Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

doi: 10.3791/58310 Published: November 9, 2018

Summary

هنا، نحن تصف البروتوكولين من العزلة حويصلة خارج الخلية، أولترافيلتريشن الطرد المركزي وتنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي، لعزل حويصلات خارج الخلية من الغسل للفيسيولوجيا مورين عينات السوائل. الحويصلات خارج الخلية المستمدة من سائل الغسل للفيسيولوجيا مورين بكلتا الطريقتين كمياً وتتميز.

Abstract

حويصلات خارج الخلية (EVs) هي مكونات سوبسيلولار المكتشفة حديثا التي تلعب أدواراً هامة في البيولوجية العديد من الإشارات وظائف خلال الدول الفسيولوجية والمرضية. عزل المركبات الكهربائية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا في هذا المجال، بسبب القيود المتأصلة لكل تقنية. هو نهج استخداماً تنبيذ فائق التفاضلية مع أسلوب الطرد المركزي التدرج الكثافة ويعتبر الإجراء معيار الذهب لعزل EV. بيد أن هذا الإجراء هو مضيعة للوقت، وكثيفة العمالة، ويؤدي عادة في قابلية منخفضة، التي قد لا تكون مناسبة لعينات صغيرة الحجم مثل سائل الغسل للفيسيولوجيا. ونحن تبين أن أسلوب عزل الطرد المركزي أولترافيلتريشن بسيطة وفعالة من حيث الوقت والعمل يوفر الانتعاش عالية الغلة والنقاء. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب العزلة يمكن أن يكون نهج بديل مناسب لعزل EV، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية صغيرة الحجم.

Introduction

اكسوسوميس هي مجموعة فرعية أصغر من المركبات الكهربائية، 50 – 200 نانومتر في القطر، ولها وظائف متعددة والبيولوجية عبر مجموعة متنوعة من إشارات العمليات1،2،3،،من45. أنها تنظم الخلايا والأنسجة والتوازن أساسا بتيسير الاتصالات بين الخلايا عن طريق جزيئات البضائع مثل الدهون والبروتينات، والأحماض النووية6،،من78،9 . واحد خطوة حاسمة في البحث EV هو عملية العزل. التفضيلية تنبيذ فائق (UC), مع أو بدون كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)، يعتبر النهج معيار الذهب، ولكن هذا الأسلوب يحمل القيود الرئيسية، بما في ذلك عدم كفاية معدلات الاسترداد EV وقابلية منخفضة10 , 11 , 12، التي تقيد استخدامها أفضل إلى أكبر حجم العينات، مثل خلية ثقافة اكسوسومي طافية أو ارتفاع إنتاج العينات. مزايا وعيوب الأساليب الأخرى، مثل حجم الاستبعاد ultrafiltration أو اللوني، عزل إيمونوافينيتي بواسطة الخرز أو الأعمدة، وميكروفلويديكس، موصوفة جيدا، ووضعت إجراءات تكميلية الحديثة إلى التغلب عليها، وتقليل القيود التقنية في كل نهج12،،من1113،،من1415. البعض الآخر قد أظهرت أن أولترافيلتريشن الطرد المركزي (الوليد) بغشاء نانوبوروس في وحدة التصفية وهي تقنية بديلة يوفر النقاء مقارنة بتفرد أسلوب16،،من1718. يمكن اعتبار هذا الأسلوب أحد الأساليب البديلة العزلة.

للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) تحتوي على المركبات الكهربائية التي تمتلك العديد من الوظائف البيولوجية في مختلف ظروف الجهاز التنفسي19،،20،21،22. دراسة يستتبع المركبات الكهربائية المستمدة من بالف بعض التحديات بسبب اختزاع الإجراء القصبات في البشر، فضلا عن كمية محدودة من استعادة السوائل الغسل. في الحيوانات المختبرية الصغيرة مثل الفئران، ملليلتر قليلة فقط يمكن استردادها في الظروف العادية الرئة، وحتى أقل من ذلك في الرئتين ملتهبة أو تليفية23. وبالتالي فإن جمع كمية كافية من بالف لعزل EV تنبيذ فائق تفاضلية للتطبيقات المتلقين للمعلومات قد لا يكون ممكناً. ومع ذلك، عزل السكان EV الصحيح عاملاً حاسما لدراسة الوظائف البيولوجية EV. التوازن الدقيق بين الكفاءة والفعالية لا يزال يشكل تحديا في أساليب العزلة EV الراسخة.

في هذه الدراسة الحالية، ونحن تبين أن نهج ultrafiltration الطرد مركزي، استخدام كاتشين 100 وزن الجزيئي وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) نانوميمبراني تصفية وحدة، مناسبة للعينة البيولوجية صغيرة الحجم مثل بالف. هذا الأسلوب هو بسيط وفعال، ويوفر درجة نقاء عالية وقابلية لدعم دراسة المركبات الكهربائية المستمدة من بالف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قد أقر استخدام الحيوانات وجميع الإجراءات الحيوان "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك) في سيدرز-سيناء الطبي مركز (كسمك).

1-مورين للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) جمع وإعداد

  1. مجموعة بالف
    1. Euthanize الفئران مع مزيج من الكيتامين (300 ملغ/كغ) وإكسيلازيني (30 ملغ/كغ) عبر الطريق داخل متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. إدراج أنجيوكاثيتير ز 22 في القصبة الهوائية. إرفاق حقنه الأنسولين التي تحتوي على 1 مل (mL) من الفوسفات المالحة دولبيكو العقيمة المثلج المخزن المؤقت (دببس) وغرس 1 مل دببس إلى كلا الرئتين من خلال أنجيوكاثيتير.
    3. سحب المكبس حقنه استرداد بالف والاستغناء عن بالف في أنبوب 50 مل مخروطية ببطء. الحفاظ بالف على الجليد.
    4. كرر الخطوتين 1.1.2 و 1.1.3 3 x (x 4 في المجموع في كل الماوس).
      ملاحظة: يتم استرداد حوالي 0.8 مل عموما في المليلتر من تقطير. أيضا، يمكن تنفيذ الخطوات التالية للفئران الفردية (أي3 مل بالف)، ولكن تجميع عينات بالف متعددة تسمح عزلة دفعة أكبر من المركبات الكهربائية للاتساق في تجارب المتلقين للمعلومات.
  2. إعداد بالف
    1. تجمع بالف من الفئران 25 وتقسم إلى مجموعتين متساوية (~ 35 مل كل قاسمة).
    2. الطرد المركزي في بالف في ز 400 x، عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، لإزالة الخلايا وغيرها من الحطام الخلوية وجمع المادة طافية.
    3. الطرد المركزي المادة طافية في س 1,500 ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، لإزالة الحطام خلية. جمع المادة طافية والشروع في خطوات عزل EV.

2-عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل

ملاحظة: في هذه الدراسة، تقنيات العزل EV اثنين، هما الوليد وتنبيذ فائق مع ازدهار المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية من بالف. يرد أدناه وصف البروتوكول مفصلاً لكل أسلوب.

  1. أسلوب الإثراء الطرد المركزي (الوليد) أولترافيلتريشن
    ملاحظة: تم تعديل هذا الأسلوب من بروتوكول هو موضح سابقا10.
    1. تصفية المادة طافية من الخطوة 1.2.3 من خلال مرشح المحاقن معقمة 0.2 ميكرومتر، والحفاظ على بالف التي تمت تصفيتها على الجليد.
      ملاحظة: هذا خطوة استبعاد حجم موجبة فقط حويصلات أصغر من 200 تجمع شمال البحر الأبيض المتوسط.
    2. حجته وحدة الطرد المركزي تصفية موكو كاتشين 100 مع دببس العقيمة لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي وحدة الطرد المركزي في س 1,500 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية للتخلص من دببس.
      تنبيه: بمجرد الغشاء في جهاز عامل التصفية هو اكويليبراتيد مع دببس، الغشاء يجب إبقاء الرطب في كل وقت حتى يتم استخدام الجهاز.
    3. ملء وحدة التصفية مع 15 مل عينة بالف من الخطوة 2.1.1 وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. يمكن تجاهل بالف من خلال تدفق أو جمعها في أنبوب الكنسي منفصلة وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    4. كرر الخطوة 2.1.3 بالف تصفية ميكرومتر 0.2 المتبقية.
      ملاحظة: استغرق ثلاثة من التكرار من سينتريفوجيشنز التركيز بما فيه الكفاية EVs بالف من وحدة التخزين الأصلية ابتداء من 35 مل. وادي هذا إلى 1 – 1.5 مل ريتينتاتي.
    5. أغسل ريتينتاتي مع 14 مل دببس العقيمة من بلطف بيبيتينج متكررة. الطرد المركزي وحدة تصفية في 3,000 x ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، لإزالة دببس وتركيز ريتينتاتي EV.
    6. جمع المركبات المشتقة من بالف مركزة من جهاز تصفية بإدراج بيبيتور في الجزء السفلي من جهاز عامل تصفية وسحب العينة استخدام اقتراحا كاسحة جنبا إلى جنب لضمان الشفاء التام.
    7. قاسمة EVs المستمدة من بالف وتخزينها في-80 درجة مئوية لمزيد من التحديد الكمي الجسيمات وتوصيف (راجع الخطوة 3).
  2. تنبيذ فائق (UC) مع كثافة الطفو التدرج الطرد المركزي (DGC)
    ملاحظة: تم تعديل البروتوكول التالية من البروتوكول هو موضح سابقا24.
    1. نقل المادة طافية من الخطوة 2.1.1 في أنبوب ultracentrifuge 37 مل والطرد المركزي العينة في س 10,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أولتراسينتريفوجي. جمع المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. في حين يتم فصل الكريات EV، إعداد تركيزات مختلفة من كثافة الطفو التدرج المخازن المؤقتة (الجدول 1) لخطوة 2.2.3.
    2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات EV في 200 ميكروليتر من دببس.
    3. مزيج تعليق EV مع 300 ميكروليتر من حل عملي إيوديكسانول 50% (الجدول 1)، وأنه نقل إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي 15 مل. أعلى 50% إيوديكسانول--EV تعليق الخليط، طبقة تسلسلياً حل المخزن المؤقت التالية بالترتيب من الأسفل إلى الأعلى: 30% إيوديكسانول (4.5 مل)، 25% من إيوديكسانول (3 مل) و 15% إيوديكسانول (2.5 مل) 5% إيوديكسانول (6 مل). أجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 230.
      ملاحظة: يستند التدرج كثافة الطفو المئة من إيوديكسانول القياس مع تركيز أعلى (50%) في الجزء السفلي لأدنى تركيز (5%) في الجزء العلوي. لتوليد تركيزات مختلفة من إيوديكسانول، كميات مختلفة من متوسطة التجانس (الجدول 1) كانت مختلطة مع العامل الحل (إيوديكسانول 50%).
    4. جمع الكسر 15% و 25% وتمييع لهم في دببس العقيمة لإحضار وحدة التخزين إلى 15 مل. نقلها إلى أنبوب ultracentrifuge الصغيرة الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات EV في 50 ميكروليتر من دببس العقيمة لمزيد من الوصف.

3-خارج الخلية حويصلة القياس الكمي

ملاحظة: يتم quantitated العائد استرداد المركبات الكهربائية المستمدة من بالف مع اثنين من المقاييس.

  1. نانوحبيبات تتبع قياس التحليل (NTA)
    1. تمييع عينة EV في 1: 200 – 1: 500 في 1 مل دببس وتحميل العينة في محقن الأنسولين. إرفاق حقنه عينة لمضخة الحقن وتبدأ بقياس عدد الجسيمات وحجم (انظر الجدول للمواد).
    2. تعيين مستوى الكاميرا في 14 وعتبة الكشف في 1 لكل عينة القياسات. خمسة القياسات المتكررة مع إطارات 1,500 في 30 ثانية وسجلت لكل عينة، مع تأخير 20 s بين القراءات. الجمع ومتوسط البيانات الخاصة بتركيز نهائي وحجم التقارير.
      ملاحظة: لدقة التقاط جميع الجسيمات، ضبط مستوى الكاميرا حسب الاقتضاء لتصور جميع الجزيئات واستخدام إعدادات مماثلة لجميع القياسات عينة في كل تجربة.
  2. تقدير البروتين
    ملاحظة: استخدمت مقايسة البروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك لقياس تركيز البروتين EVs المستمدة من بالف.
    1. جعل العينات EV في المخزن المؤقت لتحلل x 1.
    2. تحديد مقدار البروتين في EVs المستمدة من بالف كل بروتوكول اتفاق التعاون الأساسي القياسية باستخدام الكشف عن قياس الألوان عن طريق قياس امتصاص في 560 نانومتر في قارئ لوحة.

4-الكشف عن حويصلات خارج الخلية المستمدة من بالف

ملاحظة: استخدمت البروتينات السطحية العلامة المعروفة اكسوسومي (TSG101، CD63، CD81، و CD9) للتحقق من المبالغ المستردة EV بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج والتدفق الخلوي التحليل.

  1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting
    1. حل مبلغ مساو من البروتينات EV كل عينة مع قم تحميل المخزن المؤقت (الليثيوم دوديسيل كبريتات) و 50 مم ديثيوثريتول (DTT) في أنبوب 1.6 مل. الحرارة العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. تحميل العينات من الخطوة 4.1.1 إلى % 4 – 12 مكررا-تريس "بالإضافة إلى" هلام اكريلاميد وتشغيل التفريد (150 فولت، 35 mA) لمدة 35 دقيقة.
    3. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز تستخدم أسلوب نقل جافة.
    4. كتلة الغشاء باللبن المقشود 5% ل 60 دقيقة، التأرجح في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. احتضان الغشاء مع جسم مضاد لعلامة بروتين سطحي EV، الورم قابلية الجينات 101 (TSG101)، في تمييع 1: 500 في جيش صرب البوسنة 5% في تريس مخزنة المالحة توين-20 (تبسة) في 4 درجات مئوية، التأرجح بين عشية وضحاها.
    6. وفي اليوم التالي يغسل الغشاء 3 × 10 دقيقة كل غسل، في المخزن المؤقت تبسة، واحتضان أنه مع أرنب المضادة IgG، جسم مرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية، في إضعاف 1:5,000 لمدة 60 دقيقة في الرايت
    7. يغسل الغشاء 3 × 10 دقيقة كل غسل، في المخزن المؤقت تبسة. وضع الغشاء مع تشيميلومينيسسينت HRP كاشف الكشف عن الأجسام المضادة والصورة (انظر الجدول للمواد لنظام التصوير).
  2. التدفق الخلوي
    1. تمييع المستمدة من بالف المركبات الكهربائية في ميكروليتر 49 الكراك تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + يدتا 5 مم + 0.5% جيش صرب البوسنة، التي تمت تصفيتها من خلال غشاء تصفية حقنه 0.1 ميكرومتر).
    2. إضافة كل من الأجسام المضادة التالية في كل عينة فردية: 1) جسم PE CD63 الماوس لمكافحة الفئران (100 نانوغرام كل رد الفعل)؛ 2) الفئران الماوس المضادة PE CD81 (500 نانوغرام)؛ 3) الماوس لمكافحة الفئران CD9 فيتك (200 نانوغرام). احتضان عند 4 درجة مئوية، هزاز لمدة 60 دقيقة في الظلام.
    3. تمييع العينات مع ميكروليتر 450 تصفية الأغشية الكراك تلطيخ المخزن المؤقت وإخضاع العينات لتحليل التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد)25.
    4. ضبط إعدادات سيتوميتير التدفق على النحو التالي: 1) تعيين جميع القنوات على سجل فرط (هلوج)؛ 2) تعيين المشغل على التعاون بين بلدان الجنوب في 4؛ 3) إيقاف تشغيل المشغل الثانوي. تشغيل العينات في وضع السرعة المنخفضة وتكتسب الأحداث 10,000 على الأقل في كل عينة.
    5. القيام بتحليل البيانات الخلوي منخفضة في كل عينة باستخدام برمجيات التحليل (انظر الجدول للمواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن يتم عزل EV من الماوس بالف باستخدام أساليب عزل الوليد وجامعة كاليفورنيا-DGC في نفس اليوم. يتطلب الأسلوب الوليد حوالي 2.5 – 3 ح، حين يتطلب تقنية الاتصالات الموحدة--DGC 8 ح الوقت اللازم للتجهيز. هذا لا يشمل المخازن المؤقتة وكاشف إعداد الوقت. تجدر الإشارة إلى أن بعض المهام الأخرى يمكن أن تتم خلال فترات طويلة من الطرد المركزي. ومع ذلك، استمرت الإجراءات بأكملها تقريبا يوم كامل لتقنية العزل UC-DGC.

عرض EVs بالف المستمدة من الفئران الطبيعية المعزولة بواسطة الأسلوب الوليد حجم أصغر وأكثر توحيدا حجم توزيع (148.8 ± 1.1 نانومتر، الشكل 1A) مقارنة بتفرد DGC "المركبات الكهربائية" (176.7 ± 7.8 نانومتر، الشكل 1B). تقنية الوليد قد عميق 65-fold أكبر من الجسيمات مجموع التهم عند مقارنتها بالعزلة UC-DGC (29.4 ± 18.4 مقابل 0.5 ± 0.1 × 1010 الجسيمات؛ ف < 0.05؛ الجدول 2 و الشكل 1). مجموع البروتين انتعاش (ميكروغرام) من "المركبات الكهربائية الوليد" كان أيضا أعلى (± 1,860 3,136 مقابل 73.7 ± 38.3 ميكروغرام؛ ف < 0.05؛ الجدول 2 و الشكل 1). وهكذا، الوليد فعالة من حيث الوقت والجهد وتوفر عائد EV أعلى.

كذلك تميز phenotypically EV المستمدة من بالف السكان، قمنا بفحص وجود علامات البروتين السطحي اكسوسومي المعروفة: CD63، CD9، و CD81 بالتدفق الخلوي و TSG101 إيمونوبلوتينج. باستخدام تحليل التدفق الخلوي، أثبتنا أن الوليد المركبات الكهربائية والمركبات الكهربائية UC-DGC أعربت عن CD63 (الشكل 2A -ج 2)، CD9 (الشكل 2D -2F)، و CD81 (الشكل 2 -2 طاء). تعبير هندسي (جمفي) CD63 و CD9 و CD81 وكان كمياً ولا تختلف إحصائيا بين الشرطين (الشكل 3 ألف -3F).

بعد ذلك، قمنا بفحص آخر EV البروتين ماركر، TSG101، من إيمونوبلوتينج. لقد أظهرنا أن 20 ميكروغرام من التدفق من خلال عينة الوليد (الوليد-قدم) لا يتضمن البروتينات TSG101، مما يوحي بأن تقنية عزل الوليد تحديد كفاءة والإبقاء على السكان EV من العينة بالف (الشكل 4). عندما تم تحميل كميات متساوية من البروتين الكلي (20 ميكروغرام) من عينة بالف--EV، وجدنا أن "المركبات الكهربائية الوليد" أعرب عن مستوى أعلى من TSG101 من جامعة كاليفورنيا-DGC "المركبات الكهربائية" (الشكل 4). نحن أظهرت أيضا أن نقاء البروتين الوليد--EV مقبولة، يتبين من عصابة واحدة من بروتين معزولة.

لكل النتائج، الطالب t-تم استخدام اختبار للمقارنة بين المجموعتين. وترد النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة (الخطأ المعياري للوسط)، واعتبر ف < 0.05 كبيرة.

Figure 1
رقم 1: الطرد المركزي Ultrafiltration للفيسيولوجيا مورين الغسل السائل (بالف)--المركبات الكهربائية المشتقة أظهر توزيع حجم أكثر تجانساً من تنبيذ فائق مع كثافة الطرد المركزي التدرج من المركبات الكهربائية مورين المستمدة من بالف، وقد أعلى بكثير من المحتوى العد والبروتين مجموع الجسيمات. توزيع أحجام الجسيمات EV تم قياسه بواسطة نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA)، وتم قياس محتوى البروتين الكلي بمقايسة حمض بيسينتشونينيك. الإدارة الوطنية للسياحة حجم التوزيع الرسم البياني (أ) الوليد-بالف EVs. حجم الرسم البياني (ب) UC-DGC-بالف "المركبات الكهربائية" التوزيع. (ج) مجموع الجسيمات العد بالإدارة الوطنية للسياحة (يعني ± SEM x 1010 جسيمات؛ * p < 0.05). (د) مجموع البروتين (في ميكروغرام، * p < 0.05). البيانات مستمدة من ثلاث تجارب مستقلة. الوليد: أولترافيلتريشن الطرد المركزي؛ جامعة كاليفورنيا-DGC: تنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي؛ المركبات الكهربائية: حويصلات خارج الخلية؛ التنمية المستدامة: الانحراف المعياري؛ الزيركونيم: تركيز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الغسل للفيسيولوجيا مورين السوائل المستمدة من المركبات الكهربائية المعزولة بالطرد المركزي أولترافيلتريشن، وأعرب عن تنبيذ فائق مع أساليب الطرد المركزي التدرج كثافة البروتينات تيتراسبانين CD63 و CD9 و CD81- تظهر النسب المئوية للمركبات الكهربائية ملطخة إيجابية بتقنيات عزل الوليد وجامعة كاليفورنيا-دوجلاس، يتضح من المؤامرات بسيودوكولور، (أ - ج) PE-CD63، (د - و) CD9 فيتك، و (ز -- أنا) PE CD9. يتم اشتقاق البيانات من ثلاث تجارب مستقلة. الوليد = أولترافيلتريشن الطرد المركزي؛ جامعة كاليفورنيا-DGC = تنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي؛ المركبات الكهربائية = حويصلات خارج الخلية؛ SSC-A = الجانب مبعثر التحليل؛ PE = فيكوريثرين؛ فيتك = fluorescein isothiocyanate. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الغسل الطرد المركزي-المعزولة للفيسيولوجيا مورين Ultrafiltration السوائل المستمدة من المركبات الكهربائية أعرب عن كثافة فلورسنت مماثلة من البروتينات تيتراسبانين للمركبات الكهربائية المعزولة تنبيذ فائق. (ألف و دال) التعبير المدرج التكراري والوسط الهندسي (جمفي) من PE-CD63+-الملون المركبات الكهربائية. (باء و هاء) المدرج التكراري وجمفي فيتك-CD9+-الملون المركبات الكهربائية. (C و F) المدرج التكراري وجمفي PE-CD81+-الملون المركبات الكهربائية. هذه البيانات مستمدة من ثلاث تجارب مستقلة. الوليد: أولترافيلتراتيون الطرد المركزي؛ جامعة كاليفورنيا-DGC = تنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي؛ المركبات الكهربائية: حويصلات خارج الخلية؛ تحليل مبعثر الجانب ج: التعاون بين بلدان الجنوب؛ PE: فيكوريثرين؛ فيتك: fluorescein isothiocyanate. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الغسل للفيسيولوجيا مورين السوائل المستمدة من المركبات الكهربائية المعزولة بالطرد المركزي أولترافيلتريشن وأعرب تنبيذ فائق مع أساليب الطرد المركزي التدرج كثافة البروتين السطحي اكسوسومي، TSG101. ويبين هذا الفريق إيمونوبلوتينج المركبات المشتقة من بالف مورين لجسم TSG101 (كاتشين 47). الوليد = أولترافيلتريشن الطرد المركزي؛ جامعة كاليفورنيا-DGC = تنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي؛ المركبات الكهربائية = حويصلات خارج الخلية؛ متر = التدفق عبر؛ TSG = الورم قابلية الجينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

يعمل الحل إيوديكسانول (%) 5 15 25 30
حل العامل (mL)* 2 6 10 12
متوسطة التجانس (mL)* 18 14 10 8

الجدول 1: كثافة الطفو التدرج المخازن المؤقتة. ويعطي هذا الجدول نسبة تكوينها والمخزن المؤقت لكل حل التدرج الذي تم استخدامه لتنقية الغسل للفيسيولوجيا موريني المستمدة من السوائل خارج الخلية حويصلة السكان معزول بواسطة الأسلوب تنبيذ فائق. * الحل العامل كان إيوديكسانول 50% (25 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار [انظر الجدول للمواد] + 5 مل من محلول مادة [الأس الهيدروجيني 7.4 من السكروز 0.25 متر + 120 مم حبيس 0.9 م كلوريد الصوديوم]). * * التجانس المتوسطة (درجة الحموضة 7.4 من السكروز 0.25 م + 20 مم حبيس 150 مم كلوريد الصوديوم)

أساليب بدء تشغيل وحدة التخزين (mL) الإدارة الوطنية للسياحة* (x 108بينما) مجموع الجسيمات(x1010) بروتين الزيركونيم (ميكروغرام/ميليلتر) مجموع البروتينات§ (ميكروغرام)
الوليد 35 7.69 ± 2.6 29.4 ± 18.4 3.7 3,136 ± 1860
جامعة كاليفورنيا-DGC 35 0.5 ± 0.05 0.5 ± 0.1 0.6 73.7 ± 38.3

الجدول 2: طريقة العزل الطرد المركزي ultrafiltration قدم غسل للفيسيولوجيا مورين عالية عائد المستمدة من السوائل خارج الخلية حويصلة. كانت تقاس بتركيز الجسيمات والجسيمات مجموع عدد نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA). تم قياس تركيز البروتين والمبلغ الإجمالي للبروتين بها مقايسة بروتين حمض بيسينتشونينيك. * تركيز بالف EVs الجسيمات (يعني ± ووزارة شؤون المرأة x 108بينما من ثلاث تجارب مستقلة).  مجموع الجسيمات بالف EVs (يعني ± ووزارة شؤون المرأة × 1010 جزيئات من ثلاث تجارب مستقلة).  تركيز بالف EVs البروتين (يعني ± SEM ميكروغرام/ميليلتر من ثلاث تجارب مستقلة). § مجموع البروتين بالف EVs (يعني ± SEM مغ من ثلاث تجارب مستقلة).
الوليد: أولترافيلتريشن الطرد المركزي؛ جامعة كاليفورنيا-DGC: تنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي؛ الزيركونيم: تركيز؛ الإدارة الوطنية للسياحة: نانوحبيبات تتبع التحليل؛ وزارة شؤون المرأة: الخطأ المعياري للوسط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في العقود القليلة الماضية، وقد متدهور العلماء دلالات من المركبات الكهربائية في التوازن الخلوية. الأهم من ذلك، تؤدي المركبات الكهربائية أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض العمليات بتحوير الخلايا المجاورة والبعيدة من خلال تلك الشحنات النشطة بيولوجيا الجزيئات1،21،22،،من2627 , 28 , 29 , 30-مستقبل التنمية والتقدم في هذا المجال عميقا الاعتماد على موثوقية وكفاءة الأساليب التي ليس فقط تحديد وفصل تصحيح المجموعات فرعية سكان EV ولكن أيضا الحفاظ على وظائفها البيولوجية للتطبيقات المتلقين للمعلومات 10 , 11 , 14 , 31-في الدراسة الحالية، ويمكننا وصف أسلوب الطرد المركزي (الوليد) أولترافيلتريشن نانوميمبراني لعزل المركبات الكهربائية من الماوس بالف. في التوافق مع غيره من التقارير، واظهرنا أن الوليد بسيطة والنتائج في الانتعاش عالية الغلة والنقاء، وبالتالي، بمناسبة للعينات البيولوجية الصغيرة10،،من1718،32 .

ويشيع استخدام UC-DGC وتعتبر تقنية معيار الذهب لعزل EV لأنها توفر عالية المنقي EV جسيمات10،14. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو مرهقة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً، وكثيفة العمالة، وقابلية منخفضة. التقنيات المطورة حديثا على أساس ميكروفلويديكس التغلب على هذه القيود، ولكن هذا النهج يتطلب كذلك التحقق من الصحة قبل أن يمكن تنفيذها تماما كما أسلوب بديل33،34. وهكذا، الأساليب المناسبة التي تستوعب هذه الصعوبات دون المساس بالنقاء وقابلية لعينات من حاجة ماسة إلى، خاصة بالنسبة للسوائل البيولوجية صغيرة الحجم.

أثبتنا أن الوليد باستخدام جهاز تصفية نانوميمبراني كان فعالاً لعزل EV من العينات بالف. وتبرز النتائج المعروضة هنا تفوق الإجراء الوليد بالمقارنة مع معيار الذهب الأسلوب UC-DGC نظراً لبساطته وقابلية أعلى. أن النهج القائم على أولترافيلتريشن تصبح اعتمدت على نطاق واسع لعزل EV من مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية: البول35ومكيفة خلية الإعلام17والجنين المصل البقري36. أخرى وحدات على أساس حجم EV العزلة الأسلوب الذي يستخدم أولترافيلتريشن كمنبر هو اكسوسومي عزلة تامة رقاقة (الغريبة)31. هذا الأسلوب أيضا مناسبة لعينات صغيرة من حجم العينة. عدد قليل من العوامل، مثل عامل تصفية المواد وحجم المسام نانوميمبرانيس، تحتاج إلى وضعها في الاعتبار عند استخدام تقنية الوليد لأنها قد تؤثر على خصائص المركبات الكهربائية المستردة. على سبيل المثال، أدت إلى أنواع مختلفة من تصفية الأغشية EV المرتبطة الحمض النووي الريبي الانتعاش غلة مختلفة من البول18. في هذه الدراسة، واظهرنا أن السيليلوز المجددة (اتفاقية روتردام) مع 10 كاتشين موكو قدم التعبير مرناً أعلى من NOP10، OST4، سنربج، و TOMM7 بالمقارنة إلى كاتشين 10 هيدروسارت، أو بولييثيرسولفوني (PES) من 10 كاتشين18. كذلك أثبتنا أن اتفاقية روتردام مع كاتشين 10 انتعاش EV ريتينتاتي أعلى من كاتشين 100. أخرى اتسمت البول محتويات شحن المركبات الكهربائية التي تأثرت بالنوع من العزلة تقنيات37. وأظهرت دراستنا أن الغشاء RC موكو كاتشين 100 قدم عائد EV المستمدة من بالف مرضية مع استفادة البروتينات غير المرغوب فيها أقل بكثير في ريتينتاتي بسبب موكو أكبر.

أظهرت هذه الدراسة أن أحجام والحجم توزيع "المركبات الكهربائية الوليد" كانت أصغر حجماً وأكثر البلوتينيوم الموزعة من تلك "المركبات الكهربائية" UC-DGC. التجميع حويصلة، ومشتركة مع تقنيات الاتصالات الموحدة، قد يفسر عدم تجانس البعد EVs UC-DGC38. قمنا بتقييم نقاء EV المستمدة من بالف عن طريق الكشف عن بروتينات الغشاء EV TSG101، CD63، CD9، و CD81، مما يؤكد وجود اكسوسوميس في ريتينتاتيس. نحن وآخرون استخدمت أيضا تيم لإثبات مورفولوجية "الوليد المركبات الكهربائية"35،39،،من4041. ليو وآخرون استخدام نهج قائم على أولترافيلتريشن مماثلة لعزل المركبات الكهربائية، وعند مقارنة بالمركبات الكهربائية معزولة بواسطة تنبيذ فائق، التشكيلات الجانبية البروتين وترانسكريبتوميك كانت مماثلة31. وهكذا يصف لنا أسلوب الطرد المركزي ultrafiltration استخدام غشاء السليولوز المجددة مع موكو كاتشين 100 كأسلوب عزل EV بديل مناسب لعينات السوائل البيولوجية صغيرة مثل سائل الغسل للفيسيولوجيا.

وتشمل الخطوات الحرجة باستخدام هذا النهج الوليد لعزل المركبات الكهربائية من السوائل البيولوجية الترشيح ميكرومتر غشاء 0.2 نانوبوروس الأولية التأكد من أن الجزيئات المخصب في نطاق حجم اكسوسومال، وتجنب استعمال القوة الإضافية التي يمكن أن تلف أو تشوه اكسوسومي مورفولوجيا وهياكل10،42. المركبات الكهربائية يمكن أن تنضم إلى غشاء الترشيح، مما يؤدي إلى انخفاض قابلية. ولذلك، ينبغي أن لا يتجاوز حجم العينة المبلغ الموصى به في كل نوع من وحدة التصفية. لقد اخترنا لاستخدام السيليلوز المجددة، التي وفرت عائد مرناً أعلى من المركبات الكهربائية المستمدة من البول18. يمكن تغيير النوع من تصفية الأغشية المستخدمة الغلة الانتعاش ونوع من المركبات الكهربائية. وأخيراً، على الرغم من موكو كاتشين 100 ينبغي القضاء على غالبية البروتينات في السوائل البيولوجية، لوحظت بعض الملوثات البروتين التي كانت أكبر من 100 المجاميع كاتشين أو بروتين43. وفي هذه الحالة، خطوة غسيل الحاسم للحد من التراكم EV والبروتين. وعلاوة على ذلك، الدراسات الفنية يجب أن بشكل صحيح تسيطر من أجل تفسير النتائج، تماما كما تكون البروتينات المرتبطة EV غير موجودة في EVs الوليد.

ونحن نستنتج أن الوليد نهج بديل ممكن لعزل EV لعينات صغيرة أو كبيرة الحجم. يمكن أن تستوعب الوحدات المتوفرة حاليا ميكروفيلتير تصل إلى 15 مل عينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

العمل معتمد من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI HL103868 (للكمبيوتر) و HL137076 (على الكمبيوتر)، ومعونات جمعية القلب الأمريكية (للكمبيوتر) وجائزة البحث معهد السرطان الشامل صامويل أوشين (سوتشي) سرطان الرئة (للكمبيوتر). ونود أن نعرب عن تقديرنا الكبير لمعهد القلب سميت في سيدرز-سيناء الطبي أن يوفر لنا آلة Nanosight نانوحبيبات EV تتبع تحليل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20 G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany -
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA -
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK - To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany -
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA -
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285, (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21, (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126, (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113, (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9, (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6, (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87, (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7, (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7, (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7, (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23, (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67, (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72, (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77, (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78, (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11, (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16, (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12, (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292, (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7, (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120, (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4, (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, (6), 1985-1991 (1999).
عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).More

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter