Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

ماوس البويضات المخصبة والأجنة مرحلة مبكرة محمية بواسطة zona pellucida، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات. توضح هذه المقالة بروتوكول لتثقيب زونا بليزر ترانسدوسي الخلايا الجنينية مع ناقلات لينتيفيرال وخلق الفئران المعدلة وراثيا.

Abstract

لينتيفيروسيس ناقلات فعالة لإيصال الجينات إلى خلايا الثدييات. وبعد توصيل، الجينوم لينتيفيرال ستابلي أدمجت في كروموسوم المضيف ويتم تمريره إلى ذرية. وبالتالي، نواقل مثالية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة و في فيفو تقديم مؤشرات، وتوصيل البيض خلية واحدة مخصبة لخلق الحيوانات المحورة وراثيا. ومع ذلك، الفأرة المخصبة البيض وأوائل مرحلة الأجنة محمية بواسطة بيلوسيدا زونا، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات لينتيفيرال. Lentiviruses كبيرة جداً لاختراق زونا وهي عادة ألقاه microinjection الجسيمات الفيروسية في تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية. شرط التكنولوجيين ذوي المهارات العالية والمعدات المتخصصة قد التقليل من استخدام لينتيفيروسيس لتوصيل الجينات للأجنة الماوس. توضح هذه المقالة بروتوكول بيرميبيليزينج البيض الفأرة المخصبة تثقيب زونا بليزر. تثقيب الليزر لا ينتج أي ضرر على الأجنة ويسمح لينتيفيروسيس للوصول إلى الخلايا الجنينية لإيصال الجينات. يمكن أن تتطور لتصبح الكيسة في المختبر، وإذا كان مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت، تتطور إلى الجراء المعدلة وراثيا الأجنة ترانسدوسيد. الليزر المستخدمة في هذا البروتوكول فعالة وسهلة الاستخدام. ودمج الخلايا الجنينية الماوس الجينات ألقاه lentiviruses ستابلي germline المعدية. هذا هو أسلوب بديل لإيجاد الفئران المعدلة وراثيا التي تتطلب لا ميكرومانيبوليشن و microinjection البويضات المخصبة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هذا الأسلوب يوفر إرشادات مفصلة عن بيرميبيليزينج بيلوسيدا زونا البيض الفأرة المخصبة جعل الخلايا الجنينية موجوداً لإيصال الجينات التي لينتيفيروسيس. لينتيفيروسيس مصممة بطبيعتها لإيصال الجينات تتسم بالكفاءة لخلايا الثدييات. أنها تصيب الفاصل وعدم تقسيم الخلايا ودمج الجينوم لينتيفيرال الكروموسومات المضيف1. سهولة توسيع نطاق الخلايا المضيفة لينتيفيرال من بسيودوتيبينج lentivirus المؤتلف مع التهاب الفم الحويصلي الفيروس بروتين سكري (منظمة-ز)، سبب انتحاء واسعة من البروتين منظمة-ز2. وبعد توصيل، ستابلي الجينات لينتيفيرال متكاملة والتعبير عنها كجزء من الكروموسومات المضيف إنشاء أداة مثالية لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا. إذا سلمت إلى المرحلة المبكرة الخلايا الجنينية، الجينوم لينتيفيرال تكرارها والمعرب عنها في الكائن الحي كامل. وقد أدى إلى إنتاج الفئران والجرذان، والدجاج والسمان توصيل لينتيفيرال وخنزير3،،من45،،من67 من بين الأنواع الأخرى من الوراثي. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب النموذجي لإيصال الجينات لينتيفيرال، الفنيين المهرة والمعدات المتخصصة للتغلب على الحاجز zona pellucida بتغليف الأجنة المرحلة المبكرة. والهدف العام لهذا الأسلوب لوصف كيفية بيرميبيليزي زونا استخدام ليزر لتسهيل إيصال الجينات لينتيفيرال.

بيض الثدييات محاطة بيلوسيدا زونا التي يصلب بعد الإخصاب لحماية البيض المخصب ضد بوليسبيرمي والحد من التفاعلات البيئية8،9. زونا أشكال حاجز الذي يحتفظ لينتيفيروسيس بعيداً عن الخلايا الجنينية حتى هي دبرت الأجنة الكيسة. المستزرعة الفأرة المخصبة يفقس البيض بعد 4 أيام ويجب أن يكون مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت قبل الفقس للتطور الطبيعي في الجراء. ولذلك، لتوصيل، هي ميكروينجيكتيد لينتيفيروسيس قبل الفقس من زونا تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية.

