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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

एक Ultrafiltration केंद्रापसारक तकनीक का उपयोग Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव से Extracellular बुलबुले के अलगाव

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58310
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

यहां, हम दो extracellular पुटिका अलगाव प्रोटोकॉल, ultrafiltration केंद्रापसारक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation, extracellular murine bronchoalveolar द्रव के नमूनों से लेवेज बुलबुले अलग वर्णन । दोनों तरीकों से murine bronchoalveolar लेवेज द्रव से व्युत्पंन extracellular बुलबुले quantified और विशेषता हैं ।

Abstract

Extracellular बुलबुले (ईवीएस) नए शारीरिक और रोग राज्यों के दौरान कई जैविक संकेतन कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा है कि सेलुलर घटकों की खोज कर रहे हैं । ईवीएस के अलगाव के लिए इस क्षेत्र में एक बड़ी चुनौती है, प्रत्येक तकनीक को आंतरिक सीमाओं के कारण जारी है । घनत्व ढाल केंद्रापसारक विधि के साथ अंतर ultracentrifugation एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है और EV अलगाव के लिए सोने के मानक प्रक्रिया माना जाता है । हालांकि, इस प्रक्रिया को समय लेने वाली, श्रम गहन है, और आम तौर पर कम दरिद्रता में परिणाम है, जो bronchoalveolar लेवेज द्रव जैसे छोटे मात्रा के नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । हम प्रदर्शित करते है कि एक ultrafiltration केंद्रापसारक अलगाव विधि सरल और समय है और श्रम कुशल अभी तक एक उच्च वसूली उपज और पवित्रता प्रदान करता है । हम प्रस्ताव है कि इस अलगाव विधि एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि EV अलगाव के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से छोटी मात्रा के जैविक नमूनों के लिए हो सकता है ।

Introduction

Exosomes व्यास में ईवीएस, 50-200 एनएम के सबसे छोटे सबसेट हैं, और प्रक्रियाओं1,2,3,4,5संकेतन की एक विविध सरणी भर में कई जैविक कार्य किया है । वे लिपिड, प्रोटीन, और न्यूक्लिक एसिड6,7,8,9 जैसे कार्गो अणुओं के माध्यम से सेलुलर संचार की सुविधा के द्वारा मुख्य रूप से सेलुलर और ऊतक homeostasis को नियंत्रित . एक EV अनुसंधान में महत्वपूर्ण कदम अलगाव की प्रक्रिया है । अंतर ultracentrifugation (यूसी), के साथ या बिना घनत्व ढाल केंद्रापसारक (क्लब), सोने के मानक दृष्टिकोण माना जाता है, लेकिन इस विधि अकुशल EV वसूली दरों और कम दरिद्रता सहित प्रमुख सीमाओं वहन करती है10 , 11 , 12, कि इस तरह के सेल संस्कृति supernatant या उच्च exosome उत्पादन नमूनों के रूप में बड़ी मात्रा के नमूनों के लिए अपने सबसे अच्छा उपयोग को प्रतिबंधित । ऐसे ultrafiltration या क्रोमैटोग्राफी द्वारा आकार अपवर्जन के रूप में अंय तरीकों के फायदे और नुकसान, मोतियों या स्तंभों द्वारा immunoaffinity अलगाव, और microfluidics, अच्छी तरह से वर्णित हैं, और आधुनिक पूरक प्रक्रियाओं को विकसित किया गया है पर काबू पाने और प्रत्येक दृष्टिकोण11,12,13,14,15में तकनीकी सीमाओं को कम । दूसरों को पता चला है कि फिल्टर इकाई में एक nanoporous झिल्ली के साथ एक ultrafiltration केंद्रापसारक (UFC) एक वैकल्पिक तकनीक है कि एक यूसी विधि16,17,18के लिए तुलनीय पवित्रता प्रदान करता है । इस तकनीक को वैकल्पिक आइसोलेशन विधियों में से एक माना जा सकता है ।

Bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) ईवीएस है कि विभिंन श्वसन शर्तों19,20,21,22में कई जैविक कार्यों के अधिकारी शामिल हैं । BALF का अध्ययन-व्युत्पंन ईवीएस मनुष्यों में ब्रोंकोस्कोपी प्रक्रिया की इनवेसिव के कारण कुछ चुनौतियों पर जोर देता है, साथ ही लेवेज द्रव वसूली की एक सीमित मात्रा में । चूहों जैसे छोटे प्रयोगशाला पशुओं में, केवल कुछ मिलीलीटर सामान्य फेफड़ों की स्थितियों में बरामद किया जा सकता, सूजन या fibrotic फेफड़ों में भी कम23. नतीजतन, बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक अंतर ultracentrifugation द्वारा EV अलगाव के लिए BALF की एक पर्याप्त राशि का संग्रह संभव नहीं हो सकता है । हालांकि, अलग सही ev आबादी ev जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । कार्यकुशलता और प्रभावकारिता के बीच नाजुक संतुलन अच्छी तरह से स्थापित EV आइसोलेशन तरीकों में एक चुनौती है ।

