 1:5,000 verdunning gedurende 60 minuten op RT.
- Wassen van het membraan 3 x, 10 minuten elk, in de buffer TBST wassen. Het ontwikkelen van het membraan met chemiluminescentie HRP antistof detectie reagens en beeld (Zie Tabel van materialen voor imaging systeem).
- Stroom cytometry
- Verdun BALF afkomstige EVs in 49 μL van PEB kleuring buffer (PBS + 5 mM EDTA 0.5% BSA, gefilterd door een membraan van 0,1 μm spuit filter).
- Toevoegen van elk van de volgende antistoffen in elk afzonderlijke monster: 1) rat anti-muis PE CD63 antilichaam (100 ng per reactie); 2) rat-antimuis PE CD81 (500 ng); 3) rat-antimuis FITC-CD9 (200 ng). Incubeer bij 4 ° C, schommelen gedurende 60 min. in het donker.
- Verdun de monsters met 450 μL van membraan gefiltreerd PEB kleuring buffer en de monsters aan stroom cytometry analyse onderworpen (Zie Tabel van materialen)25.
- Aanpassen van de stroom cytometer-instellingen als volgt: 1) alle kanalen instellen op hyper log (hlog); 2) vastgesteldop de trigger op WS 4; 3) uitschakelen van de secundaire trigger. De monsters worden uitgevoerd in een omgeving met lage snelheid en het verwerven van ten minste 10.000 gebeurtenissen in elk monster.
- Lage cytometry gegevensanalyses uitvoeren in elk monster met behulp van analysesoftware (Zie Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We EV isolatie van muis BALF uitgevoerd met behulp van de UFC en UC-DGC isolatie-methoden op dezelfde dag. De UFC-methode vereist ongeveer 2,5-3 h, overwegende dat de UC-DGC techniek 8 h verwerkingstijd vereist. Worden hier niet meegerekend buffers en reagens voorbereidingstijd. Opgemerkt moet worden dat bepaalde andere taken kunnen worden uitgevoerd tijdens de perioden van de lange centrifugeren. Echter duurde de gehele procedure bijna een hele dag voor de UC-DGC isolatie-techniek.
BALF-afgeleide EVs van normale muizen geïsoleerd door de UFC methode weergegeven een kleiner formaat en een meer uniforme verdeling naar grootte (148.8 ± 1.1 nM, figuur 1A) in vergelijking met de UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, figuur 1B). De UFC techniek had een diepe 65-fold grotere totale deeltje telt in vergelijking met de UC-DGC isolatie (29.4 ± 18,4 vs. 0,5 ± 0,1 x 1010 deeltjes; p < 0.05; Tabel 2 en Figuur 1 c). Het herstel van de totale proteïne (in µg) van de UFC EVs ook hoger was (3,136 ± 1,860 vs. 73,7 ± 38,3 µg; p < 0.05; Tabel 2 en Figuur 1 d). Dus, UFC is tijd en inspanning-energiezuinige en biedt een hoger rendement van de EV.
Verder karakteriseren fenotypische BALF afkomstige EV populaties, onderzochten we de aanwezigheid van bekende exosome oppervlakte-proteïne markers: CD63, CD9 en CD81 door stroom cytometry en TSG101 door immunoblotting. Met behulp van stroom cytometry analyse, we laten zien dat de UFC EVs en UC-DGC EVs beide CD63 uitgedrukt (figuur 2A -2 C), CD9 (figuur 2D -2F), en CD81 (Figuur 2 g -2I). De meetkundige gemiddelde expressie (gMFI) van CD63, CD9 en CD81 was gekwantificeerde en niet statistisch verschillend tussen de twee voorwaarden (figuur 3A -3F).
Vervolgens onderzochten we een ander EV eiwit marker, TSG101, door immunoblotting. We toonden dat de 20 µg van de UFC doorstroming (UFC-FT) monster bevatte geen TSG101 eiwitten, suggereren dat de UFC isolatie techniek efficiënt geselecteerd en behouden van de EV-bevolking uit de BALF monster (Figuur 4). Toen gelijke hoeveelheden van totale proteïne (20 µg) van het monster BALF-EV werd geladen, vonden we dat UFC EVs een hoger niveau van TSG101 dan UC-DGC EVs (Figuur 4 uitgedrukt). Wij ook bleek dat de zuiverheid van de UFC-EV eiwit aanvaardbaar, aangetoond door een band van enkele geïsoleerde eiwit.
Voor alle resultaten, Student t-test werd gebruikt voor de vergelijking van de twee-groep. De resultaten worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM (standaardfout van het gemiddelde) was, en p < 0.05 belangrijk.
Figuur 1: ultrafiltratie centrifugeren van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF)-afgeleide EVs aangetoond dat een meer homogene grootteverdeling dan ultracentrifugatie met kleurovergang centrifugeren van de dichtheid van het lymfkliertest BALF afkomstige EVW en had een aanzienlijk hoger totale deeltje graaf en eiwit gehalte. De verdeling van de deeltjesgrootte van de EV werd gemeten door nanoparticle bijhouden analyse (NTA) en het totale eiwitgehalte werd gemeten door de zure test van bicinchoninic. (A) UFC-BALF EVs' NTA grootte distributie grafiek. (B) UC-DGC-BALF EVs grootte distributie grafiek. (C) totale deeltje graaf door NTA (bedoel ± SEM x 1010 deeltjes; * p < 0,05). (D) totale eiwitgehalte (in µg, * p < 0,05). De gegevens werden ontleend aan drie onafhankelijke experimenten. UFC: ultrafiltratie centrifugeren; UC-DGC: ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren; EVs: extracellulaire blaasjes; SD: de standaarddeviatie van; Conc: concentratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof afkomstige EVs geïsoleerd door ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methoden uitgedrukt tetraspanin eiwitten CD63, CD9 en CD81. Getoond worden percentages van het EVW gekleurd positief door de UFC en UC-DCG isolatie technieken, geïllustreerd door kleurcorrectie percelen, voor (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9, en (G - Ik) PE-CD9. De gegevens zijn ontleend aan drie onafhankelijke experimenten. UFC = ultrafiltratie centrifugeren; UC-DGC = ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren; EVW = extracellulaire blaasjes; SSC-A = kant scatter analyse; PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: ultrafiltratie lymfkliertest bronchoalveolar centrifugeren-geïsoleerde lavage vloeistof afkomstige EVs uitgedrukt een vergelijkbare TL dichtheid van tetraspanin eiwitten aan ultracentrifugatie-geïsoleerde EVs. (A en D) Histogram en meetkundige gemiddelde expressie (gMFI) van PE-CD63-+-gekleurd EVs. (B en E) Histogram en gMFI van FITC-CD9+-gekleurd EVs. (C en F) Histogram en gMFI voor PE-CD81-+-gekleurd EVs. Deze gegevens zijn ontleend aan drie onafhankelijke experimenten. UFC: ultrafiltratie centrifugeren; UC-DGC = ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren; EVs: extracellulaire blaasjes; SSC-A: kant scatter analyse; PE: phycoerythrin; FITC: fluoresceïne isothiocyanaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof afkomstige EVs geïsoleerd door ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methoden uitgedrukt de exosome oppervlakte-proteïne, TSG101. Dit paneel toont de immunoblotting van lymfkliertest BALF afkomstige EVs voor het TSG101 antilichaam (47 kDa). UFC = ultrafiltratie centrifugeren; UC-DGC = ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren; EVW = extracellulaire blaasjes; FT = doorstroomtest; TSG = tumor gevoeligheid gen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Werkende oplossing Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Werkoplossing (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Homogenisering medium (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabel 1: uitbundige dichtheid kleurovergang buffers. Deze tabel geeft de samenstelling en buffer verhouding van elke kleurovergang oplossing die werd gebruikt voor het zuiveren van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof afkomstige extracellulaire vesikel populaties geïsoleerd door de ultracentrifugatie techniek. * De werkoplossing was iodixanol van 50% (25 mL van de kleurovergang medium dichtheid [Zie Tabel of Materials] + 5 mL verdunningsmiddel oplossing [pH 7.4 van 0,25 M sacharose, 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl]). ** Homogenisering medium (pH 7.4 van 0,25 M sacharose + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)
| Methoden | Startende Volume (mL) | NTA* (x 108/μL) | Total deeltjes† (x1010) | Eiwit Conc‡ (µg/µL) | Totale eiwitten§ (µg) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29.4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0,5 ± 0,1 | 0.6 | 73.7 ± 38,3 |
Tabel 2: de ultrafiltratie centrifugeren isolatie methode verstrekt een hoge lymfkliertest bronchoalveolar lavage extracellulaire vesikel vloeistof afkomstige opbrengst. Het deeltje concentratie en de totale deeltje graaf werden gemeten door nanoparticle analyse (NTA) bijhouden. De eiwitconcentratie en de totale hoeveelheid eiwit werden gemeten door een bicinchoninic zuur eiwit bepaling. * BALF EVs deeltje concentratie (gemiddelde ± SEM x 108/μL uit drie onafhankelijke experimenten). † BALF EVs totale deeltjes (gemiddelde ± SEM x 1010 deeltjes uit drie onafhankelijke experimenten). ‡ BALF EVs eiwitconcentratie (gemiddelde ± SEM µg/µL van drie onafhankelijke experimenten). § BALF EVs totaal eiwit (gemiddelde ± SEM mg uit drie onafhankelijke experimenten).
UFC: ultrafiltratie centrifugeren; UC-DGC: ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren; Conc: concentratie; NTA: nanoparticle voor het bijhouden van analyse; SEM: de standaardfout van het gemiddelde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen decennia, hebben de wetenschappers de betekenissen van het EVW in cellulaire homeostase ontrafeld. Nog belangrijker, spelen EVs een grote rol in vele ziekteprocessen door modulerende ver en naburige cellen via hun bioactieve lading moleculen1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. toekomstige ontwikkeling en vooruitgang op dit gebied sterk afhankelijk van betrouwbare en efficiënte methoden die niet alleen identificeren en scheiden corrigeren deelverzamelingen van EV populaties, maar ook het behoud van hun biologische functies voor downstream toepassingen 10 , 11 , 14 , 31. in de huidige studie, beschreven we een nanomembrane ultrafiltratie centrifugeren (UFC) methode voor het isoleren van EVs van muis BALF. In overeenstemming met andere verslagen toonden we dat UFC eenvoudig is en in een hoge herstel opbrengst en zuiverheid resulteert en daarom geschikt voor kleine biologische monsters10,17,18,32 .
UC-DGC wordt vaak gebruikt en wordt beschouwd als de gouden standaard techniek voor EV isolatie omdat het biedt hoogst gezuiverde EV deeltjes-10,14. Deze methode is echter technisch gezien omslachtig, tijdrovend, arbeidsintensief, en lage schaalbaarheid heeft. De nieuw ontwikkelde microfluidics gebaseerde technieken deze beperkingen te overwinnen, maar deze aanpak verder validatie vereist voordat het volledig kan worden uitgevoerd als een alternatieve methode33,34. Passende methoden die deze moeilijkheden huisvesten zonder afbreuk te doen aan de zuiverheid en de schaalbaarheid van de monsters worden zo hard nodig, met name voor kleine hoeveelheden biologische vloeistof.
We toonden aan dat de UFC met behulp van een nanomembrane filter apparaat werkzaam voor de EV-isolatie van BALF exemplaren was. De hier gepresenteerde bevindingen markeren de superioriteit van de UFC-procedure ten opzichte van de goudstandaard UC-DGC methode vanwege zijn eenvoud en hogere schaalbaarheid. De ultrafiltratie gebaseerde benadering heeft alom worden aangenomen om te isoleren van EV uit een verscheidenheid van biologische monsters: urine35, cel-geconditioneerd media17en foetale runderserum36. De andere modulaire grootte gebaseerde EV isolatie techniek die gebruik maakt van ultrafiltratie als een platform is exosome totale isolatie chip (exotische)31. Deze methode is ook geschikt voor kleine steekproefgrootte exemplaren. Een aantal factoren, zoals filtermateriaal en de poriegrootte van het nanomembranen, moeten worden overwogen bij het gebruik van de techniek van de UFC omdat ze van invloed kunnen zijn op de eigenschappen van herstelde EVs. Bijvoorbeeld resulteerde verschillende soorten filter membranen in verschillende opbrengsten van de terugwinning van de EV-geassocieerde RNA van urine18. In deze studie, we toonden dat geregenereerde cellulose (RC) met een 10 kDa MWCO de hoogste uitdrukking van mRNA van NOP10, OST4, SNRPG verstrekt, en TOMM7 in vergelijking tot Hydrosart 10 kDa of polyethersulfon (PES) van 10 kDa18. We verder aangetoond dat de RC met 10 kDa had een hogere retentate EV herstel dan de 100 kDa. Anderen hebben gekenmerkt urine EVs lading inhoud die werden getroffen door het type isolatie technieken37. Onze studie toonde aan dat het membraan van 100-kDa MWCO RC een bevredigend rendement BALF afkomstige EV met het voordeel van veel minder ongewenste eiwitten in de retentate als gevolg van de grotere MWCO verstrekt.
Deze studie aangetoond dat de maten en de grootteverdeling van UFC EVs kleiner en meer homogeen verspreid dan die van UC-DGC EVs waren. Vesikel aggregatie, wat gebruikelijk met UC technieken, kan verklaren de heterogeniteit van de dimensie van UC-DGC EVs38. We beoordeeld BALF afkomstige EV zuiverheid door het detecteren van de membraaneiwitten EV TSG101, CD63, CD9 en CD81, hetgeen de aanwezigheid van exosomes in de retentates bevestigt. Wij en anderen hebben ook TEM gebruikt om aan te tonen van de morfologie van de UFC EVs35,39,40,41. Liu et al. gebruikt een vergelijkbare ultrafiltratie gebaseerde aanpak om te isoleren van de EVs en, in vergelijking met geïsoleerd door ultracentrifugatie EVs, de profielen van proteomic en transcriptomic waren vergelijkbaar31. Dus beschrijven we een ultrafiltratie centrifugeren methode met behulp van een membraan van geregenereerde cellulose met een MWCO van 100 kDa als een alternatieve EV isolatie methode die geschikt is voor kleine biologische vloeibare steekproeven zoals bronchoalveolar lavage vloeistof.
De kritische stappen met behulp van deze aanpak van de UFC om te isoleren van EVs van biologische vloeistof omvatten de eerste nanoporeuze 0,2 µm membraanfiltratie om ervoor te zorgen dat de verrijkte deeltjes in de groottewaaier van de exosomal en het vermijden van extra kracht die kan schade of vervormen de exosome morfologie en structuren10,42. EVW kunnen houden aan het membraan-filtratie, wat in lagere schaalbaarheid resulteert. Daarom moet het volume van het monster niet meer dan het aanbevolen bedrag in elk type filter eenheid. We kozen om het gebruik van folie van geregenereerde cellulose, die een hoger rendement van de mRNA van urine afkomstige EVs18. Het type filter membranen gebruikt kan veranderen de herstel opbrengst en het type van het EVW. Tot slot, hoewel een MWCO van 100 kDa moet het elimineren van de meerderheid van de eiwitten in de biologische vloeistoffen, werden sommige eiwitten verontreinigingen die groter dan 100 kDa of eiwit-aggregaten waren43waargenomen. In dit geval is een wassen stap cruciaal voor het minimaliseren van EV en eiwit aggregatie. Bovendien, functionele studies moeten goed gecontroleerd worden om volledig het interpreteren van de resultaten, zoals niet-EV-geassocieerde eiwitten in de UFC EVs aanwezig zal zijn.
Wij concluderen dat de UFC is een alternatieve benadering die haalbaar is voor EV isolatie voor kleine of grotere-volume monsters. De momenteel beschikbare microfilter eenheden zijn geschikt voor maximaal 15 mL monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk wordt ondersteund door de NHLBI/NIH subsidies HL103868 (voor pct.) en HL137076 (tot pct.), de American Heart Association Grant-in-Aid (naar pct.) en de Samuel Oschin uitgebreide kanker instituut (SOCCI) Lung Cancer Research Award (naar pct.). Wij zouden graag onze grote waardering uitspreken voor de Smidt Heart Institute in het Cedars-Sinai Medical Center waarmee ons een Nanosight machine voor EV nanoparticle bijhouden van analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
