Summary
Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.
Abstract
Vescicole extracellulari (EVs) sono recentemente scoperti componenti sottocellulari che svolgono i ruoli importanti in molti biologico le funzioni di segnalazione durante gli stati fisiologici e patologici. L'isolamento del SVE continua ad essere una grande sfida in questo campo, a causa delle limitazioni intrinseche di ogni tecnica. L'ultracentrifugazione differenziale con metodo di centrifugazione su gradiente di densità è un approccio comunemente utilizzato ed è considerato come la procedura di gold standard per l'isolamento di EV. Tuttavia, questa procedura è che richiede tempo, lavoro ad alta intensità e provoca generalmente bassa scalabilità, che potrebbe non essere adatto per piccoli volumi di campioni come fluido di lavaggio broncoalveolare. Dimostriamo che un metodo di isolamento di centrifugazione di ultrafiltrazione è semplice ed efficiente in tempo e lavoro ancora fornisce un recupero ad alta resa e purezza. Proponiamo che questo metodo di isolamento potrebbe essere un metodo alternativo che è adatto per l'isolamento di EV, specialmente per piccoli volumi di campioni biologici.
Introduction
Gli esosomi sono il più piccolo sottoinsieme di EVs, 50 – 200 nanometro di diametro ed hanno funzioni biologiche attraverso una gamma diversificata di segnalazione processi1,2,3,4,5. Regolano l'omeostasi cellulare e tissutale soprattutto facilitando la comunicazione intercellulare attraverso molecole di carico quali lipidi, proteine e acidi nucleici6,7,8,9 . Un passo fondamentale nella ricerca di EV è il processo di isolamento. Ultracentrifugazione differenziale (UC), con o senza centrifugazione in gradiente di densità (DGC), è considerato l'approccio di gold standard, ma questo metodo comporta limitazioni principali, compresi tassi di recupero EV inefficienti e scalabilità basso10 , 11 , 12, che limitano il suo utilizzo migliore ai più grandi campioni di volume, come gli esemplari della produzione esosomi surnatante o alta coltura cellulare. I vantaggi e gli svantaggi di altri metodi, come l'esclusione di dimensione di ultrafiltrazione o cromatografia di immunoaffinità isolamento da perline o colonne e microfluidica, sono ben descritti e moderne procedure aggiuntive sono state sviluppate per superare e ridurre al minimo le limitazioni tecniche in ogni approccio11,12,13,14,15. Altri hanno indicato che una centrifugazione di ultrafiltrazione (UFC) con una membrana nanoporosa nell'unità filtro è una tecnica alternativa che fornisce purezza paragonabile a un UC metodo16,17,18. Questa tecnica potrebbe essere considerata come uno dei metodi alternativi di isolamento.
Fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) contiene SVE che possiedono numerose funzioni biologiche in varie circostanze respiratorie19,20,21,22. Lo Studio SVE BALF derivato comporta alcune sfide a causa dell'invasività della procedura broncoscopia in esseri umani, così come una quantità limitata di recupero liquido di lavaggio. In piccoli animali da laboratorio come topi, solo pochi millilitri possono essere recuperati in condizioni normali del polmone, anche meno in polmoni infiammati o fibrotica23. Di conseguenza, raccogliendo una quantità sufficiente di BALF per EV isolamento da un ultracentrifugazione differenziale per applicazioni a valle potrebbe non essere fattibile. Tuttavia, isolando corretta EV popolazioni è un fattore cruciale per lo studio delle funzioni biologiche EV. Il delicato equilibrio tra efficienza ed efficacia continua ad essere una sfida in metodi di isolamento EV ben stabiliti.
In questo studio, dimostriamo che un approccio di ultrafiltrazione centrifugo, utilizzando un'unità di filtro nanomembrana 100 kDa peso molecolare cut-off (MWCO), è adatto per piccoli volumi di campioni biologici quali BALF. Questa tecnica è semplice, efficiente e fornisce ad alta purezza e scalabilità per supportare lo studio di BALF derivato EVs.
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Protocol
L'utilizzazione degli animali e tutte le procedure di animali sono state approvate dai comitati di uso (IACUC) al Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) e istituzionali Animal Care.
1. murino lavaggio broncoalveolare fluido (BALF) raccolta e preparazione
- Collezione di BALF
- Eutanasia topi con un cocktail di ketamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) seguita da dislocazione cervicale per via intraperitoneale.
- Inserire un angiocatheter 22 G nella trachea. Collegare una siringa da insulina contenente 1 mL (mL) di soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco sterile ghiacciata (DPBS) e instillare 1 mL di DBPS in entrambi i polmoni attraverso la angiocatheter.
- Ritirare lentamente lo stantuffo della siringa per recuperare BALF e dispensare il BALF in una provetta conica da 50 mL. Mantenere il BALF sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 1.1.2 e 1.1.3 3 volte (4 volte in totale in ogni mouse).
Nota: Circa 0,8 mL viene generalmente recuperato per millilitro di instillazione. Inoltre, le seguenti operazioni possono essere eseguite per singoli topi (cioè, 3 mL di BALF), ma il pool di campioni multipli di BALF permetterà l'isolamento di un lotto più ampio di EVs per la coerenza in esperimenti a valle.
- Preparazione di BALF
- Piscina BALF da 25 topi e dividerlo in due insiemi uguali (~ 35 mL ogni aliquota).
- Centrifugare il BALF a 400 x g, a 4 ° C per 5 min, per rimuovere le cellule e altri detriti cellulari e raccogliere il surnatante.
- Centrifugare il supernatante a 1.500 x g, a 4 ° C per 10 minuti, per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante e procedere con i passaggi di isolamento di EV.
2. isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino
Nota: In questo studio, tecniche di isolamento di due EV, vale a dire UFC e ultracentrifugazione con galleggiante utilizzato per isolare SVE da BALF. Il protocollo dettagliato di ogni metodo è descritto di seguito.
-
Metodo di arricchimento di ultrafiltrazione centrifugazione (UFC)
Nota: Questo metodo è stato modificato da un protocollo descritto in precedenza10.- Filtrare il surnatante dal punto 1.2.3 attraverso un filtro di siringa sterile 0,2 μm e mantenere il BALF filtrata sul ghiaccio.
Nota: Questo è un passo di esclusione di dimensione per cui solo vescicole inferiore a 200 nm sono raccolti. - Equilibrare l'unità filtro centrifugo MWCO di 100 kDa con DPBS sterile per 10 min. Centrifugare il Gruppo centrifugo a 1.500 x g per 10 min a 4 ° C per annullare il DPBS.
Attenzione: La membrana del dispositivo di filtro è equilibrata con DPBS, la membrana dovrà essere mantenuta bagnata a tutto il tempo fino a quando il dispositivo viene utilizzato. - Riempire il filtro con 15 mL di campione BALF dal punto 2.1.1 e centrifugare a 3.000 x g per 30 min a 4 ° C. Il flusso continuo BALF può essere scartato o raccolti in un tubo separato canonico e conservati a-80 ° C per un uso futuro.
- Ripetere il passaggio 2.1.3 per il restante 0,2 µm-filtrata BALF.
Nota: Ci sono voluti tre ripetizioni di centrifugazioni sufficientemente concentrare lo SVE BALF dal volume originale di partenza di 35 mL. Ciò ha provocato 1 – 1,5 mL di retentato. - Lavare il retentato con 14 mL di DPBS sterile pipettando un delicatamente in modo ripetitivo. Centrifugare l'unità filtro a 3.000 x g, a 4 ° C per 30 min, rimuovere il DPBS e concentrare il retentato di EV.
- Raccogliere il concentrato SVE BALF derivato dal dispositivo filtro inserendo un pipettatore nella parte inferiore del dispositivo filtro e prelevare il campione con un movimento laterale per garantire il recupero totale.
- Aliquota dello SVE BALF derivato e conservarli a-80 ° C per ulteriore particella quantificazione e caratterizzazione (vedi passo 3).
- Filtrare il surnatante dal punto 1.2.3 attraverso un filtro di siringa sterile 0,2 μm e mantenere il BALF filtrata sul ghiaccio.