इस वर्तमान अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते है कि एक केंद्रापसारक ultrafiltration दृष्टिकोण, एक १०० केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) nanomembrane फिल्टर इकाई का उपयोग, छोटी मात्रा जैविक नमूना जैसे BALF के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक को सरल, कुशल है, और उच्च शुद्धता और दरिद्रता प्रदान करता है BALF-व्युत्पंन ईवीएस के अध्ययन का समर्थन है ।

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Protocol

देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर (CSMC) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) द्वारा पशुओं और सभी पशु प्रक्रियाओं की उपयोगिता को मंजूरी दी गई ।

1. Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) संग्रह और तैयारी

  1. BALF संग्रह
    1. ग्रीवा विस्थापन के बाद intraperitoneal मार्ग के माध्यम से ketamine (३०० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (30 मिलीग्राम/किग्रा) के कॉकटेल के साथ चूहों को Euthanize ।
    2. श्वासनली में 22 ग्राम angiocatheter डालें । एक इंसुलिन के साथ 1 मिलीलीटर (मिलीलीटर) बर्फ ठंड बाँझ Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) और angiocatheter के माध्यम से दोनों फेफड़ों में DBPS के 1 मिलीलीटर टपकाना से अनुलग्न करें ।
    3. धीरे BALF पुनः प्राप्त करने के लिए सिरिंज गोताख़ोर वापस लेने और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में BALF वितरण । बर्फ पर BALF रखें ।
    4. दोहराएँ कदम 1.1.2 और 1.1.3 3x (प्रत्येक माउस में कुल 4x).
      नोट: लगभग ०.८ मिलीलीटर आम तौर पर प्राप्त प्रति milliliter की जगाकर है । इसके अलावा, निम्नलिखित चरणों व्यक्तिगत चूहों के लिए किया जा सकता है (यानी, BALF के 3 मिलीलीटर), लेकिन कई BALF नमूने पूलिंग बहाव के प्रयोगों में निरंतरता के लिए ईवीएस का एक बड़ा बैच के अलगाव की अनुमति देगा.
  2. BALF तयारी
    1. पूल 25 चूहों से BALF और दो बराबर सेट (~ ३५ एमएल प्रति aliquot) में विभाजित ।
    2. ४०० x जी पर BALF, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, कोशिकाओं और अंय सेलुलर मलबे को हटाने और supernatant इकट्ठा करने के लिए ।
    3. १,५०० x जी पर supernatant, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, सेल मलबे को दूर करने के लिए । supernatant इकट्ठा और EV अलगाव कदम के लिए आगे बढ़ना ।

2. Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव से Extracellular बुलबुले के अलगाव

नोट: इस अध्ययन में, दो EV अलगाव तकनीक, अर्थात् UFC और BALF से ईवीएस को अलग करने के लिए इस्तेमाल बोया के साथ ultracentrifugation । प्रत्येक विधि का विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है ।

  1. Ultrafiltration केंद्रापसारक (UFC) संवर्धन विधि
    नोट: यह विधि पहले वर्णित प्रोटोकॉल10से संशोधित किया गया था ।
    1. एक ०.२ माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कदम 1.2.3 से supernatant फ़िल्टर और बर्फ पर फ़िल्टर्ड BALF रखें.
      नोट: यह केवल २०० एनएम से छोटे बुलबुले एकत्र कर रहे हैं जिससे एक आकार अपवर्जन कदम है.
    2. Equilibrate १०० केडीए MWCO केंद्रापसारक फिल्टर इकाई के साथ बाँझ DPBS के लिए 10 min. केंद्रापसारक इकाई में १,५०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के DPBS को त्यागने के लिए.
      चेतावनी: एक बार फिल्टर डिवाइस में झिल्ली DPBS के साथ equilibrated है, झिल्ली हर समय गीला रखा जाना चाहिए जब तक डिवाइस का उपयोग किया जाता है ।
    3. BALF नमूना के 15 मिलीलीटर से कदम 2.1.1 और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक के साथ फिल्टर इकाई भरें । प्रवाह-के माध्यम से BALF छोड़ दिया जा सकता है या एक अलग विहित ट्यूब में एकत्र और भविष्य के उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    4. दोहराएं चरण 2.1.3 शेष ०.२ µm-फ़िल्टर्ड BALF के लिए ।
      नोट: यह ३५ मिलीलीटर की मूल शुरू मात्रा से पर्याप्त रूप से BALF ईवीएस ध्यान केंद्रित करने के लिए केंद्रापसारक के तीन पुनरावृत्तियों लिया । यह retentate के 1-1.5 मिलीलीटर में हुई ।
    5. एक धीरे pipetting द्वारा बाँझ DPBS के 14 मिलीलीटर के साथ retentate धो दोहराए । ३,००० x जी पर फिल्टर इकाई, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, DPBS को दूर करने के लिए और EV retentate ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
    6. फिल्टर डिवाइस के तल में एक pipettor डालने और कुल वसूली सुनिश्चित करने के लिए एक पक्ष के पक्ष व्यापक गति का उपयोग नमूना वापस लेने के द्वारा फिल्टर डिवाइस से केंद्रित BALF-व्युत्पन्न ईवीएस लीजिए.
    7. Aliquot BALF-व्युत्पंन ईवीएस और उन पर दुकान-८० ° c आगे कण ठहराव और लक्षण वर्णन के लिए (चरण 3 देखें) ।
  2. Ultracentrifugation (यूसी) के साथ बोया घनत्व ढाल केंद्रापसारक (क्लब)
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल पहले वर्णित प्रोटोकॉल24से संशोधित किया गया था ।
    1. एक ३७ मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में कदम 2.1.1 से supernatant स्थानांतरण और 4 ° c ultracentrifuge का उपयोग कर में 30 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant लीजिए और १००,००० x g पर, ६० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । EV छर्रों केंद्रापसारक हैं, जबकि कदम 2.2.3 के लिए बोया घनत्व ढाल बफ़र्स (1 तालिका) के विभिंन सांद्रता तैयार करते हैं ।
    2. supernatant को त्यागें और DPBS के २०० μL में EV छर्रों को फिर से सस्पेंड करें ।
    3. ३०० μL के साथ EV सस्पेंशन को ५०% iodixanol वर्किंग सॉल्यूशन (Table 1) के साथ मिलाएं और इसे 15 एमएल ultracentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें । ५०% iodixanol के शीर्ष पर-EV मिश्रण निलंबन, क्रमिक रूप से निम्न बफ़र समाधान क्रम में नीचे से शीर्ष पर लेयर: 30% iodixanol (४.५ मिलीलीटर), 25% iodixanol (3 एमएल), 15% iodixanol (२.५ मिलीलीटर), और 5% iodixanol (6 मिलीलीटर) । १००,००० x जी पर, २३० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
      नोट: बोया घनत्व ढाल iodixanol के प्रतिशत पर आधारित है उच्चतम एकाग्रता के साथ (सबसे कम एकाग्रता के लिए नीचे ५०%) (शीर्ष पर 5%) । iodixanol के विभिंन सांद्रता उत्पंन करने के लिए, homogenization मध्यम (तालिका 1) के विभिंन मात्रा में काम समाधान (५०% iodixanol) के साथ मिलाया गया ।
    4. 15% और 25% अंश लीजिए और उंहें बाँझ DPBS में पतला करने के लिए मात्रा लाने के लिए 15 मिलीलीटर । उंहें एक नए छोटे ultracentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण और १००,००० x जी पर केंद्रापसारक, ६० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    5. supernatant त्यागें और आगे लक्षण वर्णन के लिए बाँझ DPBS के ५० μL में EV छर्रों resuspend ।

3. Extracellular पुटिका ठहराव

नोट: BALF-व्युत्पन्न ईवीएस पुनर्प्राप्ति प्राप्ति दो मैट्रिक्स के साथ quantitated है ।

  1. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) मापन
    1. DPBS के 1 मिलीलीटर में 1:200-1:500 में EV नमूना को पतला करें और नमूना को इंसुलिन सिरिंज में लोड करे । एक नमूना एक सिरिंज पंप करने के लिए सिरिंज संलग्न और कण संख्या और आकार को मापने के लिए शुरू ( सामग्री की तालिकादेखें).
    2. कैमरा स्तर पर सेट करें 14 और खोज थ्रेशोल्ड 1 पर सभी नमूना माप के लिए । 30 एस में १,५०० फ्रेम के साथ पांच दोहराव माप प्रत्येक नमूने के लिए दर्ज किया गया, पढ़ता के बीच 20 एस की देरी के साथ. अंतिम एकाग्रता और आकार रिपोर्ट के लिए डेटा को संयोजित और औसत करें.
      नोट: सभी कणों की सटीक कब्जा करने के लिए, सभी कणों कल्पना और प्रत्येक प्रयोग में सभी नमूना माप के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए उपयुक्त के रूप में कैमरा स्तर को समायोजित करें ।
  2. प्रोटीन ठहराव
    नोट: bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख BALF-व्युत्पंन ईवीएस के प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. Solubilize में ईवी नमूनों को 1x lysis बफर में यूज करे ।
    2. एक प्लेट रीडर में ५६० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा वर्णमिति का पता लगाने का उपयोग कर बीसीए मानक प्रोटोकॉल प्रति BALF-व्युत्पंन ईवीएस में प्रोटीन की मात्रा को बढ़ाता है ।