غالباً ما تتم إزالة بيلوسيدا زونا للاخصاب في الأنابيب من البويضات البشرية لزيادة معدل التسميد10. ومع ذلك، الكيميائية إزالة الماوس zona pellucida سلبا يؤثر نمو الجنين الماوس والضارة بالخلايا الجنينية11،12. طرق أخرى لإيصال الجينات إلى البيض الفأرة المخصبة التغلب على الحاجز zona pellucida microinjection المباشر للحمض النووي في نواة الخلية13. Pronuclear microinjection وسيلة فعالة لإيصال الجينات إلى الأجنة. ومع ذلك، منذ يقام كل الأجنة في مكان على حدة ل microinjection، يمكن الممارسة شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً لمستخدم مبتدئ.

أساليب أخرى مثل انهانسر وفوتوبوريشن مفيدة عابرة وإيصال الجينات القصيرة الأجل للماوس يخصب البيض14،،من1516. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع لتوصيل المكونات كريسبر-Cas9 وريكومبيناسيس. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التسليم انهانسر وفوتوبوريشن من الجينات كفاءة لخلق الوراثي. المني التي يتم جمعها من البربخ الماوس ثقب يمكن أيضا ترانسدوسيد من لينتيفيروسيس وتستخدم للاخصاب في المختبر لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا17،،من1819، 20.

في هذا البروتوكول، وتيسر إيصال الجينات لينتيفيرال للأجنة الماوس بيرميبيليزينج زونا استخدام ليزر. وقد وضعت الليزر زيكلون كمساعدة للاخصاب في الأنابيب 21 وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية22. وهو جهاز صغير بسيط للإعداد وسهلة الاستخدام. مرة واحدة مثبتة على مجهر، تحتل المساحة من عدسة الهدف ويسمح البرنامج المصاحب لهدف الليزر بينما كانوا يبحثون عن طريق العدسات المجهر (انظر البروتوكول: الفرع 3). مرة واحدة هو مثقب زونا واسطة الليزر زيكلون، يمكن إدخال لينتيفيروسيس في ثقافة وسائل الإعلام ل إيصال الجينات23. يمكن استخدام لينتيفيروسيس متعددة في نفس الوقت تقديم عدة جينات لإدماج الكروموسومات.

هذا البروتوكول سوف تصف كيفية عزل والماوس الثقافة يخصب البيض، ويوضح استخدام الليزر لانثقاب بيلوسيدا زونا ويوضح توصيل الماوس الخلايا الجنينية بواسطة لينتيفيروسيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع الإجراءات الحيوان والعلاجات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت متفقة مع المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية في المعاهد الوطنية للصحة/نيس وأقرها "رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (ACUC) في المعاهد الوطنية للصحة/نيس، الحيوان البروتوكول 2010-0004.

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد/شراء المؤتلف لينتيفيروسيس عدم نشر تحمل الجينات الخاصة بك للفائدة. في هذه الدراسة، لينتيفيروس SBI511 التعبير عن البروتين copepod أخضر نيون (كوبجفب؛ مختصر للتجارة والنقل) من استطالة استخدمت عامل 1a المروج لتوصيل. البروتوكولات القياسية2 استخدمت لإنتاج وعيار لينتيفيروسيس في التتر أعلى من الوحدات 1e8 ترانسدوسينج كل مل (تي يو/mL).
    ملاحظة: يجب توخي الحذر والتبييض كل المواد التي كانت على اتصال مع لينتيفيروسيس. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للمعهد الخاص بك للاستخدام الأمن والتعامل مع لينتيفيروسيس.
  2. إعداد تربية زوج من سلالة الماوس المطلوب اليوم قبل الحصاد الأجنة. واستخدمت في هذه التجربة، C57BL/6J سلالة من الفئران. لا يعاملون الفئران الإناث المستخدمة المبايض وجمع قناة مع أي هرمونات سوبيروفوليشن.
  3. ح 2-24 قبل حصاد البيض الفأرة المخصبة، إعداد عدة لوحات قطره24 (كسم) "متوسطة البوتاسيوم الأمثل البسيط" على النحو التالي: إضافة قطره 50 ميكروليتر من متوسطة كسم في وسط صحن المعالجة بزراعة الأنسجة 35 ملم والغطاء مع 2 مل من ديميثيلبوليسيلوكساني (DMPS5X) ومكان في 37 سج و 5% CO2، 5% O2 و 90% N2 حجته.
    ملاحظة: استخدام المتاح لوحات العقيمة، وتجاهل عقب التعرض إلى لينتيفيروسيس.
  4. إعداد 1 x الحل للبروتين السكري المثبط في المتوسط M2 من حل الأسهم (100 x, 30 ملغ/مل، تخزين في-20 درجة مئوية). أعد 100 × الحل مخزون المياه.
  5. ح 24 وظيفة توصيل الليزر-بمساعدة من البيض الفأرة المخصبة، إعداد تربية أزواج بين الفئران الذكور والإناث استؤصل الاسهر لديهم لإعداد الفئران الإناث بسيودوبريجنانت.

2-عزل الفأرة المخصبة البيض

  1. ح 16 – 24 وظيفة التزاوج، حدد الفئران الإناث مع المقابس المهبل يدل على نجاح التزاوج ومعاملة إنسانية euthanize25. وقد euthanized الفئران المستخدمة في هذه الدراسة بخلع عنق الرحم تحت العميق استنشاق أول أكسيد الكربون2 أو إيسوفلوراني.
  2. عزل المبايض وأوفيدوكتس وفقا للبروتوكولات القياسية25.
  3. نقل المبيض وأوفيدوكتس إلى طبق 35 ملم تحتوي على وسائط الإعلام M2.
  4. لكل المبيض، تمزق ampulla أربا بالإفراج عن البيض المخصب محاطة بخلايا الركام.
  5. نقل البويضات المخصبة وخلايا الركام إلى 35 مم طبق يحتوي على البروتين السكري المثبط x 1 في المتوسط M2 واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 – 5 دقائق.
  6. بيبيت يخصب البيض صعودا وهبوطاً للإفراج عن الخلايا الركام.
  7. نقل البويضات المخصبة إلى طبق 35 ملم التي تحتوي على وسائط الإعلام M2 وبيبيت صعودا وهبوطاً ليغسل البروتين السكري المثبط.
  8. نقل البويضات المخصبة إلى طبق 35 ملم التي تحتوي على كسم وبيبيت صعودا وهبوطاً يغسل بقية وسائط الإعلام M2 والبروتين السكري المثبط.
  9. نقل البويضات المخصبة إلى لوحات قطره كسم استعدادا من الخطوة 1، 3.
    ملاحظة: يجب أن يوضع البيض الفأرة المخصبة في كسوم في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5% CO2، % 5 س2 و 90% ن2 حجته. إزالة لوحات من الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة سيؤدي إلى أضرار للأجنة.
  10. السماح للبيض المخصب لاسترداد ح 2 في الحاضنة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

3-انثقاب الفأرة المخصبة البيض مع الليزر زيكلون

  1. إعداد ومعايرة الليزر زيكلون وفقا لتوصية الشركة المصنعة. الأخرى أشعة الليزر، ويستخدم عادة للاخصاب في الأنابيب ، يمكن أن تكون بديلاً لليزر زيكلون التسلخات البويضات المخصبة.
    1. إرفاق سلك مربع تحكم الليزر إلى جهاز ليزر في المجهر.
    2. إرفاق مربع تحكم الليزر إلى الكمبيوتر الذي يشغل البرنامج الليزر عبر منفذ USB. 3.1.3. قم بتوصيل وحدة التحكم بالليزر وتشغيله.
    3. النظر من خلال العدسة، التسلخات عينة اختبار (مثلاً الجاف-محو علامات على شريحة زجاجية).
    4. تستخدم سائق المسمار صغيرة (المضمنة في أدوات الليزر) لضبط X وموقف Y من الليزر بحيث تتطابق مع LED الضوء مرئياً من خلال العدسة مجهر ومعايرة الليزر.
  2. ضع لوحة إسقاط كسم التي تحتوي على البيض الفأرة المخصبة في مرحلة مجهر. لا تحتفظ باللوحة خارج الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة.
  3. ننظر من خلال العدسة مجهر وضمان أن zona pellucida للجنين في التركيز والليزر LED الضوء مرئياً.
  4. الانتقال من مرحلة مجهر لاستهداف زونا مع الصمام الخفيفة/الليزر.
  5. استخدام برامج الكمبيوتر تعيين الليزر زيكلون إلى 250 ميكروثانية.
  6. قم بضبط حجم الصمام الخفيفة إلى الأبعاد المطلوبة (إعداد 5 في هذه التجربة).
  7. انثقب زونا للبويضة المخصبة كل ثلاث مرات مع الليزر. ويمكن زونا أما مثقوبة أو ضعفت. استخدام الإعدادات أعلاه، سوف تنتج الليزر حفرة قطرها 10 ميكرومترات (الشكل 2).
    ملاحظة: هدف قريب من الجسم القطبي يبقى الليزر بعيداً عن الخلية الجنينية.
  8. السماح للبيض المخصب لاسترداد ح 2 في حاضنة استنبات الأنسجة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

4-توصيل الماوس يخصب البيض بعد انثقاب الليزر زيكلون

  1. بيبيت 2 ميكروليتر من مركزة لينتيفيروس (أكبر من عيار 1e8 تو/mL) إلى انخفاض كسم 50 ميكروليتر. عدم بيبيت صعودا وهبوطاً. سهولة إرفاق البويضات المخصبة بنصيحة بيبيت. استناداً إلى تجربتنا، وحدات 1e5-5e5 ترانسدوسينج من لينتيفيروس في وحدة تخزين أقل من 3 ميكروليتر الأمثل لإيصال الجينات.
  2. تسمح البويضات المخصبة أن تتطور إلى الكيسة لمدة 4 أيام في الحاضنة. لا حاجة لتغيير الوسائط.

5-غير الجراحية نقل الأجنة ترانسدوسيد الماوس للفئران الحوامل الزائفة

  1. استخدام بسيودوبريجنانت الفئران، بعد التزاوج، يوم 3.5 إعداد في الخطوة 1، 5.
  2. استخدام جهاز لنقل الجنين غير الجراحية (نسيت) لزرع الأجنة الماوس في الفئران بسيودوبريجنانت.
    1. باستخدام مجهر الجراحية أو تشريح، إدراج منظار المهبل رؤية عنق الرحم.
    2. أدخل جهاز نقل الجنين غير الجراحية (نسيت) حوالي 5 ملم في عنق الرحم وإيداع الأجنة في حجم حوالي 2 ميكروليتر.
      ملاحظة: تستخدم لنقل كل جهاز نسيت عقيمة والتخلص منها بعد الإجراء. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في التلاعب بالأجنة العقيمة.
  3. نقل الكيسة صحية 10 – 15 في حجم 2 ميكروليتر كسوم لكل الفئران بسيودوبريجنانت.
  4. الاستمرار في رصد وقياس زيادة الوزن في الفئران بسيودوبريجنانت في الأيام التالية لتحديد ما إذا نسيت كانت ناجحة.
  5. استرداد الجراء بالسماح للفئران الحامل أن تلد طبيعيا أو إجراء قيصرية بعد نقل الجنين2617 يوما. عملية قيصرية ضروري غالباً ما إذا كان يوجد عدد قليل جداً من الأجنة وأنها تنمو كبيرة جداً للولادة الطبيعية.
  6. جمع الأنسجة من الجراء عن التنميط لتحديد معدل ترانسجينيسيس27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يمكن التحقق من وضع البيض معزولة ترانسدوسيد الفأرة المخصبة تحت المجهر يوميا (الشكل 1). وضع أجنة صحية في الكيسة في غضون 3 – 4 أيام. في هذا البروتوكول، وضع 60 – 70% أجنة غير المعالجة في الكيسة23. من أصل 114 الأجنة ترانسدوسيد مثقوبة الليزر، تطورت 54 الكيسة (نسبة 47 في المائة) وأعرب 46 blastocysts التجارة والنقل (46/54 = 85%)23.

وكانت الأجنة الماوس مثقوبة الليزر في يوم الحصاد. الإعداد الأمثل للعلاج بالليزر 3 ثقوب في البويضة المخصبة وينبغي أن تهدف إلى السيدة 250 الليزر رقيقة زونا بدلاً من إنشاء حفرة (الشكل 2). وهذا يسمح للأجنة النامية الاستفادة من بيلوسيدا زونا التغليف سليمة بينما تصبح المتساهلة لتوصيل لينتيفيرال. في هذه التجارب، كانت ترانسدوسيد الأجنة الماوس مع lentivirus المؤتلف الذي أعرب عن كوبيبود التجارة والنقل (المختصر بروتينات فلورية خضراء) من المروجين 1a عامل استطالة. لتوصيل, أدخل إبري 2 من لينتيفيروس في وسائل الإعلام الثقافة. زيادة كمية الفيروس، المتأثرة مباشرة عدد الأجنة ترانسدوسيد الذي أعرب عن بروتينات فلورية خضراء بينما يؤثر سلبا على التنمية الجنين في الكيسة23. الفيروسية كميات أكبر من 10% حجم قطره كسم سيؤثر سلبا أيضا على تشكيل الكيسة (مثلاً أكبر من 5 ميكروليتر من الفيروس في انخفاض كسم 50 ميكروليتر).

للتحقق من صلاحية، نقل الأجنة الماوس ترانسدوسيد غير جراحيا للفئران بسيودوبريجنانت. ستة نسيت أحداث منفصلة، نقل ما مجموعة 58 الكيسة، أسفرت عن 9 بروتينات فلورية خضراء الجراء المحورة وراثيا من أصل ما مجموعة 12، مما أسفر عن معدل 75% من ترانسجينيسيس 23. ويقال البروتوكول نسيت أن تسفر عن 30-35 في المائة من المواليد28 مقابل 21% الغلة التي لوحظت في تجاربنا (12/58). فقد لعبت دوراً في تطور الجنين معاملة لينتيفيرال وأسهم في معدل نقل الجنين منخفضة. الجراء مع التكاملات لينتيفيرال والتعبير عالية من بروتينات فلورية خضراء متعددة كانت بصريا الخضراء تحت مصباح LED زرقاء (465-470 nm) (الشكل 3). عدد النسخ مدمجة في التجارة والنقل تراوحت بين 0-6 نسخ ومصممة عن طريق إجراء PCR النوعي في الحمض النووي الكروموسومات معزولة من الأنسجة ألجرو23.

Figure 1
رقم 1: وضع الماوس ترانسدوسيد يخصب البيض في الثقافة- وتم رصد البيض الفأرة المخصبة C57BL/6J في اليوم 0 (البويضة المخصبة المقطوع)، اليوم 1 (اثنين-خلية)، اليوم 2 (8-16 الخلايا)، اليوم 3 (morula)، ويوم 4 (الكيسة). كانت ترانسدوسيد الأجنة مع lentivirus تحمل جين التجارة والنقل. كما اتضح وجود الأسفار في الأجنة ترانسدوسيد يوم 2-3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2:-العلاج بالليزر للفأرة المخصبة البيض. أمثلة لتثقيب زونا لإنتاج مقابل ثقب رقيق زونا.

Figure 3
الشكل 3: الفئران المعدلة وراثيا معربا عن التجارة والنقل- القارئ الظلام (الدكتور بقعة مصباح، درسل-9S) استخدمت لتصور الجراء بروتينات فلورية خضراء إيجابية في بيئة مظلمة. المعدلة وراثيا في عدم مراقبة الجراء أضيفت إلى الفريق للتباين. وكانت الجراء الناتجة (الأسهم الحمراء) جينوتيبيد والوارد من 0-6 نسخ من الجين لينتيفيرال/بروتينات فلورية خضراء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قدرة لينتيفيروسيس على الاندماج على جينوم مضيف يجعلها متجه مثالية لإيصال الجينات مستقرة. يمكن أن تحمل ناقلات لينتيفيرال يصل إلى 8.5 كيلوبس زوج (kbp) المواد الجينية التي يمكن أن تستوعب المروجين خلية محددة أو إيندوسيبلي أو علامات التحديد مويتيس الفلورسنت. يمكن إجراء نسخ متماثل كجزء من جينوم مضيف بهم أدرجت المواد الجينية وتنظيمها للتعبير عن أو إلغاء تنشيطه في النقاط الزمنية المطلوبة. هذه المتجهات السماح الزمانية المكانية من التحكم في التعبير الجيني في مراحل مختلفة من التنمية ولينتيفيروسيس العلامة التجارية كأدوات قوية لإيصال الجينات.

ساعد الليزر ترانسجينيسيس لينتيفيرال طريقة فعالة وسهلة الاستخدام للجينات التعبير في فيفو. يمكن استخدام هذا الأسلوب في فيفو إنتاج البروتين، التعبير عن مؤشرات المشفرة جينياً، أو الدراسات الفنية. مقارنة بالأساليب الأخرى، إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر فعالة كما pronuclear microinjection لكن لا تتطلب أي مهارات فنية أو محطات العمل microinjection مكلفة. الليزر زيكلون الصغيرة المحمولة، ويمكن بسهولة أن تتقاسم عدة مختبرات.

إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر مستقرة ولا عابرة، كما هو الحال في انهانسر أو فوتوبوريشن البويضات المخصبة. إيصال الجينات عابر هو المزيد من المزايا لتسليم المكونات كريسبر-Cas9 أو ريكومبيناسيس منذ التعبير الموسعة يمكن أن تؤدي إلى نتائج شاذة. في هذا البروتوكول، يمكن أن يكون محل lentiviruses integrase ناقصة (إيدلفس) لتوصيل عابر من البيض الفأرة المخصبة. إيدلفس الاحتفاظ بالعدوى لينتيفيرال ولكن فقط الاحتفاظ بجزء صغير (أقل من 8 في المائة) القدرة التكاملية lentiviruses29. ساعد الليزر ترانسجينيسيس لينتيفيرال خيار تسليم جينات إضافية للمستخدمين لتقييم استناداً إلى نتائجها المرجوة.

أما العيب الرئيسي لتوصيل لينتيفيرال هو الإدراج عشوائية من الجينات تم تسليمها. أيضا، يمكن استضافة الخلايا داخل الجنين نفس التكاملات لينتيفيرال متعددة تؤدي إلى mosaicism في محوره وراثيا. الوراثي النسل وجولات متعددة لتربية المخطط ضروري لإقامة الحيوانات المحورة وراثيا محور واحد. ويعمل استراتيجيات تربية مماثلة أيضا في الأساليب التقليدية ترانسجينيسيس30.

خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو طول الوقت الذي يقضيه في ثقب الليزر. لا يمكن الاحتفاظ بالبيض الفأرة المخصبة المزروع في كسم خارج الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة. مستخدم مبتدئ ينبغي نقل البيض المخصب إلى المتوسطة M2، استخدام "متقدمة متوسطة الجنين كسم"، أو الحد من عدد الأجنة للوحة الواحدة. وفقا لنتيجة أعمالنا، 47% بيض ترانسدوسيد الماوس مثقف المخصبة تتطور إلى بلاستوسيستس23. ولذلك، سيكفل استزراع 30-40 بيضة مخصبة في لوحة عدد كاف من بلاستوسيستس ترانسدوسيد في لوحة واحدة لنقل في الفئران بسيودوبريجنانت.

تثقيب الليزر-بمساعدة من زونا البويضة المخصبة الماوس قد أيضا لا ينطبق على زونا الأنواع الأخرى والسماح بالدخول لأنواع أخرى من الفيروسات أو الكواشف تعداء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث "برنامج البحوث الداخلية" للمعهد الوطني للصحة (NIH)، "الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية" (نيس). ونحن ممتنون للدكتور روبرت بيتروفيتش والدكتور جيسون وليامز لقراءة نقدية للمخطوطات ونصائح مفيدة. كما نود أن نعترف وأشكر الدكتور بيرند اللمعان ولب خروج المغلوب ومرفق التدفق الخلوي، مجهرية Fluorescence ومركز التصوير وتسهيلات "نسبية الطب فرع" نيس لمساهماتهم الفنية. ونود أن نشكر السيد ديفيد غولدنغ من "فرع الطب المقارن" والسيدة لويس ويريك من مركز التصوير في نيس على تزويدنا بالصور والرسوم التوضيحية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443, (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15, (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7, (4), e35335 (2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7, (12), e50817 (2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13, (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2, (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74, (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77, (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6, (11), e27677 (2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99, (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79, (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28, (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9, (3), e91892 (2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27, (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006, (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23, (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14, (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82, (14), 7111-7119 (2008).
بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter