Summary
Her presenterer vi en protokoll for å dikte en nyre cortex ekstracellulær matrix-avledet hydrogel for å beholde opprinnelige nyre ekstracellulær matrix (EFM) strukturelle og biokjemiske sammensetningen. Fabrikasjon prosessen og tilhørende programmer er beskrevet. Til slutt, et perspektiv på bruker denne hydrogel støtte nyre-spesifikke cellular og vev gjenfødelse og bioteknologi er diskutert.
Abstract
Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Gjeldende syntetisk hydrogels tilbyr robust mekanisk støtte for i vitro celle kultur, men mangler nødvendig protein og ligand sammensetningen for å vekke fysiologiske oppførsel fra celler. Dette manuskriptet beskriver en fabrikasjon metode for en nyre cortex ECM-avledet hydrogel med riktig mekanisk robusthet og støttende biokjemisk komposisjon. Hydrogel er fabrikkert av mekanisk homogenisere og solubilizing decellularized menneskelige nyre cortex ECM. Matrix bevarer opprinnelig nyre cortex ECM protein prosenter mens også gelation til fysiologiske mekaniske stiffnesses. Hydrogel fungerer som et substrat på hvilke nyre cortex-avledet celler kan opprettholdes under fysiologiske forhold. Videre kan hydrogel sammensetningen manipuleres for å modellere et sykt miljø som gjør at fremtidige studiet av nyre sykdommer.
Introduction
Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Komplekse molekylær sammensetningen regulerer både strukturelle og funksjonelle egenskaper av vev. Strukturelle proteiner gi celler med romlig bevissthet og muliggjøre vedheft og migrasjon1. Bundet ligander samhandle med celleoverflaten reseptorer å kontrollere celle oppførsel2. Nyre ECM inneholder en mengde molekyler som komposisjon og struktur varierer avhengig av anatomiske plasseringen, utviklingsstadiet og sykdom staten3,4. Recapitulating kompleksiteten av ECM er en sentral del i å studere nyre-avledet celler i vitro.
Tidligere forsøk på å replikere ECM microenvironments har fokusert på decellularizing hele vev lage stillaser i stand til å recellularization. Decellularization er utført med kjemiske rengjøringsmidler som natrium dodecyl sulfate (SDS) eller ikke-ioniske vaskemidler, og det utnytter enten hele organ perfusjon eller nedsenking og agitasjon metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Stillasene presenteres her bevare strukturelle og biokjemiske signaler i eget vev ECM; Videre recellularization med donor-spesifikke celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi14,15,16,17,18, 19. imidlertid disse stillaser mangler strukturelle fleksibilitet og er derfor ikke kompatible med mange gjeldende enheter for i vitro studier. For å overkomme denne begrensningen, har mange grupper ytterligere behandlet decellularized ECM i hydrogels,20,,21,,22,,23,,24. Disse hydrogels er kompatible med injeksjon molding og bioink og omgå mikrometer skala romlige begrensninger som decellularized stillaser sted på celler. Videre beholdes molekylær sammensetning og prosenter i native ECM3,25. Her viser vi en metode for å dikte et hydrogel avledet fra nyre cortex ECM (kECM).
Formålet med denne protokollen er å produsere en hydrogel som reproduserer microenvironment av nyre kortikale området. Nyre cortex vev er decellularized i en 1% SDS løsning under konstant agitasjon fjerne cellulære saken. SDS brukes vanligvis til decellularize vev på grunn av sin evne til å raskt fjerne immunologiske mobilnettet materiale6,7,9,26. KECM er da mekanisk homogenisering og lyophilization,5,,6,,9,,11,,26. Solubilization i en sterk syre med pepsin resulterer i en siste hydrogel lagerløsning20,27. Native kECM proteiner som er viktig for strukturell støtte og signalisere signaltransduksjon beholdes3,25. Hydrogel kan også være gelled til innenfor en størrelsesorden innfødt menneskelige nyre cortex28,29,30. Denne matrisen gir en fysiologisk miljø som er brukt til å opprettholde gågaten i nyre-spesifikke celler i forhold til hydrogels fra andre matrix proteiner. Videre matrix komposisjon kan manipuleres, for eksempel gjennom tillegg av kollagen-jeg, til modellen sykdom miljøer for studiet av nyre fibrose og andre nyre sykdommer31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskets nyrer ble isolert av LifeCenter nordvest etter etiske retningslinjer satt av foreningen for orgel innkjøp organisasjoner. Denne protokollen følger dyr omsorg og celle kultur retningslinjene skissert av University of Washington.
1. forberedelse av menneskelig nyre vev
- Utarbeidelse av decellularization løsning
- Sterilisere en 5000 mL kanne og 70 x 10 mm rør bar.
- Bland 1:1000 (vekt: volum) natrium dodecyl sulfate (SDS) i autoklaveres deionisert vann begeret. La løsningen på en røre plate på ca 200 rpm i 24 timer eller til SDS er fullstendig oppløst.
Merk: Vanligvis 2500 mL 1% SDS løsning er tilstrekkelig til å decellularize en enkelt menneskelige nyre. - Overføre løsningen til et 500 mL steril vakuum filter og filter i steriliserte sealable containere.
- Behandling av nyre vev
- Vask og autoklav et par pinsett, to hemostat klemmer, et par generelle tjenesten klasse saks, to skalpell blad håndtak, en 1000 mL kanne dekket med aluminiumsfolie og en 36 x 9 mm rør bar.
- Linje vev kultur hette med underpad. Plass begeret, en steril vev kultur parabol (150 x 25 mm) og hele nyre orgelet i panseret. Fyll begeret med 500 mL 1% SDS.
Merk: Menneskets nyrer ble mottatt på is fra LifeCenter nordvest. - Plass nyrene i sterilt vev kultur parabol (figur 1A). Fjern alle perirenal fett ved lett barbering rundt nyre kapsel med skalpell (figur 1B).
- Gjøre en grunne 8-10 cm snitt med skalpell, bare dypt nok å bryte åpne nyre kapselen uten å skade den underliggende cortex vev, over overlegen slutten av nyrene. Fjerne nyre kapselen ved peeling det fra cortex vevet med to hemostat klemmer (figur 1 c).
- Halvere nyre langs koronale flyet ved hjelp av skalpell langs den laterale siden av nyre (figur 1 d). Isolere cortex vev fra begge omganger med skar ut form regionen med skalpell (figur 1E) og terninger cortex vevet i 0,5 cm3 stykker (figur 1F). Fjern alle store synlige fartøy.
- Isolering av ekstracellulær matrix
- I vev kultur hette, fylle en 1000 mL kanne med 500 mL 1% SDS. Plass baren terninger cortex vev og rør i begeret inneholder SDS løsning. Dekker begeret med autoklaveres aluminiumsfolie og legg den på et rør tallerken på ca 400 rpm utenfor vev kultur panseret.
- Når cortex vevet er på rør tallerkenen 24 h, bringe begeret i vev kultur hette og legge en 40 µm sterilt celle sil laget med nylon maske. Fylle et separat 1000 mL beaker med 200 mL blekemiddel, og plasser den i vev kultur panseret.
- Pipetter SDS løsningen gjennom cellen silen i begeret med blekemiddel. Pipetter ut alle SDS løsning gjenstår bare decellularized vev og celle silen i begeret.
Merk: Cellen silen bør hindre alle vev fjernes under løsning aspirasjon. - La celle silen i beaker og fyll med 500 mL frisk SDS. Dekk kanne med det samme aluminiumsfolie og plasser på en røre plate med samme hastighet som før.
- Gjenta trinn 1.3.1-1.3.3 hvert døgn med fersk SDS løsning for totalt fem dager.
- Skyll decellularized vev med autoklaveres DI vann hver 24 timer for 3 dager totalt, etter teknikken beskrevet i trinnene 1.3.1-1.3.3.
- Skyll decellularized vev med celle kultur klasse vann hver 24 h i 2 dager totalt, etter teknikken beskrevet i trinnene 1.3.1-1.3.3.
- Gjenta trinn 1.3.1-1.3.2. Overføre decellularized vev (referert til som kECM fra dette punktet på) i en 30 mL selv står konisk rør og fylle den med celle kultur klasse vann til alle vev er neddykket.
2. fabrikasjon av Hydrogel lager løsning
- Mekanisk behandling av decellularized vev
- I vev kultur hette, mekanisk homogenize kECM innen konisk røret med en vev homogenizer i 2 minutter.
Merk: Homogenisert kECM skal ligne en ugjennomsiktig løsning med ingen synlig biter av ECM. - Senk konisk røret som inneholder kECM i flytende nitrogen til kokende rundt røret lenger vedvarer. Lagre kECM på-4 grader over natten.
- I vev kultur hette, mekanisk homogenize kECM innen konisk røret med en vev homogenizer i 2 minutter.
- Lyophilization av decellularized frossent
- Litt løsne konisk tube lokket til å tillate gassutveksling og sett røret til en lyophilization maskin. Lyophilize kECM i tre dager eller til den ligner et fint hvitt pulver. Butikken på-4 grader.
- Kjemisk fordøyelsen og solubilization av gel
- Autoclave 20 mL scintillation ampuller og cap, 15,9 x 7.9 mm rør bar og ett par fin-spissen tang.
- Veie lyofilisert kECM og beregne volumet av HCl og masse pepsin måtte solubilize kECM 3% (30 mg/mL) løsninger bruker følgende ligningene, der mpepsin er masse pepsin, mvev massen av lyofilisert vev og VHCl er volumet av 0,01 N HCl:
- I vev kultur hette, legge svin mage pepsin 0,01 N HCl og baren rør til scintillation ampullen og la den på en røre plate på ca 500 rpm til alle pepsin har oppløst. Overføre lyofilisert kECM til scintillation ampullen og la løsningen på en røre plate på ca 500 rpm i tre dager.
3. Hydrogel Gelation
- Nyre ECM hydrogel forberedelse
- Gel av hydrogel ved å blande kECM hydrogel lager løsningen med 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), og celle kultur medier. Holde alle løsningene på is.
Merk: Siste gel konsentrasjoner av 7.5 mg/mL ble brukt for cellekultur. 1 mL av kECM gel var tilstrekkelig for cellekulturer eksperimenter presentert. - Finne volumet av gjennomførbar kECM gel produsert og mengde lager kECM hydrogel behov ved hjelp av følgende ligning, der Vsiste er volumet av gel opprettet, Vlager kECM er volumet av lager kECM hydrogel nødvendig Clager kECM er konsentrasjonen av lager kECM hydrogel, og Csiste er konsentrasjonen av siste gel:
- Finne volumet av nøytralisere reagenser som trengs ved hjelp av følgende formler, der VNaOH er volumet av 1 N NaOH, V10 X er antall M199 10 X media supplement og V1 X er den volumet av celle kultur medier:
- I vev kultur hette, Pipetter nøytraliserende reagenser (NaOH, M199 og celle kultur medier) i et sterilt 30 mL selv står konisk rør. Bland nøytraliserende reagens løsningen med en microspatula.
- Bruk en steril 1 mL sprøyte overføre den riktige mengden lager kECM hydrogel nøytraliserende reagens løsningen. Bruk en microspatula å blande forsiktig løsningen til en homogen i farge hydrogel løsning oppnås.
Merk: Unngå å innføre luftbobler av omrøring sakte og forsiktig. - For å innlemme celler i kECM hydrogel, trekke 10 µL av celle kultur medier (V1 X) fra nøytraliserende løsning volum beregningene i trinn 3.1.1.3.
- Suspendere celler i 10 µL av celle kultur medier. Bestemme antall celler deaktiveres ved hjelp av følgende ligning, der #celler betyr antall celler å suspendere og Vsiste er volumet av gel opprettet:
Merk: 300.000 celler/mL er konsentrasjonen av celler som brukes i kECM gel. - Pipetter 10 µL av cellen suspendert løsning i siste kECM gel etter kECM lager løsningen har vært blandet med nøytralisere reagens løsning. Rør løsningen med en microspatula til cellene fordeles jevnt.
- Suspendere celler i 10 µL av celle kultur medier. Bestemme antall celler deaktiveres ved hjelp av følgende ligning, der #celler betyr antall celler å suspendere og Vsiste er volumet av gel opprettet:
- Gel av hydrogel ved å blande kECM hydrogel lager løsningen med 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), og celle kultur medier. Holde alle løsningene på is.
- Bruk en 1 mL sprøyte fylle en ønsket celle kultur enhet med kECM hydrogel.
- Tillate gel å sette på 37 grader 1t før overføring eller plating celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KECM-hydrogel gir en matrise for nyre cellekultur liknende kjemisk sammensetning som den opprinnelige nyre microenvironment. For å utvikle hydrogel, er nyre cortex vev mekanisk isolert fra en hel nyre orgel og terninger (figur 1). Decellularization med kjemiske vaskemiddel (figur 2A.1-A.3) etterfulgt av skyller med vann for å fjerne vaskemiddel partikler (figur 2A.4-A.6) gir isolert nyre cortex ECM. Histologiske evaluering bekrefter typisk basale laminær proteiner som kollagen-IV og laminin og strukturelle proteiner som kollagen-jeg er bevart, med vitronectin som eneste bemerket unntak (figur 2B). Videre forblir protein komposisjon, inkludert bevaring av isoformene, ECM konsekvent med observerte verdiene i opprinnelige nyre ECM (Figur 3). ECM (figur 4A) er mekanisk homogenisert og lyofilisert (figur 4B) så solubilized for å produsere den endelige kECM hydrogel (figur 4C). KECM-hydrogel dukket ugjennomsiktig med små mengder synlig vev og var ikke så tyktflytende som tradisjonelle kollagen-jeg hydrogel. Reologiske måling av gelled kECM i en konsentrasjon av 15 mg/mL avslørte en kompleks modulus (dynamisk elastisk modulus) på rundt 800 Pa over lineær rekke belastning verdier, betydelig større enn 7.5 mg/mL kollagen-jeg (p = 1.602E-14). Menneskelige nyre peritubular mikrovaskulær endotelceller (HKMECs) kultivert på kollagen-jeg, kECM, og en 1:1 blanding gel viste forskjeller i fenotype, spesielt i CD31 uttrykk rundt celle overflater og veikryss (figur 5). HKMECs kultivert på kollagen-jeg vises uniform CD31 uttrykk mens HKMECs kultivert på to geléer inneholder kECM vises redusert CD31 uttrykk i ujevn distribusjoner. Matrise-typen synes ikke å påvirke den høye PV1 og lav VWF uttrykk i HKMECs.
Figur 1: isolering av nyre cortex vev. Mekanisk behandling av en hel nyre organ isolere cortex vevet som base materiale for kECM hydrogel. Mekanisk isolasjon begynner med (A) fjerning av fettvev perirenal. Store deler av fettvev kan bli revet fra nyre hemostat festing. Gjenværende deler av fettvev kan fjernes ved å kjøre en skalpell mot nyre kapselen i en vinkel. (B) nyre kapsel fjernes best ved å gjøre en grunne snitt langs overlegen slutten av nyrene og (C) peeling nyre kapselen fra underliggende vev hemostat festing. (D) halverer nyre langs koronale aksen tillater visualisering av regionene cortex og forlengede. (E) isolasjon av cortex vev gjøres best ved skar ut biter av medulla vev med skalpell. Fargen på kortikale området er merkbart mørkere enn regionen form og kan brukes skille to anatomisk forskjellige vev. Siste behandling av cortex vev innebærer (F) dicing vevet i 0,5 cm3 deler til hjelpemiddel i påfølgende decellularization. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Decellularization av cortex vev. Visuelle og histologiske karakterisering av decellularized vev. (A.1) Submerging terninger cortex vev i 1% SDS løsning forårsaker lysing av celler og fjerning av mobilnettet materiale. Etter (A.2) 1 h og (A.3) 24 h, vev begynner å miste farge, som angir mobilnettet saken blir fjernet. Av (A.4) 120 timer vevet er forvellet og bare ECM gjenstår. Skyller med vann (A.5) 24 h og (A.6) 120 timer viser ingen synlige endringer til vev. (B) immunofluorescence farging av ubehandlet og decellularized cortex vev avslører nær fullstendig fjerning av mobilnettet saken og bevaring av store strukturelle proteiner (kollagen-IV = Col-IV; laminin = LAM; fibronectin = FN; heparin sulfate proteoglycans = HSPG; og vitronectin = VN). Skalaen = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: masse spektroskopi av decellularized vev. Analyse av decellularized cortex vev av massespektrometri å bestemme ECM protein komposisjon. Alle prosenter måles som masse prosent. (A) strukturelle og andre proteiner tilknyttet den basale lamina var kollagen-IV og - jeg blir de sterkt representert. (B.1) kollagen-IV A1 og A2 kjeder, allestedsnærværende i alle kjelleren membraner, ble bevart. Kollagen-IV A3 og A5 kjeder, bare i kjelleren membraner av glomerulus, ble også oppdaget. (B.2) felles isoformene av laminins og (B.3) kollagen-jeg fant også. Dette tallet ble gjengitt med tillatelse12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fabrikasjon av kECM hydrogel. Mekanisk og kjemisk behandling av decellularized cortex vev gir en gjennomførbar kECM hydrogel med tilstrekkelig mekaniske egenskaper etter gelation med nøytralisere reagenser. (A) decellularized cortex vev er mekanisk homogenisert med en vev homogenizer gjenstår ingen synlige biter av ECM. (B) en grov pulver ble gitt etter 3 dager under lyophilization. (C) Solubilization i HCl og kjemiske fordøyelsen med pepsin i scintillation ampuller resulterte i en gjennomførbar kECM hydrogel. Hydrogel var ugjennomsiktig og en lav viskositet. (D) fysiske karakterisering av kECM hydrogel etter gelation med nøytralisere reagenser. Reologiske eksperimenter ble utført med 30 mm diameter parallelle plate system. Eksempel kantene var beskyttet med mineralolje og lasting plattformen ble satt på 37 grader. KECM-hydrogel kunne gel 1t før testing. Viskoelastiske egenskaper av gel ble målt med et belastning sveip mellom 0,01 til 20%. Tre eksempler på både kECM og kollagen-jeg ble testet (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: celle vekst karakterisering. Karakterisering av morfologiske forskjeller i HKMECs dyrket på ulike matriser. Hydrogels ble blandet med nøytralisere reagenser og satt på 37 grader for 45 min i den polydimethylsiloxane former. HKMECs var sådd på overflaten av geléer og holdt i kultur 72 h å være fast og farget. Immunofluorescent bilder av HKMECs kultivert i (A og D) 7.5 mg/mL kollagen-jeg gel; (B og E) 7.5 mg/mL kECM gel; og (C og F) 7.5 mg/mL 1:1 blanding gel. (-Vekselstrøm): rød = CD31; grønn = VWF; blå = kjerner; skala bar = 50 µm. (D-F): rød = F-utgangen; grønn = PV1; blå = kjerner; skala bar = 50 µm. Dette tallet ble gjengitt med tillatelse12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matriser gir viktig mekaniske og kjemiske signaler som regulerer celle atferd. Syntetisk hydrogels er i stand til å støtte komplekse 3-dimensjonale mønster men ikke klarer å gi ulike ekstracellulære signaler i fysiologiske matrise microenvironments. Hydrogels fra innfødte ECM er ideelle materialer for både i vivo og vitro studier. Tidligere studier har brukt decellularized ECM hydrogels til coat syntetiske biologisk materiale for å hindre vert immunologiske svar33,34, for å skille stamceller35,36,37 , 38, som et substrat for 2D og myke litografi celle kultur39,40,41,42og i utarbeidelsen av bioinks for 3-dimensjonale utskrift43, 44 , 45 , 46. ECM hydrogels gi celler med riktig signal å starte vedheft og kontrollere videre spredning og differensiering2,47.
Prosenter og sammensetningen av hovedkomponentene i ECM, som collagens, laminins, elastin, fibronectin og glycosaminoglycans, er svært avhengig av anatomiske plasseringen og funksjonaliteten til vev48,49, 50. Det er godt etablert at uspesifikke eller ikke opprinnelige ECM-avledet hydrogels vil lokke fram feil svar celler21,51,52,53,54. I nyrene ECM komposisjon på varierer mellom anatomiske steder1,2. Derfor er det viktig å skille mellom regioner som cortex, marg eller papilla før fabrikere hydrogels for eksperimentell bruk.
KECM matrix fabrikkert her beholder opprinnelig nyre cortex ECM protein prosenter etter decellularization mens også gelation en fysiologisk relevante mekanisk stivhet3,25,28, 29,30. Serum albumin, en blodplasma protein, ble oppdaget i spormengder i decellularized cortex vevet, muligens på grunn av binding til heparin som rømte decellularization og skylling55,56. Selv om prosessen en ikke kjemisk å nyre cortex ECM, finnes i lager kECM løsningen, står den bare for 2,5% (w/v) på gelled sluttproduktet. Videre blir pepsin deaktivert med tillegg av nøytraliserende reagens løsning57.
KECM-hydrogel fungerer som et substrat som cortex-spesifikke nyreceller kan opprettholdes under fysiologiske forhold. Vi viste at denne matrisen kan støtte HKMEC vekst på en plan overflate. Disse HKMECs opprettholdt en passivisert fysiologisk tilstand som bestemmes gjennom funksjonelle analyser, fenotypiske uttrykk og genetisk uttrykk58. I kontrast, disse cellene ble aktivert når kollagen-jeg, en matrise komponent korrelert med nyre fibrosis, ble lagt til kECM hydrogel på en 1:1 ratio59. Sammenlikning når menneskelige umbilical blodåre endotelceller ble kultivert på kollagen-jeg, de var quiescent, og når de blandes med kECM de ble aktivert12. Følgelig kollagen-jeg er kjent for å være en integrert komponent i kjelleren membran sammensetningen i navlestrengen og senkes under patologiske tilstander som preeclampsia38,60. Disse resultatene markere betydningen av å gi celler vev-spesifikk signaler å opprettholde gågaten og også hvordan manipulasjon av ECM miljøet kan påvirke homeostase.
Mens alle trinn i disponerte prosedyren er viktig, er flere trinn avgjørende for å sikre levedyktigheten til fabrikkerte hydrogel. Graden av homogenisering av decellularized cortex vev vil variere basert på teknikk eller utstyr. Det er viktig å finne en teknikk som vil best homogenize vev. Under solubilization, bør pH holdes på 3-4 for å sikre pepsin er aktiv. Når blander hydrogel med nøytralisere reagenser, må gel blandes grundig og uten innføring av luftbobler. Hvis en enhetlig blanding er vanskelig å få tak, sjekk pH i gel løsningen å sikre den er nøytral.
Representant resultatene presentert i denne metoden viser hvordan en fysiologisk relevante matrise for å studere i vitro nyreceller kan oppnås. Decellularized nyre cortex ECM tilbyr en ideell base materiale for å støtte nyre-avledet cellevekst som ECM protein prosenter er bevart i den endelige hydrogel produkt3,25. Gelled produktet kan også oppnå fysiologisk relevante mekaniske egenskaper28,29,30. KECM-hydrogel gir riktig celle matrise interaksjoner og har vist seg å lokke fram høyere fysiologiske oppførsel fra nyreceller enn kollagen-jeg når kultivert på en plan overflate. Videre kan hydrogel være plantet med nyre-spesifikke celler før gelation å modellere et mer fysiologisk relevante 3-dimensjonal miljø. Sammensetningen av kECM hydrogel kan også bli lett manipulert. For eksempel blande hydrogel med varierende mengder kollagen-jeg før gelation kunne produsere matriser som etterligner progressiv statene nyre fibrose31,32. Tunability av denne ECM-avledet hydrogel å etterligne kjent syke ECM komposisjoner garanterer videre undersøkelser og vil muliggjøre fremtidig studiet av nyre sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institutt for Stem Cell og regenerativ medisin og LifeCenter nordvest. De ønsker også å erkjenne økonomisk støtte av National Institutes of Health tilskudd, UH2/UH3 TR000504 (å J.H.) og DP2DK102258 (til Y.Z.), NIH T32 trening grant DK0007467 (til R.J.N.) og en ubegrenset gave fra nordvest nyre sentrene til den Nyre Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -J., et al.
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