4. BALF-व्युत्पंन Extracellular बुलबुले का पता लगाने

नोट: आमतौर पर ज्ञात exosome सतह मार्कर प्रोटीन (TSG101, CD63, CD81, और CD9) एसडीएस-पृष्ठ और immunoblotting और प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा EV वसूली की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

  1. एसडीएस-पृष्ठ और immunoblotting
    1. एक सोख्ता लोड हो रहा है बफर (लिथियम dodecyl सल्फेट) और ५० mM dithiothreitol (डीटीटी) एक १.६ मिलीलीटर ट्यूब के साथ प्रत्येक नमूने के EV प्रोटीन की एक बराबर राशि भंग । 10 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी ।
    2. एक 4 – 12% बीआईएस-Tris प्लस acrylamide जेल और भागो ट्रो (१५० वोल्ट, ३५ mA) में ३५ मिनट के लिए कदम से नमूनों को लोड शुू ।
    3. एक सूखी हस्तांतरण विधि का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली को प्रोटीन स्थानांतरण ।
    4. ६० मिनट के लिए 5% स्किम्ड दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक, कमरे के तापमान पर कमाल (आरटी) ।
    5. एक EV सतह प्रोटीन मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन, ट्यूमर संवेदनशीलता जीन १०१ (TSG101), में 1:500 कमजोर पड़ने पर 5% BSA में Tris-बफ़र्ड खारा के बीच-20 (TBST) 4 डिग्री सेल्सियस पर, रात का घोड़ा ।
    6. अगले दिन, TBST बफर में झिल्ली 3x, 10 मिनट प्रत्येक धोने, धो, और यह विरोधी खरगोश आईजीजी, एक एचआरपी-एंटीबॉडी से जुड़े, 1 पर ६० मिनट के लिए आरटी पर 5000 कमजोर पड़ने के साथ गर्मी ।
    7. धो झिल्ली 3x, 10 मिनट प्रत्येक धोने, TBST बफर में । chemiluminescent एचआरपी एंटीबॉडी डिटेक्शन रिएजेंट और छवि (इमेजिंग प्रणाली के लिए सामग्री की तालिका देखें) के साथ झिल्ली विकसित करना ।
  2. प्रवाह cytometry
    1. पतला BALF-व्युत्पंन ईवीएस में ४९ μL के पभव धुंधला बफर (पंजाबियों + 5 मिमी EDTA + ०.५% BSA, एक ०.१ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर) ।
    2. प्रत्येक व्यक्ति के नमूने में निंनलिखित एंटीबॉडी के प्रत्येक जोड़ें: 1) चूहा विरोधी माउस पे CD63 एंटीबॉडी (१०० प्रति प्रतिक्रिया एनजी); 2) चूहा विरोधी माउस पे CD81 (५०० एनजी); 3) चूहा विरोधी माउस FITC CD9 (२०० एनजी) । 4 ° c पर मशीन, अंधेरे में ६० मिनट के लिए कमाल ।
    3. झिल्ली-फ़िल्टर्ड पभव धुंधला बफर के ४५० μL के साथ नमूनों को पतला और cytometry विश्लेषण प्रवाह करने के लिए नमूने विषय ( सामग्री की तालिकादेखें)25.
    4. प्रवाह cytometer सेटिंग्स निम्नानुसार समायोजित करें: 1) हाइपर लॉग (hlog) पर सभी चैनलों सेट; 2) 4 पर एसएससी पर ट्रिगर सेट; 3) माध्यमिक ट्रिगर बंद कर दें । एक कम गति सेटिंग में नमूने चलाएं और प्रत्येक नमूने में कम से १०,००० घटनाओं का अधिग्रहण ।
    5. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में कम cytometry डेटा विश्लेषण निष्पादित करें ( सामग्री तालिकादेखें).

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Representative Results

हम एक ही दिन पर UFC और UC-क्लब अलगाव तरीकों का उपयोग माउस BALF से EV अलगाव प्रदर्शन किया । UFC विधि लगभग 2.5-3 एच की आवश्यकता है, जबकि UC-क्लब तकनीक की आवश्यकता 8 प्रसंस्करण समय के एच । यह बफ़र्स और एजेंट तैयारी समय शामिल नहीं था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ अंय कार्यों के लंबे समय के केंद्रापसारक अवधि के दौरान किया जा सकता है । फिर भी, पूरी प्रक्रिया UC-क्लब अलगाव तकनीक के लिए लगभग एक पूरे दिन चली ।

BALF-सामांय से व्युत्पंन ईवीएस UFC विधि द्वारा अलग चूहों एक छोटे आकार और एक और अधिक समान आकार वितरण (१४८.८ ± १.१ एनएम, आंकड़ा 1a) UC-क्लब ईवीएस (१७६.७ ± ७.८ एनएम, आंकड़ा 1b) की तुलना में प्रदर्शित किया । UFC तकनीक एक गहरा ६५ था गुना अधिक से अधिक कुल कण की गिनती जब UC-क्लब अलगाव की तुलना में (२९.४ ± १८.४ बनाम ०.५ ± ०.१ एक्स 1010 कणों; p < ०.०५; तालिका 2 और चित्रा 1C) । कुल प्रोटीन वसूली (µ जी में) UFC ईवीएस के भी उच्च था (३,१३६ ± १,८६० बनाम ७३.७ ± ३८.३ µ g; p < ०.०५; तालिका 2 और चित्रा 1 डी) । इस प्रकार, UFC समय है और प्रयास कुशल और एक उच्च EV उपज प्रदान करता है ।

आगे phenotypically BALF विशेषताएं-EV आबादी व्युत्पंन, हम सामांयतः ज्ञात exosome सतह प्रोटीन मार्करों की उपस्थिति की जांच: CD63, CD9, और CD81 द्वारा प्रवाह cytometry और TSG101 द्वारा immunoblotting । प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया है कि UFC ईवीएस और यूसी-क्लब ईवीएस दोनों व्यक्त CD63 (चित्रा 2a -2c), CD9 (चित्रा 2d -2F), और CD81 (चित्रा 2g -2I). CD63, CD9, और CD81 के ज्यामितीय अर्थ अभिव्यक्ति (gMFI) quantified और दो शर्तों (चित्र 3 -3F) के बीच सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं था ।

अगले, हम immunoblotting द्वारा एक और EV प्रोटीन मार्कर, TSG101, जांच की । हमें पता चला कि ufc प्रवाह के 20 µ जी के माध्यम से (ufc फुट) नमूना TSG101 प्रोटीन शामिल नहीं था, सुझाव है कि UFC अलगाव तकनीक कुशलता से चयनित और BALF नमूना (4 चित्रा) से EV जनसंख्या बनाए रखा । जब BALF से कुल प्रोटीन (20 µ g) की बराबर मात्रा-EV नमूना लोड किया गया था, हमने पाया कि UFC ईवीएस UC-क्लब ईवीएस (चित्रा 4) की तुलना में TSG101 के एक उच्च स्तर पर व्यक्त की । हम यह भी पता चला है कि UFC की पवित्रता-EV प्रोटीन स्वीकार्य था, एक एकल पृथक प्रोटीन बैंड द्वारा प्रदर्शन किया ।

सभी परिणामों के लिए, छात्र का t-परीक्षण दो-समूह की तुलना के लिए उपयोग किया गया था । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM (माध्य के मानक त्रुटि), और p < ०.०५ महत्वपूर्ण माना जाता था ।

Figure 1
चित्रा 1: murine bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) के Ultrafiltration केंद्रापसारक-व्युत्पंन ईवीएस समरूप ultracentrifugation के घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ murine से एक अधिक BALF आकार वितरण का प्रदर्शन किया-ईवीएस व्युत्पंन और एक था काफी उच्च कुल कण गिनती और प्रोटीन सामग्री । EV कण के आकार का वितरण nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) द्वारा मापा गया था, और कुल प्रोटीन सामग्री bicinchoninic एसिड परख द्वारा मापा गया था । (क) UFC-BALF ईवीएस ' ंत् आकार वितरण ग्राफ । (ख) यूसी-क्लब-BALF ईवीएस ' आकार वितरण ग्राफ । (ग) ंत् द्वारा कुल कण गिनती (मतलब ± SEM x 10 10 कण; * p < ०.०५) । (घ) कुल प्रोटीन सामग्री (µ g में, * p < ०.०५) । यह आंकडे तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त हुए थे । UFC: ultrafiltration केंद्रापसारक; UC-क्लब: घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation; ईवीएस: extracellular बुलबुले; एसडी: मानक विचलन; : एकाग्रता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Murine bronchoalveolar लेवेज द्रव-व्युत्पंन ईवीएस ultrafiltration केंद्रापसारक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक तरीकों के साथ ultracentrifugation द्वारा अलग tetraspanin प्रोटीन CD63, CD9, और CD81 व्यक्त की । दिखाया ईवीएस के प्रतिशत कर रहे है UFC और UC-DCG अलगाव तकनीकों द्वारा सकारात्मक दाग, pseudocolor भूखंडों द्वारा सचित्र, के लिए (ए - सी) पीई-CD63, (डी एफ) FITC-CD9, और (जी - मैं) पीई-CD9 । डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं । UFC = ultrafiltration केंद्रापसारक; UC-क्लब = घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation; ईवीएस = extracellular बुलबुले; एसएससी-एक = साइड कैटर विश्लेषण; पे = phycoerythrin; FITC = fluorescein isothiocyanate । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Ultrafiltration केंद्रापसारक-पृथक murine bronchoalveolar लेवेज द्रव-व्युत्पंन ईवीएस tetraspanin प्रोटीन के ultracentrifugation-अलग ईवीएस के लिए एक समान फ्लोरोसेंट घनत्व व्यक्त किया । (A और D) हिस्टोग्राम और ज्यामितीय अर्थ अभिव्यक्ति (gMFI) के पीई-CD63+-सना हुआ ईवीएस । (ख और ङ) हिस्टोग्राम और gMFI के FITC-CD9+-सना ईवीएस. (ग और च) हिस्टोग्राम और gMFI का पीई-CD81+-सना ईवीएस. ये आंकडे तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त होते हैं. UFC: ultrafiltration केंद्रापसारक; UC-क्लब = घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation; ईवीएस: extracellular बुलबुले; SSC-A: साइड कैटर विश्लेषण; पे: phycoerythrin; FITC: fluorescein isothiocyanate. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Murine bronchoalveolar लेवेज द्रव-व्युत्पंन ईवीएस ultrafiltration केंद्रापसारक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक तरीकों के साथ ultracentrifugation द्वारा पृथक exosome सतह प्रोटीन, TSG101 व्यक्त की । यह पैनल TSG101 एंटीबॉडी (४७ केडीए) के लिए murine BALF-व्युत्पन्न ईवीएस के immunoblotting को दिखाता है । UFC = ultrafiltration केंद्रापसारक; UC-क्लब = घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation; ईवीएस = extracellular बुलबुले; FT = प्रवाह के माध्यम से; टीएसजी = ट्यूमर झेलते जीन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

काम समाधान Iodixanol (%) 5 15 25 30
काम समाधान (एमएल)* 2 6 10 12
Homogenization मीडियम (एमएल)* * 18 14 10 8

तालिका 1: बोया घनत्व ढाल बफ़र्स । इस तालिका संरचना और प्रत्येक ढाल समाधान है कि murine bronchoalveolar लेवेज द्रव को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के बफर अनुपात देता है extracellular पुटिका ultracentrifugation तकनीक से अलग आबादी व्युत्पंन । * काम समाधान ५०% iodixanol (घनत्व ढाल मध्यम के 25 मिलीलीटर था [ सामग्री की तालिकादेखें] + मंदक समाधान के 5 मिलीलीटर [७.४ के ०.२५ एम सुक्रोज + १२० मिमी HEPES + ०.९ एम NaCl]) । * * Homogenization मीडियम (pH ७.४ of ०.२५ M सुक्रोज + 20 mm HEPES + १५० mm NaCl)

विधियों प्रारंभिक खंड (mL) ंत्* (x108/μL) कुल कण† (x1010) प्रोटीन स.‡ (µ g/µ l) कुल प्रोटीन§ (µ g)
Ufc ३५ ७.६९ ± २.६ २९.४ ± १८.४ ३.७ ३,१३६ ± १८६०
यूसी-क्लब ३५ ०.५ ± ०.०५ ०.५ ± ०.१ ०.६ ७३.७ ± ३८.३

तालिका 2: ultrafiltration केंद्रापसारक अलगाव विधि प्रदान की एक उच्च murine bronchoalveolar लेवेज द्रव-व्युत्पंन extracellular पुटिका उपज । कण एकाग्रता और कुल कण गिनती nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) द्वारा मापा गया । प्रोटीन एकाग्रता और प्रोटीन की कुल राशि एक bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख द्वारा मापा गया । * BALF ईवीएस ' कण एकाग्रता (± SEM x 108/μL तीन स्वतंत्र प्रयोगों से) । † BALF ईवीएस ' कुल कण (± SEM x 10 तीन स्वतंत्र प्रयोगों से10 कणों) मतलब है । ‡ BALF ईवीएस ' प्रोटीन एकाग्रता (अर्थ ± SEM µ g/µ l तीन स्वतंत्र प्रयोगों से). § BALF ईवीएस ' कुल प्रोटीन (मतलब ± SEM मिलीग्राम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों) ।
UFC: ultrafiltration केंद्रापसारक; UC-क्लब: घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation; : एकाग्रता; ंत्: nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण; SEM: मतलब की मानक त्रुटि ।

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Discussion

पिछले कुछ दशकों में, वैज्ञानिकों ने सेलुलर homeostasis में ईवीएस की महत्ता को सुलझा लिया है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, ईवीएस अपने सक्रिय कार्गो अणुओं के माध्यम से पड़ोसी और दूर कोशिकाओं को मॉडुलन द्वारा कई रोग प्रक्रियाओं में प्रमुख भूमिकाओं खेलने1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. भविष्य के विकास और इस क्षेत्र में उंनति की स्थापना के विश्वसनीय और कुशल तरीकों पर भरोसा है कि न केवल पहचान और अलग EV आबादी के सही सबसेट लेकिन यह भी बहाव अनुप्रयोगों के लिए उनके जैविक कार्यों की रक्षा 10 , 11 , 14 , 31. वर्तमान अध्ययन में, हम माउस BALF से ईवीएस को अलग करने के लिए एक nanomembrane ultrafiltration केंद्रापसारक (UFC) विधि का वर्णन किया । अंय रिपोर्टों के साथ सामंजस्य में, हमने दिखाया है कि UFC सरल और परिणाम एक उच्च वसूली उपज और पवित्रता में है और, इसलिए, छोटे जैविक नमूनों के लिए उपयुक्त है10,17,18,३२ .

UC-क्लब सामांयतः इस्तेमाल किया जाता है और ev अलगाव के लिए सोने के मानक तकनीक माना जाता है क्योंकि यह उच्च शुद्ध ev कणों10,14प्रदान करता है । हालांकि, इस विधि तकनीकी रूप से बोझिल, समय लेने वाली, श्रम गहन है, और कम दरिद्रता है । नव विकसित microfluidics आधारित तकनीक इन सीमाओं को दूर है, लेकिन यह पूरी तरह से एक वैकल्पिक विधि३३,३४के रूप में लागू किया जा सकता से पहले इस दृष्टिकोण आगे सत्यापन की आवश्यकता है । इस प्रकार, उचित तरीकों कि शुद्धता और नमूनों की दरिद्रता समझौता किए बिना उन कठिनाइयों को समायोजित कर रहे है खली की जरूरत है, विशेष रूप से छोटी मात्रा में जैविक तरल पदार्थ के लिए ।

हम प्रदर्शन किया है कि UFC एक nanomembrane फिल्टर डिवाइस का उपयोग BALF नमूनों से EV अलगाव के लिए प्रभावी था । निष्कर्ष यहां प्रस्तुत स्वर्ण मानक UC-क्लब अपनी सादगी और उच्च दरिद्रता के कारण विधि की तुलना में UFC प्रक्रिया की श्रेष्ठता पर प्रकाश डाला । मूत्र३५, सेल कंडीशन्ड मीडिया17, और भ्रूण गोजातीय सीरम३६: ultrafiltration-आधारित दृष्टिकोण व्यापक रूप से जैविक नमूनों की एक किस्म से EV को अलग करने के लिए अपनाया गया है । अंय मॉड्यूलर आकार आधारित EV अलगाव तकनीक है कि एक मंच के रूप में ultrafiltration का उपयोग करता है exosome कुल अलगाव चिप (विदेशी)31है । इस विधि भी छोटे नमूना आकार के नमूनों के लिए उपयुक्त है । ऐसे फिल्टर सामग्री और nanomembranes के ताकना आकार के रूप में कुछ कारकों, जब UFC तकनीक का उपयोग कर माना जाता है क्योंकि वे बरामद ईवीएस के गुणों को प्रभावित कर सकता है की जरूरत है । उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार के फिल्टर झिल्ली मूत्र18से अलग EV-संबद्ध आरएनए वसूली पैदावार के परिणामस्वरूप । इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि एक 10 केडीए MWCO के साथ पुनर्जीवित फाइबर (आर सी) NOP10, OST4, SNRPG, और TOMM7 की तुलना में उच्चतम mRNA अभिव्यक्ति प्रदान की Hydrosart 10 केडीए, या polyethersulfone (पी इ एस) के 10 केडीए18. हमने आगे यह दर्शाया कि 10 केडीए के साथ आरसी ने १०० केडीए से ज्यादा retentate EV रिकवरी की थी । दूसरों के मूत्र ईवीएस कार्गो सामग्री है कि अलगाव तकनीकों३७के प्रकार से प्रभावित थे विशेषता है । हमारे अध्ययन से पता चला है कि १००-केडीए MWCO आर सी झिल्ली बड़ी MWCO के कारण retentate में बहुत कम अवांछित प्रोटीन के लाभ के साथ एक संतोषजनक BALF-व्युत्पंन EV उपज प्रदान की है ।

इस अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि आकार और UFC ईवीएस के आकार वितरण छोटे और अधिक homogeneously UC-क्लब ईवीएस की तुलना में वितरित थे । पुटिका एकत्रीकरण, जो यूसी तकनीक के साथ आम है, uc-क्लब ईवीएस३८के आयाम विविधता समझा सकता है. हम ev झिल्ली प्रोटीन TSG101, CD63, CD9, और CD81, जो exosomes में retentates की उपस्थिति की पुष्टि का पता लगाने के द्वारा BALF-व्युत्पंन ev शुद्धता का आकलन किया । हम और दूसरों को भी इस्तेमाल किया है उनि UFC ईवीएस३५,३९,४०,४१की आकृति विज्ञान का प्रदर्शन । लियू एट अल. ईवीएस को अलग करने के लिए एक समान ultrafiltration-आधारित दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया और, जब ultracentrifugation द्वारा अलग ईवीएस की तुलना में, proteomic और transcriptomic प्रोफाइल31इसी तरह के थे । इस प्रकार, हम bronchoalveolar लेवेज द्रव जैसे छोटे जैविक द्रव नमूनों के लिए उपयुक्त है कि एक वैकल्पिक EV अलगाव विधि के रूप में १०० केडीए के एक MWCO के साथ एक पुनर्जीवित फाइबर झिल्ली का उपयोग कर एक ultrafiltration केंद्रापसारक विधि का वर्णन ।

जैविक द्रव से ईवीएस को अलग करने के लिए इस UFC दृष्टिकोण का उपयोग महत्वपूर्ण कदम प्रारंभिक nanoporous झिल्ली ०.२ µm निस्पंदन यह सुनिश्चित करने के लिए कि समृद्ध कणों exosomal आकार सीमा में हैं और अतिरिक्त बल लागू करने के परिहार कि कर सकते हैं शामिल exosome आकृति विज्ञान और संरचनाएं10,४२को क्षति या ख़राब । ईवीएस निस्पंदन झिल्ली है, जो कम दरिद्रता में परिणाम का पालन कर सकते हैं । इसलिए, नमूना की मात्रा फ़िल्टर इकाई के प्रत्येक प्रकार में अनुशंसित मात्रा से अधिक नहीं होना चाहिए । हम पुनर्जीवित फाइबर, जो मूत्र से एक उच्च mRNA उपज प्रदान की ईवीएस18व्युत्पंन का उपयोग करने के लिए चुना है । फिल्टर झिल्ली के प्रकार का इस्तेमाल किया वसूली उपज और ईवीएस के प्रकार में परिवर्तन कर सकते हैं । अंत में, भले ही १०० केडीए के एक MWCO जैविक तरल पदार्थ में प्रोटीन के बहुमत को खत्म करना चाहिए, कुछ प्रोटीन संदूषणों कि १०० केडीए या प्रोटीन समुच्चय से बड़ा था४३मनाया गया. इस मामले में, एक धोने कदम EV और प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, कार्यात्मक अध्ययन ठीक से आदेश में पूरी तरह से परिणाम की व्याख्या के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए, के रूप में गैर EV-जुड़े प्रोटीन UFC ईवीएस में मौजूद होंगे ।

हम निष्कर्ष है कि UFC एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि छोटे या बड़े मात्रा के नमूनों के लिए EV अलगाव के लिए संभव है । वर्तमान में उपलब्ध microfilter इकाइयों नमूनों की 15 मिलीलीटर तक समायोजित कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

काम NHLBI/NIH अनुदान HL103868 द्वारा समर्थित है (पीसी के लिए) और HL137076 (पीसी के लिए), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान में सहायता (पीसी के लिए), और शमूएल Oschin व्यापक कैंसर संस्थान (SOCCI) फेफड़ों के कैंसर अनुसंधान पुरस्कार (पीसी के लिए) । हम देवदारों-सिनाई मेडिकल सेंटर में Smidt हार्ट इंस्टीट्यूट के लिए हमारी महान सराहना व्यक्त करना चाहते है जो हमें EV nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए एक Nanosight मशीन प्रदान करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20 G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany -
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA -
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK - To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany -
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA -
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ Extracellular बुलबुले exosomes ultrafiltration केंद्रापसारक ultracentrifugation अलगाव तकनीक bronchoalveolar लेवेज द्रव
एक Ultrafiltration केंद्रापसारक तकनीक का उपयोग Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव से Extracellular बुलबुले के अलगाव
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Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

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