Summary
Her beskriver vi to ekstracellulære vesicle isolasjon protokoller, ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering, isolere ekstracellulære blemmer fra murine bronchoalveolar lavage prøver. De ekstracellulære blemmer avledet fra murine bronchoalveolar lavage væske av begge metodene er kvantifisert og preget.
Abstract
Ekstracellulære blemmer (EVs) er nyoppdagede subcellular komponenter som spiller viktige roller i mange biologiske signalering funksjoner under fysiologiske og patologiske tilstander. Isolasjon av EVs fortsetter å være en stor utfordring i dette feltet på grunn av begrensninger iboende til hver teknikk. Differensial ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metode er en brukte tilnærming og anses å være gullstandarden prosedyren for EV isolasjon. Men denne prosedyren er tidkrevende, arbeidskrevende, og vanligvis resulterer i lav skalerbarhet, som ikke kanskje er egnet for små volumer prøver som bronchoalveolar lavage væske. Vi viser at en ultrafiltrasjon sentrifugering isolasjon metoden er enkel og tid - og arbeidskrevende effektiv ennå gir en høy grad av utvinning avkastning og renhet. Vi foreslår at denne isolasjon metoden kan være en alternativ tilnærming som passer for EV isolasjon, spesielt for små volumer biologiske prøver.
Introduction
Exosomes er den minste undergruppe av EVs, 50-200 nm i diameter, og har flere biologisk funksjoner på tvers av et variert utvalg av signalering prosesser,1,,2,,3,,4,,5. De styrer cellular og vev homeostase av lette intercellulære kommunikasjon gjennom Last molekyler som lipider, proteiner og nukleinsyrer6,7,8,9 . En kritisk trinn i EV forskning er en isolert prosess. Differensial ultracentrifugation (UC), med eller uten tetthet gradert sentrifugering (DGC), anses gullstandarden tilnærming, men denne metoden har store begrensninger, inkludert ineffektiv EV utvinningsgraden og lav skalerbarhet10 , 11 , 12, som begrenser dens beste utnyttelse til større volum utvalgene, for eksempel celle kultur supernatant eller høy exosome produksjon prøver. Fordeler og ulemper med andre metoder, som størrelse utelukkelse av ultrafiltrasjon eller Ture, immunoaffinity isolasjon av perler eller kolonner og microfluidics, er godt beskrevet og moderne supplerende prosedyrer har blitt utviklet til overvinne og minimere tekniske begrensninger i hver tilnærming11,12,13,14,15. Andre har vist at en ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) med en nanoporous membran i filter enheten er en alternativ teknikk som gir sammenlignbare renhet til en UC metoden16,17,18. Denne teknikken kan betraktes som én av metodene alternativ isolasjon.
Bronchoalveolar lavage væske (BALF) inneholder EVs som har mange biologiske funksjoner i ulike åndedrettsproblemer19,20,21,22. Studere BALF-avledet EVs innebærer noen utfordringer på grunn av invasiveness av bronkoskopi prosedyren mennesker, samt et begrenset antall lavage væske utvinning. I lite laboratorium dyr som mus, bare noen få ml kan gjenopprettes i normal tette forhold, selv mindre betent eller fibrotiske lungene23. Følgelig kan samle en tilstrekkelig mengde BALF EV isolering av en differensiell ultracentrifugation for nedstrøms programmer ikke være gjennomførbart. Men er isolere riktig EV populasjoner en avgjørende faktor for å studere EV biologiske funksjoner. Den skjøre balansen mellom effektivitet og effekt fortsetter å være en utfordring i veletablerte EV isolasjon metoder.
