Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att fabricera en njure cortex extracellulära matrix-derived hydrogel för att behålla den infödda njure extracellulära matrix (ECM) strukturella och biokemiska sammansättningen. Tillverkningsprocessen och dess tillämpningar beskrivs. Slutligen diskuteras ett perspektiv på använda denna hydrogel för att stödja njure-specifik cellulär och vävnad förnyelse och bioteknik.
Abstract
Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Nuvarande syntetiska hydrogels erbjuder robust mekanisk stöd för cellodling in vitro- men saknar den nödvändiga protein och ligand sammansättningen för att framkalla fysiologisk beteende från celler. Detta manuskript beskriver en fabrication metod för en njure cortex ECM-derived hydrogel med ordentlig mekanisk robusthet och stödjande biokemiska sammansättning. Hydrogel är tillverkad av mekaniskt homogenisering och solubilizing cell-lösa mänskliga njurar cortex ECM. Matrisen bevarar infödda njure cortex ECM protein nyckeltal och även möjliggöra gelation till fysiologiska mekaniska stiffnesses. Hydrogel serverar som substrat vid vilken njure cortex-derived celler kan upprätthållas under fysiologiska betingelser. Dessutom kan hydrogel sammansättning manipuleras för att modellera en diseased miljö som möjliggör framtida studier av njursjukdomar.
Introduction
Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Den komplexa molekylära sammansättningen reglerar både strukturella och funktionella egenskaper av vävnad. Strukturella proteiner förse cellerna med rumsuppfattning och möjliggöra adhesion och migration1. Destinerade ligands interagera med surface cellreceptorer att styra cell beteende2. Njure ECM innehåller en uppsjö av molekyler vars sammansättning och struktur varierar beroende på anatomiska läge, utvecklingsstadier och sjukdom stat3,4. Går igenom komplexiteten i ECM är en viktig aspekt i att studera njure-derived celler in vitro.
Tidigare försök att replikera ECM mikromiljö har fokuserat på decellularizing hela vävnad för att skapa ställningar kan recellularization. Decellularization har utförts med kemiska rengöringsmedel såsom natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) eller icke-joniskt rengöringsmedel, och det använder antingen hela orgel perfusion eller nedsänkning och agitation metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De ställningar som presenteras här bevara de strukturella och biokemiska signaler Funna i native vävnad ECM; Dessutom recellularization med givare-specifika celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi14,15,16,17,18, 19. dock dessa ställningar saknar strukturella flexibilitet och därför är inkompatibla med många aktuella enheter som används för in vitro- studier. För att kringgå den här begränsningen har många grupper bearbetas vidare cell-lösa ECM till hydrogels20,21,22,23,24. Dessa hydrogeler är kompatibla med formsprutning och bioink och kringgå mikrometer skala rumsliga begränsningar som cell-lösa ställningar plats på celler. Dessutom bevaras molekylära sammansättning och nyckeltal i native ECM3,25. Här visar vi en metod för att fabricera en hydrogel som härrör från njure cortex ECM (kECM).
Syftet med detta protokoll är att producera en hydrogel som replikerar närmiljön i regionen njure kortikala. Njure cortex vävnad är cell-lösa i en 1% SDS lösning under ständig agitation ta bort cellulära fråga. SDS används ofta till decellularize vävnad på grund av dess förmåga att snabbt ta bort immunologiska cellulära material6,7,9,26. KECM är då föremål för mekanisk homogenisering och frystorka den5,6,9,11,26. Lösbarhet i en stark syra med pepsin resulterar i en slutlig hydrogel stamlösning20,27. Infödda kECM proteiner som är viktiga för strukturellt stöd och signal transduktion bevaras3,25. Hydrogel kan också vara geléartad till inom en beställa av storlek av infödda mänskliga njurar cortex28,29,30. Denna matris ger en fysiologisk miljö som har använts för att bibehålla rofylld av njure-specifika celler jämfört hydrogels från andra matrix proteiner. Dessutom matrix sammansättning kan manipuleras, exempelvis genom tillägg av kollagen-I, till modell sjukdom miljöer för studien av nedsatt fibros och andra njur sjukdomar31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga njurar isolerades av LifeCenter nordväst efter etiska riktlinjer som fastställs av de Association av orgel upphandling organisationer. Detta protokoll följer djurens vård och cell-kultur riktlinjer beskrivs av University of Washington.
1. beredning av människans njure vävnad
- Beredning av decellularization lösning
- Sterilisera en 5000 mL bägare och en 70 x 10 mm rör bar.
- Blanda 1: 1000 (vikt: volym) sodium dodecyl sulfate (SDS) Ånghärdad avjoniserat vatten i bägaren. Låt lösningen verka en uppståndelse platta på ca 200 rpm för 24 h eller tills SDS är helt upplöst.
Obs: Vanligtvis 2500 mL 1% SDS lösning är tillräcklig för att decellularize en enda mänskliga njurar. - Överför lösningen till en 500 mL steril vakuum filter och filtrera den i steriliserad förslutningsbar behållare.
- Bearbetning av njure vävnad
- Tvätta och autoklavera ett par pincett, två hemostat klämmor, ett par allmänna service grad sax, två skalpell blad handtag, en 1000 mL-bägare täckt med aluminiumfolie och 36 x 9 mm rör bar.
- Line en vävnadskultur huva med underpad. Placera bägaren, en steril vävnadsodling maträtt (150 x 25 mm) och hela njuren orgeln i huven. Fyll bägaren med 500 mL 1% SDS lösning.
Obs: Mänskliga njurar mottogs på is från LifeCenter nordväst. - Placera njuren i sterila vävnadsodling skålen (figur 1A). Ta bort alla perirenal fett genom lätt rakning runt nedsatt kapseln med en skalpell (figur 1B).
- Göra ett grunt 8-10 cm snitt med en skalpell, bara tillräckligt djup för att bryta öppet nedsatt kapseln utan att skada underliggande cortex vävnad, över den överlägsna änden av njuren. Ta bort nedsatt kapseln genom att dra det från cortex vävnad med två hemostat klämmor (figur 1 c).
- Tudela njurarna längs koronalt planet med hjälp av skalpell längs den laterala sidan av njure (figur 1 d). Isolera cortex vävnad från båda halvorna av carving regionen medullar med skalpell (figur 1E) och tärna cortex vävnad i 0,5 cm3 bitar (figur 1F). Ta bort eventuella stora synliga kärl.
- Isolering av extracellulär matrix
- I en vävnadskultur huva, Fyll en 1000 mL-bägare med 500 mL 1% SDS. Placera den tärnade cortex vävnad och rör bar i bägaren innehållande SDS lösning. Täck bägaren med Ånghärdad aluminiumfolie och placera den på en uppståndelse platta på ca 400 rpm utanför vävnadsodling huven.
- Efter cortex vävnad har varit på uppståndelse plattan för 24 h, sätta bägaren i vävnadsodling huva och lägga till en 40 µm sterila cell SIL med nylon mesh. Fyll en separat 1000 mL bägare med 200 mL av blekmedel och placera den i vävnadsodling huven.
- Pipettera SDS lösning genom cell silen i bägaren som innehåller blekmedel. Pipettera ut alla SDS lösning tills endast cell-lösa vävnad och cell silen kvar i bägaren.
Obs: Cell silen bör förhindra att någon vävnad tas bort under lösning aspiration. - Lämna cellen silen i bägaren och fyll med 500 mL färsk SDS lösning. Täck bägaren med samma aluminiumfolie och placera på en uppståndelse tallrik med samma hastighet som innan.
- Upprepa steg 1.3.1-1.3.3 varje dygn med färska SDS lösning för totalt fem dagar.
- Skölj cell-lösa vävnad med Ånghärdad DI vatten varje 24 h för 3 dagar totalt, efter den teknik som beskrivs i steg 1.3.1-1.3.3.
- Skölj cell-lösa vävnad med cell kultur grade vatten varje 24 timmar för 2 dagar totalt, efter den teknik som beskrivs i steg 1.3.1-1.3.3.
- Upprepa steg 1.3.1-1.3.2. Överföra cell-lösa vävnaden (kallad kECM från denna punkt på) till en 30 mL fristående koniska tube och fyll den med cell kultur grade vatten tills alla vävnaden är nedsänkt.
2. tillverkning av Hydrogel lager lösning
- Mekanisk bearbetning av cell-lösa vävnad
- I en vävnadskultur huva, mekaniskt homogenisera kECM inom koniska röret med en vävnad Homogenisatorer för 2 min.
Obs: Homogeniserade kECM bör likna en ogenomskinlig lösning med inga synliga bitar av ECM. - Sänk den koniska rör som innehåller kECM i flytande kväve tills kokande kring röret inte längre kvarstår. Lagra kECM på-4 ° c över natten.
- I en vävnadskultur huva, mekaniskt homogenisera kECM inom koniska röret med en vävnad Homogenisatorer för 2 min.
- Frystorka den frysta cell-lösa vävnad
- Lossa något konisk tube locket för att möjliggöra för gasutbyte och placera röret i en maskin som frystorka den. Lyophilize kECM i tre dagar eller tills det liknar ett fint vitt pulver. Butik vid-4 ˚C.
- Kemisk nedbrytning och lösbarhet av gel
- Autoklav en 20 mL injektionsflaska av scintillation och cap, en 15,9 x 7,9 mm rör bar och ett par böter-tip pincett.
- Väger den frystorkade kECM och beräkna volymen av HCl och pepsin behövs för att solubilize kECM till en 3% (30 mg/mL) lösning med hjälp av följande ekvationer, där mpepsin är massan av pepsin massa, mvävnad är massan av frystorkade vävnad och VHCl är volymen av 0,01 N HCl:
- Lägga till svin magsäckens pepsin, 0,01 N HCl och uppståndelse baren till injektionsflaskan scintillation i vävnadsodling huva, och lämna den på en uppståndelse platta på ca 500 rpm tills alla pepsin är upplöst. Överför den frystorkade kECM till scintillation injektionsflaskan och låt lösningen på en uppståndelse platta på ca 500 rpm i tre dagar.
3. Hydrogel Gelation
- Njure ECM hydrogel förberedelse
- Gel av hydrogel genom att blanda kECM hydrogel stamlösning med 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), och cell kultur media. Hålla alla lösningar på is.
Obs: Sista gel koncentrationer på 7,5 mg/mL användes för cellodling. 1 mL av kECM gel var tillräckligt för cell kultur experiment presenteras. - Bestäm volymen av fungerande kECM gel produceras och mängden lager kECM hydrogel behövs med hjälp av följande ekvation, där Vslutliga är volymen av gel skapade, Vlager kECM är volymen av lager kECM hydrogel behövs, Cbeståndet kECM är koncentrationen av de lager kECM hydrogel och Cslutliga är koncentrationen av den slutliga gel:
- Bestäm volymen av neutraliserande reagenser som behövs med hjälp av följande ekvationer, där VNaOH är volymen av 1 N NaOH, V10 X är volymen av M199 10 X media komplettera och V1 X är den volym av cell kultur media:
- I en vävnadskultur huva, Pipettera neutraliserande reagenserna (NaOH, M199 och cell kulturmassmedia) i en steril 30 mL fristående koniska tube. Blanda neutraliserande reagenslösningen med en microspatula.
- Använd en steril 1 mL spruta för att överföra lämplig volym av lager kECM hydrogel till neutraliserande reagenslösningen. Använd en microspatula för att blanda försiktigt lösningen tills en homogen i färgen hydrogel lösning erhålls.
Obs: Undvik att införa luftbubblor genom omrörning långsamt och försiktigt. - För att införliva celler i den kECM hydrogel, subtrahera 10 µL cell kultur media (V1 X) från neutraliserande lösning volymberäkningar i steg 3.1.1.3.
- Avbryta celler till 10 µL av cell kultur media. Bestämma antalet celler att upphävas med hjälp av följande ekvation, där #celler innebär antalet celler att avbryta och Vslutliga är volymen av gel skapade:
Obs: 300 000 celler/mL är koncentrationen av celler som används i kECM gel. - Pipettera den 10 µL av cell upphängd lösning in i slutliga kECM gel efter kECM stamlösningen har blandats med neutraliserande reagenslösningen. Rör om lösningen med en microspatula tills cellerna är jämnt fördelade.
- Avbryta celler till 10 µL av cell kultur media. Bestämma antalet celler att upphävas med hjälp av följande ekvation, där #celler innebär antalet celler att avbryta och Vslutliga är volymen av gel skapade:
- Gel av hydrogel genom att blanda kECM hydrogel stamlösning med 1 N NaOH, 10 x Media Supplement (M199), och cell kultur media. Hålla alla lösningar på is.
- Använda en 1 mL injektionsspruta för att fylla en önskad cell kultur enhet med den kECM hydrogel.
- Låt gelen att ställa vid 37 ˚C för 1 h innan överföring eller plätering celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kECM hydrogel erbjuder en matris för njure cellodling med liknande kemiska sammansättning som den infödda njure mikromiljö. För att fabricera hydrogel, är njure cortex vävnad mekaniskt isolerad från en hela njuren orgel och tärnade (figur 1). Decellularization med kemiska tvättmedel (figur 2A.1-A.3) följt av sköljning med vatten för att avlägsna rengöringsmedlet partiklar (figur 2A.4-A.6) ger isolerade njure cortex ECM. Histologisk undersökning bekräftar typiska basala laminar proteiner såsom kollagen-IV och laminin och strukturella proteiner såsom kollagen-jag bevaras, med Aktiebolaget Trav & galopp som enda noterade undantag (figur 2B). Protein sammansättning, inklusive bevarandet av isoformer, i ECM fortfarande är dessutom förenlig med observerade värden i native njure ECM (figur 3). ECM (figur 4A) är mekaniskt homogeniseras och frystorkade (figur 4B) sedan solubilized för att producera den slutliga kECM hydrogel (figur 4 c). Den kECM hydrogel verkade ogenomskinlig med små mängder av synliga vävnad och var inte så trögflytande som traditionella kollagen-jag hydrogel. Reologisk mätning av geléartad kECM med en koncentration på 15 mg/mL avslöjade en komplex elasticitetsmodul (dynamisk elasticitetsmodul) omkring 800 Pa över stam linjära intervallet värden, betydligt större än 7,5 mg/mL kollagen-jag (p = 1.602E-14). Mänskliga njurar peritubular mikrovaskulära endotelceller (HKMECs) odlade på kollagen-I, kECM och en 1:1 blandning gel visade skillnaderna i fenotyp, särskilt i CD31 uttryck runt cellytan och korsningar (figur 5). HKMECs odlade på kollagen-jag visas enhetliga CD31 uttryck medan HKMECs odlade på de två geler som innehåller kECM visas minskade CD31 uttryck i ojämn distributioner. Matrix typ föreföll inte påverka den höga PV1 och låga VWF uttryck i HKMECs.
Figur 1: isolering av njure cortex vävnad. Mekanisk bearbetning av en hela njuren organ att isolera cortex vävnad som ett utgångsmaterial för den kECM hydrogel. Mekanisk isolering börjar med (A) avlägsnande av perirenal fettvävnaden. Stora bitar av fettvävnad kan rivas bort från njuren med hemostat klämmor. Återstående delar av fettvävnad kan tas bort genom att köra en skalpell mot nedsatt kapseln i en vinkel. (B) nedsatt kapseln avlägsnas bäst genom att göra en grunda snitt längs den överlägsna änden av njure och (C) skalar nedsatt kapseln från den underliggande vävnaden med hemostat klämmor. (D) bisecting njurarna längs koronalt axeln möjliggör visualisering av Regionkommittén cortex och medulla. (E) isolering av cortex vävnad görs bäst genom snida ut bitar av medulla vävnaden med en skalpell. Färgen på kortikal regionen är märkbart mörkare än för regionen medullar och kan användas skilja två anatomiskt distinkta vävnader. Slutlig bearbetning av cortex vävnad innebär (F) tärningsgaller vävnaden i 0,5 cm3 bitar till stöd i efterföljande decellularization. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Decellularization cortex vävnad. Visuella och histologiska karakteriseringen av cell-lösa vävnad. (A.1) Submerging tärnad cortex vävnad i 1% SDS lösning orsakar lyseringslösning cellerna och borttagning av cellulära material. Efter (A.2) 1 h och (A.3) 24 h, vävnaden börjar förlora färg, indikerande cellulära fråga tas bort. Av (A.4) 120 h vävnaden är skållade och endast ECM förblir. Sköljer med vatten vid (A.5) 24 h och (A.6) 120 h visar inga synliga förändringar i vävnad. (B) immunofluorescens färgning av obehandlade och cell-lösa cortex vävnad avslöjar nära fullständigt avlägsnande av cellulära fråga och bevarande av stora strukturella proteiner (kollagen-IV = Col-IV, laminin = LAM; Fibronektin = FN; heparin sulfate proteoglykaner = HSPG; och Aktiebolaget Trav & galopp = VN). Skala = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: massa spektroskopi av cell-lösa vävnad. Analys av cell-lösa cortex vävnad genom masspektrometri att bestämma ECM protein sammansättning. Alla nyckeltal mäts som massa procent. (A) struktur och andra proteiner som är associerad med den basala lamina var närvarande med kollagen-IV och -jag återges mest högt. (B.1) kollagen-IV A1 och A2 kedjor, allestädes närvarande i alla källare membran, var bevarad. Kollagen-IV A3 och A5 kedjor, närvarande endast i källaren membran av glomeruli, upptäcktes också. (B.2) gemensamma isoformer av lamininer och (B.3) kollagen-jag upptäcktes också. Denna siffra var Reproducerad med tillstånd12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tillverkning av kECM hydrogel. Mekanisk och kemisk behandling av cell-lösa cortex vävnad ger en fungerande kECM hydrogel med tillräckliga mekaniska egenskaper efter gelation med neutraliserande reagenser. (A) cell-lösa cortex vävnad är mekaniskt homogeniserad med en vävnad Homogenisatorer tills inga synliga bitar av ECM återstår. (B) ett grovt pulver var gav efter 3 dagar under frystorka den. (C) lösbarhet i HCl och kemisk matsmältning med pepsin i en injektionsflaska av scintillation resulterade i en fungerande kECM hydrogel. Hydrogel var ogenomskinlig och av en låg viskositet. (D) fysisk karakterisering av den kECM hydrogel efter gelation med neutraliserande reagenser. Reologiska experimenten utfördes med en 30 mm diameter parallellt plattan systemet. Prov kanterna skyddades med mineralolja och lastning plattformen sattes vid 37 ˚C. Den kECM hydrogel tilläts gel för 1 h före provning. Viskoelastiska egenskaper gelen mättes med en stam Svep mellan 0,01 till 20%. Tre prover av både kECM och kollagen-jag testades (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cell tillväxt karakterisering. Karakterisering av morfologiska skillnader i HKMECs odlas på olika matriser. Hydrogeler var blandat med neutraliserande reagenser och vid 37 ° c i 45 min i öppen Polydimetylsiloxan formar. HKMECs var seedade på ytan av gelerna och förvaras i kultur för 72 h innan att fixeras och färgas. Immunofluorescerande bilder av HKMECs odlade i (A och D) 7,5 mg/mL kollagen-jag gel; (B och E) 7,5 mg/mL kECM gel; och (C och F) 7,5 mg/mL 1:1 blandning gel. (A-C): röd = CD31; grön = VWF; blå = atomkärnor; skalstapeln = 50 µm. (D-F): röd = F-aktin; grön = PV1; blå = atomkärnor; skalstapeln = 50 µm. Denna siffra var Reproducerad med tillstånd12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matriser ger viktiga mekaniska och kemiska signaler som styr cellen beteende. Syntetiska hydrogels kan stödja komplexa 3-dimensionella mönster men misslyckas med att tillhandahålla olika extracellulära ledtrådar finns i fysiologiska matrix mikromiljö. Hydrogeler härrör från infödda ECM är perfekt material för både i vivo och in vitro- studier. Tidigare studier har använt cell-lösa ECM hydrogeler för att bestryka syntetiskt biomaterial för att förhindra värd immunologiska svar33,34, för att differentiera stamceller35,36,37 , 38, som substrat för 2D och mjuk litografi cell kultur39,40,41,42, och i utarbetandet av bioinks för 3-dimensionell utskrift43, 44 , 45 , 46. ECM hydrogeler ger celler med korrekt signalering att initiera vidhäftning och styra ytterligare proliferation och differentiering2,47.
Av nyckeltal och sammansättning av viktiga komponenter av ECM, såsom kollagen, lamininer, elastin, Fibronektin och glykosaminoglykaner, är starkt beroende av den anatomiska läge och funktionalitet i de vävnad48,49, 50. Det är väletablerat att använda ospecifik eller nonnative ECM-derived hydrogels kommer framkalla felaktig svar från celler21,51,52,53,54. I njuren varierar ECM sammansättning kraftigt mellan anatomiska platser1,2. Det är därför viktigt att skilja mellan regioner som cortex, medulla eller papilla innan fabricera hydrogeler för experimentell användning.
Matrisen kECM fabricerade här bevarar ursprunglig njure cortex ECM protein kvot för decellularization och även möjliggöra gelation till ett fysiologiskt relevanta mekaniska stelhet3,25,28, 29,30. Serumalbumin, ett protein som blodplasma, upptäcktes i spårmängder inom cell-lösa cortex vävnad, möjligen på grund av bindning till heparin som undgått decellularization och sköljning55,56. Även om pepsin, en icke-infödda kemikalie till njure cortex ECM, finns i lager kECM lösningen, står den bara för 2,5% (w/v) av den slutliga geléartad produkten. Dessutom blir pepsin avaktiveras med tillägg av de neutraliserande reagens lösning57.
Den kECM hydrogel serverar som substrat som cortex-specifika njurceller kan upprätthållas under fysiologiska betingelser. Vi visade att denna matris kan stödja HKMEC tillväxt på en plan yta. Dessa HKMECs underhålls en quiescent fysiologiska tillstånd som bestäms genom funktionella analyser, fenotypisk expression och genetiska uttryck58. Däremot dessa celler blev aktiverad när kollagen-I, en matris komponent korrelerade med njure fibros, lades till den kECM hydrogel vid en 1:1 ratio59. Som jämförelse när mänskliga navel ven endothelial celler odlades på kollagen-jag, de var oföretagsam, och när det blandas med kECM de blev aktiverat12. Följaktligen, kollagen-jag är kända för att vara en integrerad del av basalmembranet sammansättning inom navelsträngen och minskar under patologiska tillstånd som havandeskapsförgiftning38,60. Dessa resultat betona vikten av att förse cellerna med vävnadsspecifika ledtrådar att upprätthålla rofylld och också hur manipulation av ECM miljön kan påverka homeostas.
Alla steg i förfarandet som beskrivs är viktigt, är flera steg kritiska för att säkerställa lönsamheten för den påhittade hydrogel. Graden av homogenisering av cell-lösa cortex vävnad varierar beroende på teknik eller utrustning som används. Det är viktigt att hitta en teknik som bäst kommer att homogenisera vävnaden. Under lösbarhet, ska pH hållas vid 3-4 för att säkerställa pepsin är aktiv. När man blandar hydrogel med neutraliserande reagenser, måste gelen blandas noggrant och utan införandet av luftbubblor. Om en enhetlig blandning är svårt att få, kontrollera pH-värdet av gellösningen för att säkerställa att den är neutral.
De representativa resultat som presenteras i denna metod visar hur en fysiologiskt relevanta matris för in vitro- studier av njurceller kan uppnås. Cell-lösa njure cortex ECM ger en idealisk bas material för att stödja njure-derived celltillväxt som ECM protein nyckeltal bevaras i den slutliga hydrogel produkt3,25. Geléartad produkten kan också uppnå fysiologiskt relevanta mekaniska egenskaper28,29,30. Den kECM hydrogel möjliggör korrekt cell-matrix interaktioner och har visat sig framkalla större fysiologisk beteende från njure celler än kollagen-jag när odlade på en plan yta. Dessutom kan hydrogel dirigeras med njure-specifika celler före gelation att modellera en mer fysiologiskt relevanta 3-dimensionell miljö. Sammansättningen av den kECM hydrogel kan också lätt manipuleras. Till exempel blandning av hydrogel med varierande mängder av kollagen-jag före gelation kunde producera matriser som efterliknar progressiva stater av nedsatt fibros31,32. Tunability av denna ECM-derived hydrogel att efterlikna kända sjuka ECM kompositioner motiverar ytterligare utredning och möjliggör framtida studier av njursjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Lynn och Mike Garvey Imaging Laboratory vid Institutet för stamceller och regenerativ medicin och LifeCenter nordväst. De skulle också vilja erkänna finansiella stöd av National Institutes of Health bidrag, UH2/UH3 TR000504 (att J.H.) och DP2DK102258 (till Y.Z.), NIH T32 utbildning grant DK0007467 (till R.J.N.) och en obegränsad gåva från Northwest njure centrerar till den Njure Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -J., et al.
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