-
Ultracentrifugazione (UC) con centrifugazione in gradiente di densità capace di galleggiare (DGC)
Nota: Il seguente protocollo è stato modificato dal protocollo descritto in precedenza24.- Trasferire il surnatante dal punto 2.1.1 in una provetta ultracentrifuga 37-mL e centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 min a 4 ° C, usando ultracentrifuga. Raccogliere il surnatante e centrifugare a 100.000 x g, a 4 ° C per 60 min. Mentre i pellet EV sono centrifugati, preparare le concentrazioni differenti di buffer di gradienti di densità capace di galleggiare (tabella 1) al punto 2.2.3.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di EV in 200 μL di DPBS.
- Mescolare la sospensione di EV con 300 μL di soluzione di lavoro 50% iodixanol (tabella 1) e trasferirlo al tubo da 15 mL ultracentrifuga. In cima la sospensione di miscela 50% iodixanol-EV, in sequenza di strato seguente soluzione tampone nell'ordine dal basso verso l'alto: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% di iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2,5 mL) e 5% iodixanol (6 mL). Centrifuga a 100.000 x g, a 4 ° C per 230 min.
Nota: Il gradiente di densità capace di galleggiare si basa la percentuale di ridimensionamento con la più alta concentrazione (50%) nella parte inferiore per la concentrazione più bassa (5%) nella parte superiore di iodixanol. Per generare diverse concentrazioni di iodixanol, varie quantità di mezzo di omogeneizzazione (tabella 1) sono stati mescolati con soluzione di lavoro (50% iodixanol). - Raccogliere la frazione di 15% e 25% e diluirli in DPBS sterile per far apparire il volume di 15 mL. Trasferirli su una nuova piccola ultracentrifuga provetta e centrifugare a 100.000 x g, a 4 ° C per 60 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di EV in 50 μL di DPBS sterile per ulteriore caratterizzazione.
3. extracellulare vescicola quantificazione
Nota: La resa di recupero BALF derivato EVs è quantificata con due metriche.
- Nanoparticle tracking misura analysis (NTA)
- Diluire il campione di EV a 1: 200 – 1: 500 a 1 mL di DPBS e carico il campione in una siringa da insulina. Attaccare una siringa di campione per una pompa a siringa e cominciare a misurare il numeri di particelle e le dimensioni (Vedi Tabella materiali).
- Impostare il livello di fotocamera a 14 e la soglia di rilevamento 1 per tutte le misurazioni di campioni. Cinque misurazioni ripetitive con 1.500 fotogrammi in 30 s sono stati registrati per ogni campione, con un ritardo di 20 s tra letture. Combinare e media i dati per concentrazione finale e i rapporti di dimensione.
Nota: Per l'acquisizione accurata di tutte le particelle, regolare il livello di fotocamera più appropriato per visualizzare tutte le particelle e utilizzare impostazioni simili per tutte le misurazioni di campioni in ogni esperimento.
- Quantificazione della proteina
Nota: L'analisi della proteina (BCA) acido bicinconinico è stato utilizzato per misurare la concentrazione di proteina dello SVE BALF-derivato.- Solubilizzare i campioni di EV in 1 tampone di lisi di x.
- Quantificare la quantità di proteine nel server EVs BALF derivato al protocollo standard BCA mediante rilevazione colorimetrica misurando l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastra.
4. rilevazione delle vescicole extracellulari BALF derivato
Nota: Comunemente noto esosomi proteine di superficie dell'indicatore (TSG101, CD63, CD81 e CD9) sono state utilizzate per verificare EV recuperi da SDS-PAGE e immunoblotting e flusso cytometry analisi.
- SDS-PAGE e immunoblotting
- Sciogliere una pari quantità di proteine di EV di ciascun campione con un blotting caricamento buffer (solfato dodecilico di litio) e 50 mM dithiothreitol (DTT) in un tubo di 1,6 mL. Riscaldare i campioni a 70 ° C per 10 min.
- Caricare i campioni dal punto 4.1.1 in un gel di acrilammide 4 – 12% Bis-Tris Plus ed eseguire l'elettroforesi (150 volt, 35 mA) per 35 min.
- Proteine di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa mediante un metodo di trasferimento asciutto.
- Bloccare la membrana con 5% di latte scremato per 60 min, a dondolo a temperatura ambiente (TA).
- Incubare la membrana con un anticorpo ad un marcatore di proteina di superficie di EV, tumore suscettibilità Gene 101 (TSG101), alla diluizione di 1: 500 in 5% BSA in Tris-buffered saline Tween-20 (TBST) a 4 ° C, a dondolo durante la notte.
- Il giorno successivo, lavare la membrana 3 x, 10 min ciascuno lavare, nel buffer di TBST e viene quindi incubato con anti-coniglio IgG, anticorpi HRP-collegato, a 1:5,000 una diluizione per 60 minuti a TA.
- Lavare la membrana 3 x, 10 min ciascuno lavare, nel buffer di TBST. Sviluppare la membrana con chemiluminescenza HRP anticorpo reagente di rilevamento e immagine (Vedi Tabella materiali per sistema di imaging).
- Citometria a flusso
- Diluire BALF derivato SVE in 49 μL di PEB macchiatura buffer (PBS + 5 mM di EDTA + 0,5% BSA, filtrata attraverso una membrana filtrante di 0,1 μm siringa).
- Aggiungere tutti i seguenti anticorpi in ogni singolo campione: 1) anticorpo di topo anti-topo PE CD63 (100 ng per reazione); 2) ratto anti-topo PE CD81 (500 ng); 3) ratto anti-topo CD9 FITC (200 ng). Incubare a 4 ° C, a dondolo per 60 min al buio.
- Diluire i campioni con 450 μL di membrana-filtrata PEB macchiatura buffer e sottoporre i campioni per l'analisi di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali)25.
- Regolare le impostazioni di cytometer di flusso come segue: 1) impostare tutti i canali su iper log (hlog); 2) impostare il trigger su SSC a 4; 3) disattivare il trigger secondario. Eseguire gli esempi in un ambiente a bassa velocità e acquisire almeno 10.000 eventi in ciascun campione.
- Eseguire analisi di dati basso cytometry in ciascun campione utilizzando software di analisi (Vedi Tabella materiali).
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Representative Results
Abbiamo effettuato EV isolamento da mouse BALF utilizzando metodi di isolamento UFC e UC-DGC nello stesso giorno. Il metodo UFC richiesto circa 2,5-3 h, mentre la tecnica di UC-DGC richiesto 8 h tempo di elaborazione. Questo non include buffer e tempo di preparazione del reagente. Dovrebbe essere notato che alcune altre attività potesse essere eseguita durante i periodi lunghi di centrifugazione. Tuttavia, l'intera procedura è durato quasi un giorno intero per la tecnica di isolamento UC-DGC.
EVs BALF-derivati da topi normali isolati dal metodo UFC visualizzati una dimensione più piccola e una più uniforme distribuzione delle dimensioni (148,8 ± 1,1 nM, Figura 1A) rispetto al UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, Figura 1B). La tecnica UFC aveva un profondo 65-fold particella totale maggiore conta rispetto all'isolamento UC-DGC (29,4 ± 18,4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 particelle; p < 0,05; Tabella 2 e Figura 1). Il recupero di proteine totali (in µ g) dello SVE UFC era inoltre più alto (± 1.860 3.136 vs 73,7 µ g ± 38,3; p < 0,05; Tabella 2 e Figura 1). Così, UFC è tempo e sforzo-efficiente e fornisce una maggiore resa di EV.
Per più ulteriormente fenotipico caratterizzare popolazioni BALF derivato EV, abbiamo esaminato la presenza di marcatori di proteina di superficie di esosomi comunemente noti: CD63, CD9 e CD81 tramite flusso cytometry e TSG101 dall'immunoblotting. Usando analisi di citometria a flusso, abbiamo dimostrato che UFC EVs e UC-DGC EVs sia espresso CD63 (Figura 2A -2C), CD9 (Figura 2D -2F) e CD81 (Figura 2 -2I). L'espressione di media geometrica (gMFI) di CD63, CD9 e CD81 è stata quantificata e non statisticamente differente tra le due condizioni (Figura 3A -3F).
Successivamente, abbiamo esaminato un altro EV proteina marcatore, TSG101, immunoblotting. Abbiamo mostrato che i 20 µ g del campione UFC flusso continuo (UFC-FT) non contiene proteine TSG101, suggerendo che la tecnica di isolamento UFC selezionata in modo efficiente e mantenuto la popolazione EV dal campione BALF (Figura 4). Quando è stato caricato uguali quantità di proteine totali (20 µ g) del campione di BALF-EV, abbiamo trovato che UFC EVs espresso un livello di TSG101 superiore UC-DGC EVs (Figura 4). Abbiamo anche dimostrato che la purezza della proteina di UFC-EV era accettabile, dimostrato da una banda singola proteina isolata.
Per tutti i risultati, di Student t-test è stato utilizzato per il confronto di due gruppi. I risultati sono presentati come media ± SEM (errore standard della media), e p < 0,05 è stato considerato significativo.
Figura 1: centrifugazione di ultrafiltrazione di murino lavaggio broncoalveolare (BALF)-derivata EVs ha dimostrato una distribuzione più omogenea di dimensione di ultracentrifugazione con centrifugazione di pendenza di densità di murino BALF derivato EVs e aveva un significativamente più alto contenuto di conteggio e proteina totale della particella. La distribuzione delle dimensioni delle particelle EV è stata misurata da nanoparticle tracking analysis (NTA), e il contenuto proteico totale è stato misurato mediante l'analisi di acido bicinconinico. Grafico di distribuzione degli (A) UFC-BALF EVs NTA dimensione. Grafico di distribuzione di dimensione di (B) UC-DGC-BALF EVs. Conteggio totale delle particelle (C) di NTA (media ± SEM x 1010 particelle; * p < 0,05). Contenuto proteico totale (D) (in µ g, * p < 0,05). I dati sono stati derivati da tre esperimenti indipendenti. UFC: centrifugazione ultrafiltrazione; UC-DGC: ultracentrifugazione con centrifugazione in gradiente di densità; SVE: vescicole extracellulari; SD: deviazione standard; CONC: concentrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il lavaggio broncoalveolare murino liquido-derivato EVs isolato mediante centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con metodi di centrifugazione su gradiente di densità espresse proteine studi CD63, CD9 e CD81. Indicato sono percentuali di EVs macchiate il positive con le tecniche di isolamento UFC e UC-DCG, illustrate da pseudocolor trame, per (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 e (G - I) PE-CD9. I dati sono derivati da tre esperimenti indipendenti. UFC = centrifugazione di ultrafiltrazione; UC-DGC = ultracentrifugazione con centrifugazione in gradiente di densità; SVE = vescicole extracellulari; SSC-A = analisi di dispersione laterale; PE = ficoeritrina; FITC = Isotiocianato di fluorescina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ultrafiltrazione isolata di centrifugazione murino lavaggio broncoalveolare liquido-derivato EVs espressa una simile densità fluorescente di studi proteine EVS ultracentrifugazione-isolato. (A e D) Espressione di istogramma e media geometrica (gMFI) del PE-CD63+-macchiato EVs. (B ed E) istogramma e gMFI di FITC-CD9+-macchiato EVs. (C e F) istogramma e gMFI di PE-CD81+-macchiato EVs. Questi dati sono ricavati da tre esperimenti indipendenti. UFC: centrifugazione ultrafiltrazione; UC-DGC = ultracentrifugazione con centrifugazione in gradiente di densità; SVE: vescicole extracellulari; SSC-r: analisi di dispersione laterale; PE: ficoeritrina; FITC: isotiocianato di fluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: il lavaggio broncoalveolare murino liquido-derivato EVs isolato mediante centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con metodi di centrifugazione su gradiente di densità esprime la proteina di superficie di esosomi, TSG101. Questo pannello mostra l'immunoblotting di murino EVs BALF derivato per l'anticorpo di TSG101 (47 kDa). UFC = centrifugazione di ultrafiltrazione; UC-DGC = ultracentrifugazione con centrifugazione in gradiente di densità; SVE = vescicole extracellulari; FT = flusso continuo; TSG = gene di suscettibilità del tumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Lavoro soluzione Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Soluzione di lavoro (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Mezzo di omogeneizzazione (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabella 1: buffer di gradienti di densità capace di galleggiare. Questa tabella fornisce il rapporto di composizione e buffer di ogni soluzione gradiente utilizzato per purificare le popolazioni di vescicola extracellulare liquido derivato il lavaggio broncoalveolare murino isolati mediante la tecnica dell'ultracentrifugazione. * La soluzione di lavoro era 50% iodixanol (25 mL di terreno di gradienti di densità [vedi Tabella materiali] + 5 mL di soluzione diluente [pH 7.4 di 0,25 M saccarosio + 120 mM HEPES + 0,9 M NaCl]). * * Medio omogeneizzazione (pH 7,4 0,25 M saccarosio + 150 mM NaCl, 20 mM HEPES)
| Metodi | A partire di Volume (mL) | NTA* (x 108μl) | Totale particelle† (x1010) | Proteina Conc‡ (µ g / µ l) | Proteine totali§ (µ g) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29,4 ± 18,4 | 3.7 | 3.136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0.05 | 0,5 ± 0,1 | 0.6 | 73,7 ± 38,3 |
Tabella 2: il metodo di isolamento di centrifugazione ultrafiltrazione fornito un rendimento di vescicola extracellulare liquido derivato il lavaggio broncoalveolare murino alta. La concentrazione di particelle e il conteggio totale delle particelle sono stati misurati da nanoparticle tracking analysis (NTA). La concentrazione nella proteina e la quantità totale di proteina sono stati misurati da un'analisi di proteina acida bicinconinico. * Concentrazione di particelle dei BALF EVs (media ± SEM x 108μl da tre esperimenti indipendenti). † Particella di totale degli BALF EVs (media ± SEM x 1010 particelle da tre esperimenti indipendenti). ‡ Concentrazione nella proteina di BALF EVs (media ± SEM µ g / µ l da tre esperimenti indipendenti). § Proteine totali degli BALF EVs (media ± SEM mg da tre esperimenti indipendenti).
UFC: centrifugazione ultrafiltrazione; UC-DGC: ultracentrifugazione con centrifugazione in gradiente di densità; CONC: concentrazione; NTA: nanoparticle tracking analysis; SEM: errore standard della media.
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Discussion
Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno dipanato i significati del SVE in omeostasi cellulare. Ancora più importante, EVs svolgono un ruolo importante in molti processi di malattia modulando le celle vicine e lontane a loro carico bioattivi molecole1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. futuro sviluppo e progresso in questo campo profondamente si basano su affidabili ed efficienti metodi che non solo identificano e separano correggere sottoinsiemi delle popolazioni di EV ma anche preservare le funzioni biologiche per applicazioni a valle 10 , 11 , 14 , 31. in questo studio, abbiamo descritto un metodo di centrifugazione (UFC) nanomembrana ultrafiltrazione per isolare SVE da mouse BALF. In concordanza con altri rapporti, abbiamo mostrato che UFC è semplice e si traduce in un recupero ad alta resa e purezza e, di conseguenza, è adatto per piccoli campioni biologici10,17,18,32 .
UC-DGC è comunemente usato ed è considerata la tecnica gold standard per l'isolamento di EV perché fornisce altamente purificato EV particelle10,14. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente complessa, che richiede tempo, lavoro ad alta intensità e bassa scalabilità è. Il recente sviluppate tecniche basate su microfluidica superare queste limitazioni, ma questo approccio richiede ulteriore convalida prima di poter essere pienamente applicata come un metodo alternativo33,34. Così, metodi appropriati che ospitare tali difficoltà senza compromettere la purezza e la scalabilità dei campioni sono assolutamente necessarie, specialmente per piccoli volumi di fluido biologico.
Abbiamo dimostrato che utilizzando un dispositivo di filtro nanomembrana UFC era efficace per l'isolamento di EV da esemplari BALF. I risultati presentati qui evidenziano la superiorità della procedura UFC rispetto alla norma di oro metodo UC-DGC grazie alla sua semplicità e una maggiore scalabilità. L'approccio basato su ultrafiltrazione è diventato ampiamente adottato per isolare EV da una varietà di esemplari biologici: urina35, media condizionata cella17e siero fetale bovino36. L'altro modulare basato su dimensione EV isolamento tecnica che utilizza ultrafiltrazione come piattaforma è esosomi totale isolamento chip (esotici)31. Questo metodo è anche adatto per piccoli esemplari di dimensioni del campione. Alcuni fattori, come ad esempio materiale filtrante e la dimensione dei pori di nanomembrane, devono essere considerati quando si utilizza la tecnica UFC, perché possono influenzare le proprietà del SVE recuperati. Ad esempio, diversi tipi di membrane filtro provocato EV-associated RNA recupero rese diverse da urina18. In questo studio, abbiamo dimostrato che la cellulosa rigenerata (RC) con un 10 kDa MWCO fornito la più alta espressione del mRNA di NOP10, OST4, SNRPG, e TOMM7 rispetto a Hydrosart 10 kDa, o polietersulfone (PES) di 10 kDa18. Abbiamo dimostrato ulteriormente che la RC con 10 kDa ha avuto un recupero di EV retentato superiore rispetto il 100 kDa. Altri hanno caratterizzato il contenuto di carico EVs urina che sono stati influenzati dal tipo di isolamento tecniche37. Il nostro studio ha mostrato che la membrana MWCO RC 100-kDa fornito un rendimento soddisfacente BALF derivato EV con il vantaggio di proteine molto meno indesiderati nel retentato dovuto il MWCO più grande.
Questo studio ha dimostrato che le dimensioni e la distribuzione delle dimensioni del UFC SVE erano più piccole e più omogeneamente distribuite rispetto a quelle del UC-DGC sve. L'aggregazione della vescicola, che è comune con tecniche di UC, può spiegare l'eterogeneità di dimensione di UC-DGC EVs38. Abbiamo valutato BALF derivato EV purezza rilevando le proteine di membrana EV TSG101, CD63, CD9 e CD81, che conferma la presenza di esosomi nel materiale. Noi ed altri abbiamo utilizzato anche TEM per dimostrare la morfologia dell'UFC EVs35,39,40,41. Liu et al. utilizzato un simile approccio basato su ultrafiltrazione per isolare EVs e, rispetto al SVE isolati dall'ultracentrifugazione, i profili proteomici e trascrittomica erano simili31. Così, descriviamo un metodo di centrifugazione di ultrafiltrazione tramite una membrana di cellulosa rigenerata con un MWCO di 100 kDa come un metodo alternativo di isolamento di EV che è adatto per i piccoli campioni di fluidi biologici come fluido di lavaggio broncoalveolare.
I passaggi critici utilizzando questo approccio UFC per isolare SVE da fluidi biologici includono l'iniziale nanoporosi la filtrazione a membrana 0,2 µm per garantire che le particelle arricchite la gamma di dimensioni exosomal e per evitare l'applicazione di forza supplementare che può danneggiare o deformare l'esosomi morfologia e strutture10,42. SVE possono aderire alla membrana di filtrazione, che si traduce in minore scalabilità. Di conseguenza, il volume del campione non deve superare la quantità consigliata in ogni tipo di unità filtro. Abbiamo scelto di utilizzare la cellulosa rigenerata, che ha fornito un rendimento più elevato di mRNA da urina-derivato EVs18. Il tipo di membrane filtro utilizzate possa alterare il rendimento di recupero e tipo del SVE. Infine, anche se un MWCO di 100 kDa dovrebbe eliminare la maggior parte delle proteine nei fluidi biologici, alcuni contaminanti di proteina che erano più grandi di 100 kDa o proteina aggregati sono stati osservati43. In questo caso, una fase di lavaggio è fondamentale per ridurre al minimo l'aggregazione della proteina ed EV. Inoltre, gli studi funzionali devono essere adeguatamente controllati al fine di interpretare pienamente i risultati, come proteine non-EV-collegati sarà presente nel server EVs UFC.
Concludiamo che l'UFC è un approccio alternativo che sia fattibile per l'isolamento di EV per i campioni piccoli o grandi volumi. Le unità attualmente disponibili microfiltro possono ospitare fino a 15 mL di campioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è supportato da sovvenzioni NHLBI/NIH HL103868 (a P.C.) e HL137076 (a P.C.), la sovvenzione di associazione cuore americano (a P.C.) e Samuel Oschin completa Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (a P.C.). Vorremmo esprimere il nostro grande apprezzamento per l'Istituto del cuore di Smidt al Cedars-Sinai Medical Center che ci fornisce una macchina Nanosight per EV nanoparticle tracking analysis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
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