I denne nåværende studien viser vi at en sentrifugal ultrafiltrasjon tilnærming, utnytte en 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) nanomembrane filter enhet, er egnet for små volumer biologiske prøven som BALF. Denne teknikken er enkel og effektiv, og gir høy renhetsgrad og skalerbarhet støtte studiet av BALF-avledet EVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utnyttelsen av dyr og alle dyr prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. murine Bronchoalveolar Lavage væske (BALF) innsamling og forberedelse
- BALF samling
- Euthanize mus med en cocktail av ketamin (300 mg/kg) og xylazine (30 mg/kg) via intraperitoneal-ruten etterfulgt av cervical forvridning.
- Sett inn en 22 G angiocatheter i luftrøret. Knytt en insulinsprøyte som inneholder 1 mL (mL) iskald sterilt Dulbecco fosfat buffer saltoppløsning (DPBS) og innpode 1 mL av DBPS inn begge lungene gjennom angiocatheter.
- Sakte trekke sprøytestempelet å hente BALF og dispensere til BALF til en 50-mL konisk rør. Hold BALF på is.
- Gjenta trinn 1.1.2 og 1.1.3 3 x (4 x totalt i hver mus).
Merk: Ca 0,8 mL hentes vanligvis per milliliter instillasjon. Også følgende kan utføres for individuelle mus (dvs.3 mL BALF), men samle flere BALF eksempler vil tillate isolering av en større gruppe med EVs for konsistens i nedstrøms eksperimenter.
- BALF forberedelse
- Pool BALF fra 25 mus og dele det i to like sett (~ 35 mL per aliquot).
- Sentrifuge BALF på 400 x g, ved 4 ° C i 5 min, for å fjerne celler og andre mobilnettet rusk og samle nedbryting.
- Sentrifuge nedbryting på 1500 x g, ved 4 ° C i 10 min, for å fjerne celle rusk. Samle nedbryting og fortsette til EV isolasjon fremgangsmåten.
2. isolering av ekstracellulære blemmer fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske
Merk: I denne studien, to EV isolasjon teknikker, nemlig UFC og ultracentrifugation med høy brukes til å isolere EVs fra BALF. Detaljert protokollen for hver metode beskrives nedenfor.
-
Ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) berikelse metode
Merk: Denne metoden ble endret fra en tidligere beskrevet protokollen10.- Filtrere nedbryting fra trinn 1.2.3 gjennom et 0,2 μm sterile sprøyter filter og holde den filtrerte BALF på is.
Merk: Dette er en størrelse utelukkelse trinn der bare blemmer mindre enn 200 nm samles. - Equilibrate 100 kDa MWCO sentrifugal filter enhet med sterilt DPBS for 10 min. sentrifuge sentrifugal enheten 1500 x g for 10 min på 4 ° C for å forkaste DPBS.
FORSIKTIG: Når membranen filter enheten er equilibrated med DPBS, membranen må holdes våt hele tiden før bruk. - Fylle filter enhet med 15 mL BALF eksempel fra trinn 2.1.1 og sentrifuger 3000 x g i 30 min på 4 ° C. Gjennomflytsenhet BALF kan ignoreres eller samlet inn i et separat kanoniske rør og lagret på-80 ° C for fremtidig bruk.
- Gjenta trinn 2.1.3 for de gjenværende 0,2 µm-filtrert BALF.
Merk: Det tok tre gjentakelser av centrifugations å konsentrere tilstrekkelig BALF EVs fra opprinnelige Start volumet på 35 mL. Dette resulterte i 1-1,5 mL av retentate. - Vask retentate med 14 mL steril DPBS av en forsiktig pipettering gjentagelser. Virvel filter enheten på 3000 x g, ved 4 ° C i 30 min, fjerne DPBS og konsentrere EV retentate.
- Samle de konsentrerte BALF-avledet EVs fra filter-enheten ved å sette en hindre i bunnen av filteret enheten og trekker prøven ved hjelp av en side til side feiende bevegelse for å sikre total utvinning.
- Aliquot BALF-avledet EVs og lagre dem på-80 ° C for ytterligere partikkel kvantifisering og karakterisering (se trinn 3).
- Filtrere nedbryting fra trinn 1.2.3 gjennom et 0,2 μm sterile sprøyter filter og holde den filtrerte BALF på is.
-
Ultracentrifugation (UC) med høy tetthet gradert sentrifugering (DGC)
Merk: Følgende protokollen ble endret fra tidligere beskrevet protokollen24.- Overføre nedbryting fra trinn 2.1.1 til en 37-mL ultracentrifuge rør og sentrifuge prøven på 10.000 x g i 30 min på 4 ° C ved hjelp av ultracentrifuge. Samle nedbryting og sentrifuger 100.000 x g, på 4 ° C for 60 min. Mens EV pellets er centrifuged, forberede ulike konsentrasjoner av høy tetthet gradert buffere (tabell 1) trinn 2.2.3.
- Forkast nedbryting og resuspend EV pellets i 200 μL av DPBS.
- Bland EV suspensjon med 300 μL 50% iodixanol fungerende løsning (tabell 1) og overføre den til 15 mL ultracentrifuge røret. Over 50% iodixanol EV blanding suspensjon sekvensielt laget følgende buffer løsning i rekkefølge fra bunnen til toppen: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% av iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2.5 mL) og 5% iodixanol (6 mL). Sentrifuger 100.000 x g, på 4 ° C for 230 min.
Merk: Høy tetthet graderingen er basert på prosent av iodixanol skalering med den høyeste konsentrasjonen (50%) nederst til den laveste konsentrasjonen (5%) på toppen. Vil generere ulike konsentrasjoner av iodixanol, ble ulike mengder homogenisering medium (tabell 1) blandet med fungerende løsning (50% iodixanol). - Samle 15% og 25% brøken og fortynne dem i sterilt DPBS å ta opp til 15 mL. Overføre dem til en ny liten ultracentrifuge rør og sentrifuger 100.000 x g, på 4 ° C for 60 min.
- Forkast nedbryting og resuspend EV pellets i 50 μL av sterile DPBS for ytterligere karakterisering.
3. ekstracellulære Vesicle kvantifisering
Merk: BALF-avledet EVs utvinning avkastningen er quantitated med to beregninger.
- Hydrogenion sporing analyse (NTA) måling
- Fortynne EV prøven på 1:200-1:500 i 1 mL av DPBS og laste utvalget i en insulinsprøyte. Fest prøven sprøyter til en sprøytepumpe og begynne å måle partikkel tall og størrelse (se Tabell for materiale).
- Angi kamera på 14 og gjenkjenning terskelen på 1 for alle eksempel målinger. Fem gjentatte målinger med 1500 rammer i 30 s ble registrert for hver prøve, med en forsinkelse på 20 s lest. Kombiner og gjennomsnittlig dataene for siste konsentrasjon og størrelse rapporter.
Merk: For nøyaktig fangst av alle partikler, justere kameranivå avhengig visualisere alle partikler og bruker lignende innstillinger for alle utvalg mål i hvert eksperiment.
- Protein kvantifisering
Merk: Bicinchoninic syre (BCA) protein analysen ble brukt til å måle protein konsentrasjonen av BALF-avledet EVs.- Solubilize EV eksemplene i 1 x lyseringsbuffer.
- Kvantifisere mengden protein i BALF-avledet EVs per BCA standardprotokoll bruker kolorimetrisk oppdagelsen ved å måle absorbansen på 560 nm i en plate-leser.
4. registrering av BALF-avledet ekstracellulære blemmer
Merk: Kjent exosome overflaten markør proteiner (TSG101, CD63, CD81 og CD9) ble brukt til å bekrefte EV inngang SDS-side og immunoblotting og flyt cytometri analysen.
- SDS side og immunoblotting
- Oppløse en lik mengde EV proteiner av hvert utvalg med en blotting lasting buffer (litium dodecyl sulfate) og 50 mM dithiothreitol (DTT) i en 1.6 mL tube. Varme prøvene ved 70 ° C i 10 min.
- Laste inn prøvene fra trinn 4.1.1 i en 4-12% Bis-Tris pluss akrylamid gel og kjøre geleelektroforese (150 volt, 35 mA) for 35 min.
- Overføre proteiner til en nitrocellulose membran med en tørr overføringsmetode.
- Blokkere membranen med 5% skummet melk for 60 min, rocking ved romtemperatur (RT).
- Inkuber membranen med en mot en EV overflaten protein markør, Tumor mottakelighet Gene 101 (TSG101), på 1:500 fortynning i 5% BSA i Tris-bufret saltvann Tween-20 (TBST) på 4 ° C, gynge over natten.
- Neste dag, vaske membranen 3 x, 10 min hver vask, i TBST buffer, og ruge det med anti-kanin IgG, et HRP-tilknyttet antistoff, på 1:5,000 fortynning for 60 min på RT.
- Vask membranen 3 x, 10 min hver vask, TBST buffer. Utvikle membranen med chemiluminescent HRP antistoff oppdagelsen reagens og image (se Tabell for materiale for tenkelig system).
- Flowcytometri
- Fortynn BALF-avledet EVs i 49 μL PEB flekker buffer (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, filtrert gjennom en 0,1 μm sprøyte filter membran).
- Av følgende antistoffer til hver enkelte eksempel: 1) rotte anti-musen PE CD63 antistoff (100 ng per reaksjon); 2) rotte anti-musen PE CD81 (500 ng); 3) rotte anti-musen FITC CD9 (200 ng). Inkuber ved 4 ° C, rocking for 60 min i mørket.
- Fortynne prøvene med 450 μL membran-filtrert PEB flekker buffer og underlagt prøvene flyt cytometri analyse (se Tabell for materiale)25.
- Justere flyt cytometer innstillingene på følgende måte: 1) sette alle kanaler på hyper Logg (hlog); 2) sett utløseren på SSC på 4; 3) slå av sekundær utløseren. Kjøre prøvene i en lav hastighet og få minst 10.000 hendelser i hver prøve.
- Utføre lav cytometri dataanalyse i hvert utvalg bruker analyseprogramvare (se Tabell for materiale).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte EV isolert fra mus BALF bruke UFC og UC-DGC isolasjon på samme dag. Metoden UFC kreves ca 2,5-3 h, mens UC-DGC teknikken nødvendig 8t behandling tid. Dette inkluderte ikke buffere og reagens Forberedelsestid. Det bør bemerkes at noen andre oppgaver kan utføres i lang sentrifugering perioder. Likevel varte hele framgangsmåten nesten en hel dag for UC-DGC isolasjon teknikken.
BALF-avledet EVs fra normal mus isolert av metoden UFC vises mindre størrelse og en mer ensartet størrelsesDistribusjon (148.8 ± 1.1 nM, figur 1A) sammenlignet med UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, figur 1B). UFC teknikken hadde en dyp 65-fold større totale partikkel teller sammenlignet med UC-DGC isolasjon (29,4 ± 18.4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 partikler; p < 0,05; Tabell 2 og figur 1 c). Totalt protein utvinning (i µg) av UFC EVs var (3,136 ± 1,860 vs 73.7 ± 38,3 µg, p < 0,05; Tabell 2 og figur 1 d). Dermed UFC er tid og innsats-effektiv og gir en høyere EV avkastning.
Videre betegner svært BALF-avledet EV befolkninger, undersøkte vi tilstedeværelsen av kjente exosome overflaten protein markører: CD63, CD9 og CD81 av flowcytometri og TSG101 av immunoblotting. Bruker flyt cytometri analyse, vi viste at både UFC EVs og UC-DGC EVs uttrykt CD63 (figur 2A -2 C), CD9 (figur 2D -2F), og CD81 (figur 2 g -2I). Geometriske gjennomsnittet uttrykket (gMFI) CD63, CD9 og CD81 var kvantifisert og ikke statistisk forskjellig mellom de to forholdene (figur 3A -3F).
Neste, vi undersøkte en EV protein markør, TSG101, av immunoblotting. Vi viste at de 20 µg på UFC gjennomflytsenhet (UFC-FT) utvalget inneholder TSG101 proteiner, antyder at UFC isolasjon teknikken effektivt valgt og beholdt befolkningen EV fra BALF eksempel (Figur 4). Når like mye totalt protein (20 µg) fra BALF-EV prøven ble lastet inn, fant vi at UFC EVs uttrykt et høyere nivå av TSG101 enn UC-DGC EVs (Figur 4). Vi viste også at renheten av UFC-EV protein var akseptabelt, demonstrert av et enkelt isolert protein band.
Alle resultatene, Student t-test ble brukt for to-gruppen sammenligning. Resultatene presenteres som betyr ± SEM (standard feil av gjsnitt), og p < 0,05 ble ansett som viktig.
Figur 1: ultrafiltrasjon sentrifugering murine bronchoalveolar lavage væske (BALF)-avledede EVs viste en mer homogene størrelsesDistribusjon enn ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering på murine BALF-avledet Evens og hadde en betydelig høyere totale partikkel teller og protein innhold. Fordelingen av EV partikkelstørrelser ble målt ved hydrogenion sporing analyse (NTA) og total proteininnholdet ble målt ved bicinchoninic syre analysen. (A) UFC-BALF EVs' NTA størrelse distribusjon graf. (B) UC-DGC-BALF EVs' størrelse distribusjon graf. (C) Total partikkel telle ved NTA (mener ± SEM x 1010 partikler; * p < 0,05). (D) Total proteininnhold (i µg, * p < 0,05). Dataene var avledet fra tre uavhengige eksperimenter. UFC: ultrafiltrasjon sentrifugering; UC-DGC: ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering; EVs: ekstracellulære blemmer; SD: standardavvik; Kons: konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Murine bronchoalveolar lavage væske-avledet EVs isolert av ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metoder uttrykt tetraspanin proteiner, CD63, CD9 og CD81. Vist er prosentandeler av EVs farget positivt av UFC og UC-DCG isolasjon teknikker, illustrert av pseudofarger, det vil tomter, (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9, og (G - jeg) PE-CD9. Dataene er Hentet fra tre uavhengige eksperimenter. UFC = ultrafiltrasjon sentrifugering; UC-DGC = ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering; EVs = ekstracellulære blemmer; SSC-A = side scatter analyse; PE = phycoerythrin; FITC = fluorescein isothiocyanate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ultrafiltrasjon sentrifugering-isolert murine bronchoalveolar lavage væske-avledet EVs uttrykt en lignende fluorescerende tetthet av tetraspanin proteiner til ultracentrifugation-isolert EVs. (A og D) Histogram og geometriske gjennomsnittet uttrykk (gMFI) av PE-CD63+-farget EVs. (B og E) Histogram og gMFI av FITC-CD9+-farget EVs. (C og F) Histogram og gMFI av PE-CD81+-farget EVs. Disse dataene er avledet fra tre uavhengige eksperimenter. UFC: ultrafiltrasjon sentrifugering; UC-DGC = ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering; EVs: ekstracellulære blemmer; SSC-A: side scatter analyse; PE: phycoerythrin; FITC: fluorescein isothiocyanate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Murine bronchoalveolar lavage væske-avledet EVs isolert av ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metoder uttrykt exosome overflaten protein, TSG101. Dette panelet viser immunoblotting på murine BALF-avledet Evens TSG101 antistoffer (47 kDa). UFC = ultrafiltrasjon sentrifugering; UC-DGC = ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering; EVs = ekstracellulære blemmer; FT = gjennomflytsenhet; TSG = svulst mottakelighet genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Working løsning Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Fungerende løsning (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Homogenisering medium (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabell 1: høy tetthet gradert buffere. Denne tabellen gir komposisjon og buffer forholdet mellom hver gradert løsning som ble brukt til å rense murint bronchoalveolar lavage væske-avledet ekstracellulære vesicle bestander isolert av ultracentrifugation teknikken. * Arbeider løsningen var 50% iodixanol (25 mL av tetthet gradert medium [se Tabellen for materiale] + 5 mL fortynningsmiddel løsning [pH 7.4 0,25 M sukrose + 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl]). ** Homogenisering medium (pH 7.4 0,25 M sukrose + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)
| Metoder | Start volum (mL) | NTA* (x 108/μL) | Totalt partikler† (x1010) | Protein Kons‡ (µg/µL) | Totalt proteiner§ (µg) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29,4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0,5 ± 0,1 | 0,6 | 73.7 ± 38,3 |
Tabell 2: ultrafiltrasjon sentrifugering isolasjon metoden gitt en høy murine bronchoalveolar lavage væske-avledet ekstracellulære vesicle avkastning. Partikkel konsentrasjonen og totale partikkel teller ble målt ved hydrogenion sporing analyse (NTA). Protein konsentrasjonen og totale mengden protein ble målt ved en bicinchoninic syre protein analysen. * BALF EVs' partikkel konsentrasjon (gjennomsnittlig ± SEM x 108/μL fra tre uavhengige eksperimenter). † BALF EVs' totale partikkel (gjennomsnittlig ± SEM x 1010 partikler fra tre uavhengige eksperimenter). ‡ BALF EVs' protein konsentrasjon (gjennomsnittlig ± SEM µg/µL fra tre uavhengige eksperimenter). § BALF EVs' totale protein (gjennomsnittlig ± SEM mg fra tre uavhengige eksperimenter).
UFC: ultrafiltrasjon sentrifugering; UC-DGC: ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering; Kons: konsentrasjon. NTA: hydrogenion sporing analyse; SEM: standard feil av gjsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de siste tiårene, har forskere unraveled betydninger av EVs i mobilnettet homeostase. Enda viktigere, spille EVs viktige roller i mange sykdom prosesser ved modulerende nærliggende og fjerne celler gjennom deres bioaktive Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. fremtiden utvikling og fremgang i dette feltet dypt stole på pålitelige og effektive metoder som ikke bare identifisere og skille løser delsett av EV befolkninger, men også bevare deres biologiske funksjoner for nedstrøms programmer 10 , 11 , 14 , 31. i denne studien, vi beskrev en nanomembrane ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) metode for å isolere EVs fra musen BALF. I samsvar med andre rapporter viste vi at UFC er enkel og resulterer i en høy grad av utvinning avkastning og renhet, og er derfor egnet for små biologiske prøver10,17,18,32 .
UC-DGC er vanlig og anses å være gullstandarden teknikken EV isolering fordi det gir høyrenset EV partikler10,14. Men denne metoden er teknisk tungvint, tidkrevende, arbeidskrevende, og har lav skalerbarhet. Nyutviklet microfluidics-baserte teknikker overvinne disse begrensningene, men dette krever ytterligere godkjenning før det kan bli gjennomført som en alternativ metode33,34. Dermed trengs egnede metoder som de vanskelighetene uten at renhet og skalerbarhet av prøver sårt, spesielt for små volumer biologiske væske.
Vi viste at UFC bruker en nanomembrane filter enhet var effektive for EV isolasjon fra BALF eksemplarer. Resultatene presenteres her markere overlegenhet UFC prosedyren i forhold til gull standard UC-DGC metoden på grunn av sin enkelhet og høyere skalerbarhet. Den ultrafiltrasjon tilnærmingen har bli vidt adoptert for å isolere EV fra en rekke biologiske prøver: urin35, celle-conditioned media17og fosterets bovin serum36. Andre modulære basert på størrelse EV isolasjon teknikken som bruker ultrafiltrasjon som en plattform er exosome totalt chip (eksotiske)31. Denne metoden er også egnet for liten utvalgsstørrelsen prøver. Noen faktorer, som filteret materiale og porestørrelse av nanomembranes, må vurderes når du bruker UFC teknikken fordi de kan påvirke egenskapene for gjenopprettede EVs. For eksempel resulterte ulike typer filter membraner i forskjellige EV-assosiert RNA utvinning gir urin18. I denne studien vi viste at Spartments cellulose (RC) med en 10 kDa MWCO gitt høyeste mRNA uttrykk for NOP10, OST4, SNRPG, og TOMM7 forhold til Hydrosart 10 kDa eller polyethersulfone (PES) 10 kDa18. Vi viste videre at RC med 10 kDa hadde en høyere retentate EV utvinning enn 100 kDa. Andre har preget urin EVs Last innholdet som ble påvirket av isolasjon teknikker37. Vår studie viste at 100-kDa MWCO RC membran gitt en tilfredsstillende BALF-avledet EV avkastning med fordelen av mye mindre uønskede proteiner i retentate på grunn av større MWCO.
Denne studien viste at størrelser og størrelsesDistribusjon av UFC EVs var mindre og mer homogent distribuert enn UC-DGC EVs. Vesicle aggregering, som er vanlig med UC teknikker, kan forklare den dimensjon heterogenitet UC-DGC EVs38. Vi vurdert BALF-avledet EV renhet av oppdager EV membran proteiner TSG101, CD63, CD9 og CD81, som bekrefter tilstedeværelsen av exosomes i retentates. Vi og andre har også brukt TEM for å demonstrere morfologi av UFC EVs35,39,40,41. Liu et al. brukt en lignende ultrafiltrasjon tilnærming til å isolere EVs og sammenlignet med EVs isolert av ultracentrifugation, proteomic og transcriptomic profiler var lignende31. Således, beskriver vi en ultrafiltrasjon sentrifugering metoden bruker en Spartments cellulose membran med en MWCO av 100 kDa som en alternativ EV isolasjon som passer for små biologiske prøver som bronchoalveolar lavage væske.
Kritisk trinnene bruker denne UFC tilnærmingen for å isolere EVs fra biologiske væske inkluderer innledende nanoporous membran 0,2 µm filtrering for å sikre at beriket partikler i fjellkjeden exosomal størrelse og unngå å bruke ekstra kraft som kan skade eller deformere exosome morfologi og strukturer10,42. EVs kan følge membran filtrering, som resulterer i lavere skalerbarhet. Derfor bør volumet av prøven ikke overstige det anbefalte beløpet i hver filter enhet. Vi valgte å bruke Spartments cellulose, som ga en høyere mRNA avkastning urin-avledet EVs18. Typen filter membraner brukt kan forandre utvinning avkastning og type EVs. Til slutt, selv om en MWCO av 100 kDa bør fjerne mesteparten av proteiner i biologiske væsker, noen protein forurensninger som var større enn 100 kDa eller protein aggregater ble observert43. I dette tilfellet er en vask trinnet avgjørende for å minimere EV og protein aggregering. Videre må funksjonelle studier riktig kontrolleres for å fullt tolke resultatene, som ikke-EV-tilknyttede proteiner finnes i UFC EVs.
Vi konkludere med at UFC er en alternativ tilnærming som mulig for EV isolasjon for små eller større-volumer prøver. Tilgjengelig mikrofilteret enhetene rommer opptil 15 mL av prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet er støttet av NHLBI/NIH tilskudd HL103868 (for PC) og HL137076 (for PC), American Heart Association Grant-in-Aid (for PC) og Samuel Oschin omfattende Cancer Institute (SOCCI) lunge kreft forskning prisen (for PC). Vi ønsker å uttrykke vår stor takknemlighet til Smidt Heart Institute ved Cedars-Sinai Medical Center som gir oss en Nanosight maskin for EV hydrogenion sporing analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
