Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.

Abstract

Lentiviruses gen teslim memeli hücreleri için verimli vektörleridir. İletim, lentiviral genom stabil ana bilgisayar kromozom kurulmuştur ve döl için geçirilir. Böylece, onlar istikrarlı hücre hatları oluşturulması, vivo içinde teslim edilmesi göstergeleri ve iletim transjenik hayvanlar oluşturmak için tek hücre döllenmiş yumurta için ideal vektörleridir. Ancak, fare yumurta döllenmiş ve erken sahne embriyolar zona pelusida, lentiviral gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Lentiviruses zona nüfuz için fazla büyüktür ve genellikle viral parçacıkların mikroenjeksiyon perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine tarafından teslim edilir. Çok yetenekli teknoloji ve özel ekipman gereksinimini fare embriyo gen teslim için lentiviruses kullanımını en aza. Bu makalede bir lazer ile zona perfore tarafından fare döllenmiş yumurta permeabilizing için bir iletişim kuralı. Lazer-delikli embriyolar için herhangi bir hasara yol açmaz ve lentiviruses embriyonik hücreler gen teslim için erişim sağlar. Transduced embriyoların blastosist in vitro geliştirmek ve pseudopregnant farelerde implante transgenik pups geliştirmek. Bu protokol için kullanılan etkili ve kullanımı kolay lazerdir. Stabil lentiviruses tarafından teslim genler fare embriyonik hücreleri birleştirmek ve germline nakle engel vardır. Hiçbir embriyolardan gerektirir transgenik fareler oluşturulması ve mikroenjeksiyon döllenmiş yumurta için alternatif bir yöntem bu.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yöntem embriyonik hücreleri tarafından lentiviruses gen teslim için erişilebilir hale getirmek için fare döllenmiş yumurta zona pelusida permeabilizing için ayrıntılı yönergeler sağlar. Lentiviruses doğa verimli gen teslim edilmek üzere memeli hücreleri tarafından tasarlanmıştır. Hücrelerin bölünmesi ve bölme bulaştırmak ve lentiviral genom onların ana bilgisayar kromozom1entegre. Lentiviral konak hücre aralığını kolayca VSV-G protein2geniş tropism nedeniyle vesicular Stomatit virüs glikoprotein (VSV-G), ile rekombinant lentivirus pseudotyping tarafından genişletilir. İletim lentiviral genler stabil entegre ve ana bilgisayar kromozomlarını transjenik hayvanlar oluşturmak için ideal bir araç oluşturma bir parçası olarak dile getirdi. Eğer erken sahne embriyonik hücreler için teslim lentiviral genom çoğaltılır ve tüm organizmada dile getirdi. Lentiviral iletim fare, sıçan, tavuk, bıldırcın üretimi için yol açmıştır ve3,4,5,6,7 transgenics diğer türler arasında domuz. Lentiviral gen teslim, tipik yöntemi ancak, yetenekli teknisyenler ve özel ekipman erken sahne embriyo Kapsüller zona pelusida engeli aşmak için gerektirir. Bu yöntem genel amacı lentiviral gen teslim kolaylaştırmak için bir lazer kullanarak zona permeabilize nasıl tarif etmektir.

Memeli yumurta döllenme ve çevresel etkileşimleri8,9döllenmiş yumurta polyspermy karşı korumak için takip sertleşir zona pelusida tarafından çevrili. Zona embriyoların blastosist yumurtadan kadar uzak embriyonik hücreleri lentiviruses tutan bir bariyer oluşturur. Kültürlü fare yumurta kapağı 4 gün sonra döllenmiş ve damızlık pups içine normal gelişim için önce pseudopregnant fareler içine implante olması gerekir. Bu nedenle, iletim için perivitelline boşluğu, zona ve embriyonik hücreleri arasında boşluk içine zona üzerinden tarama önce lentiviruses microinjected.

Zona pelusida kez vitro fertilizasyon insan yumurta döllenme oranı10artırmak için kaldırılır. Ancak, fare zona pelusida kimyasal kaldırılması olumsuz fare embriyo gelişimi etkiler ve embriyonik hücreleri11,12' ye zararlıdır. Diğer yöntemler gen teslim edilmek üzere fare döllenmiş yumurta DNA doğrudan mikroenjeksiyon içine hücre çekirdeği13tarafından zona pelusida engeli aşmak. Pronuclear mikroenjeksiyon genler embriyolar için teslim etkili bir yoludur. Ancak, bu yana her embriyo mikroenjeksiyon için tek tek bir yerde tutulur, uygulama zahmetli ve zaman alıcı bir acemi kullanıcı için olabilir.

Elektroporasyon ve fotoporasyon gibi diğer yöntemleri geçici için yararlı ve kısa vadeli gen teslim fare için döllenmiş yumurta14,15,16. Bu yöntemler, CRISPR-Cas9 bileşenleri ve adlandırılan teslim etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, genlerin Elektroporasyon ve fotoporasyon teslim transgenics oluşturmak için verimli bir şekilde kullanılamaz. Delinmiş fare epididim toplanan sperm hücreleri de lentiviruses tarafından transduced ve vitro fertilizasyon için transjenik hayvanlar17,18,19, üretmek için kullanılan 20.

Bu protokol için fare embriyo lentiviral gen teslim bir lazer kullanarak zona permeabilizing tarafından yönetilir. XYClone lazer vitro fertilizasyon21 ve embriyonik kök hücre22tarımı için yardımcı olarak geliştirilmiştir. Bu kurulumu basit ve kullanımı kolay küçük bir aparat var. Bir kez bir mikroskobunun yüklü, o bir objektif lens yer kaplar ve eşlik eden yazılımın mikroskop göz mercekleri ile bakarken Lazer hedefleyen için izin verir ( iletişim kuralıbkz: Bölüm 3). Bir kez zona XYClone lazer tarafından delikli, lentiviruses gen teslim23Kültür Medya içine tanıttı olabilir. Birden fazla lentiviruses aynı anda birkaç genlerin kromozom birleşme için teslim etmek için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı yalıtmak nasıl anlatacağım ve kültür fare yumurta döllenmiş, zona pelusida perforasyon için lazer kullanılışını ve fare embriyonik hücreleri iletim tarafından lentiviruses gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan yordamlar ve bu protokol için kullanılan tedaviler NIH/NIEHS hayvan bakımı yönergeleri ile uyumlu olduğunu ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), hayvan iletişim kuralı 2010-0004 NIH/NIEHS tarafından kabul edildi.

1. hazırlıkları

  1. Rekombinant yayılıyor lentiviruses ilgi, gen taşıyan hazırlamak/satınalma. Bu çalışmada, copepod yeşil flüoresan protein ifade lentivirus SBI511 (copGFP; GFP için kısaltılır) bir uzama iletim için faktör 1a organizatörü kullanıldı. 2 üretmek için kullanılan standart iletişim kuralları ve titresi lentiviruses titreleri 1e8 transducing birim-mL (TU/mL) daha yüksek.
    Not: dikkatli olun ve lentiviruses ile temas halinde olan tüm malzeme çamaşır suyu. Enstitü nün yönergeleri güvenli kullanımı ve lentiviruses kullanımı için başvurun.
  2. İstenen fare zorlanma üreme çift bir gün önce embriyo hasat Kur. Bu deneyde fareler C57BL/6J suşu kullanılmıştır. Yumurtalıklar ve ovidukt koleksiyonu için kullanılan dişi fareler ovumun için herhangi bir hormonları ile tedavi değil.
  3. 2-24 h fare döllenmiş yumurta, hasat öncesinde aşağıdaki gibi birkaç potasyum Simplex en iyi duruma getirilmiş orta24 (KSOM) açılan tabak hazırlamak: 2 mL ile bir 35 mm doku kültürü tedavi çanak ve kapak orta KSOM orta bir 50 μL damla eklemek Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) ve 37 oC, % 5 CO2, %5 O2 ve % 90'ı N2 equilibrate için.
    Not: tek kullanımlık steril tabak kullanın ve ardından lentiviruses maruz atın.
  4. 1 x çözümü hyaluronidase M2 orta hisse senedi çözümden hazırlamak (100 x, 30 mg/mL, mağaza-20 ° C'de). 100 x hisse senedi çözüm suda hazırlanmıştır.
  5. 24 saat sonrası Lazer destekli iletim fare döllenmiş yumurta, çiftleri pseudopregnant dişi fareler hazırlamak için vasectomized erkek ve dişi fareler arasında üreme ayarla.

2. fare yalıtım yumurta döllenmiş

  1. 16-24 h sonrası çiftleşme, vajinal fişler başarılı çiftleşme gösterge ile dişi fareler seçin ve insanca25ötenazi. Bu çalışmada kullanılan fare altında derin CO2 veya isoflurane inhalasyon servikal çıkığı euthanized.
  2. Yumurtalık ve oviducts göre standart protokolleri25izole etmek.
  3. Yumurtalık ve oviducts M2 ortamı içeren bir 35 mm çanak aktarın.
  4. Her yumurtalık için ayrı ampulla döllenmiş yumurta kümülüs hücreleri tarafından çevrili serbest bırakmak için gözyaşı.
  5. Döllenmiş yumurta transferi ve 35 mm kümülüs hücreleri içeren 1 x hyaluronidase M2 orta çanağı ve 3-5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  6. Damlalıklı yukarı ve aşağı kümülüs hücreleri serbest bırakmak için yumurta döllenmiş.
  7. Döllenmiş yumurta M2 medya ve damlalıklı yukarı ve aşağı hyaluronidase yıkamak için içeren bir 35 mm çanak aktarın.
  8. Döllenmiş yumurta KSOM ve damlalıklı yukarı ve aşağı yıkama kalan M2 medya ve hyaluronidase içeren bir 35 mm çanak aktarın.
  9. Döllenmiş yumurta hazır KSOM damla plakaları için adım 1.3 aktarın.
    Not: KSOM fare döllenmiş yumurta bir doku kültürü kuluçka 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 ve equilibrate % 90'ı N-2 tutulmalıdır. Kuluçka makinesi 15 dk daha uzun süre plakaları kaldırılıyor embriyolar için zarar görmesine neden.
  10. Sonraki adıma geçmeden önce 2 h kuluçka için kurtarmak döllenmiş yumurta izin.

3. fare delikli XYClone lazer ile yumurta döllenmiş

  1. Kurulum ve XYClone lazer üreticinin tavsiye göre kalibre. Genellikle vitro fertilizasyon için kullanılan diğer lazerler, XYClone lazer için döllenmiş yumurta ekleyip yedek olabilir.
    1. Lazer denetleyicisi kutusu tel üzerinde mikroskop lazer cihazı takın.
    2. Lazer denetleyicisi kutusu lazer yazılım yolu ile a USB liman çalıştıran bilgisayara takın. 3.1.3. lazer denetleyicisi takın ve açın.
    3. Mercek ile seyir, bir test örneği (örneğin bir cam slayt üzerinde kuru-erase işaretler) sorgulamaktı.
    4. X ayarlamak için (lazer kitinde) küçük bir tornavida kullanın ve Y konumunu LED eşleştirmek için lazer ile mikroskop mercek görünür ışık ve lazer kalibre.
  2. Mikroskop sahne alanı'ndaki fare döllenmiş yumurta içeren bir KSOM açılan tabak koyun. Kalenin dışında da kuluçka 15dk daha uzun süre tutmayın.
  3. Mikroskop mercek ile bakmak ve embriyo'nın zona pelusida odaklanmıştır ve lazer LED ışık görünür olduğundan emin olun.
  4. LED ışık/lazer ile zona hedeflemek için mikroskop sahne alanı hareket ederler.
  5. Bilgisayar yazılımı kullanarak XYClone lazer için 250 μs ayarlayın.
  6. LED ışık boyutu istenen boyutlara (5 Bu deneyde ayarlama) ayarlayın.
  7. Her döllenmiş yumurta zona üç kez lazer ile sorgulamaktı. Zona ya deldi inceltilerek veya. Yukarıdaki ayarlarla, lazer çapı 10 mikron (Şekil 2) bir delikle üretecek.
    Not: kutup vücut yakın hedefleyen Lazer embriyonik hücre uzak tutar.
  8. Sonraki adıma geçmeden önce 2 h doku kültürü kuluçka için kurtarmak döllenmiş yumurta izin.

4. fare iletim XYClone lazer perforasyon takip yumurta döllenmiş

  1. Damlalıklı 2 μL içine 50 μL KSOM damla konsantre lentivirus (1e8 TU/mL titresi fazla). Değil damlalıklı yukarı ve aşağı yap. Döllenmiş yumurta kolayca damlalıklı ucunu takın. Bizim deneyime dayalı, 1e5-5e5 transducing lentivirus 3 μL'den küçük bir hacim içinde birimdir gen teslim edilmek üzere en uygun.
  2. Döllenmiş yumurta için kuluçka makinesi 4 günde blastosist geliştirmeye olanak sağlar. Medya değiştirmenize gerek yoktur.

5. cerrahi olmayan Transduced fare embriyo Transfer sözde hamile farelere

  1. Pseudopregnant fareler, çiftleşme sonra 3,5 gün 1.5 adımda hazırlanan kullanın.
  2. Fare embriyo pseudopregnant fareler implant için sigara cerrahi embriyo transferi (NTHE) aygıtı kullanın.
    1. Cerrahi ya da diseksiyon mikroskop kullanarak, serviks görselleştirmek için vajinal spekulum ekleyebilirsiniz.
    2. Sigara Cerrahi embriyo transferi (NTHE) aygıt yaklaşık 5 mm bir hacmi yaklaşık 2 μL serviks ve mevduat embriyo içine yerleştirin.
      Not: Bir steril NTHE aygıt her transfer için kullanılan ve işlemden sonra atılır. Tüm reaktifler embriyo manipülasyon kullanılan steril olmalıdır.
  3. 10-15 sağlıklı blastosist 2 μL hacmine KSOM her pseudopregnant fareler için transfer.
  4. Pseudopregnant farelerde kilo alımı NTHE başarılı olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki günlerde ölçmek ve izlemek devam edin.
  5. Yavruları doğal olarak doğurmak hamile fareler izin veya bir sezeryan 17 gün sonra26embriyo transferi gerçekleştirmek kurtarmak için. Sezeryan genellikle çok az embriyo varsa ve onlar için doğal Doğum çok büyük büyümek gereklidir.
  6. Doku pups Genotipleme transgenesis27oranını belirlemek için toplamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İzole/transduced fare döllenmiş yumurta gelişimi mikroskop altında günlük (Şekil 1) kontrol edilebilir. Sağlıklı embriyoların blastosist 3-4 gün içinde geliştirmek. Bu protokol için 60-%70 tedavi edilmezse embriyo geliştirmek blastosist23. 114 lazer delikli transduced embriyo dışarı, 54 geliştirilen blastosist (oranı % 47) ve 46 blastokistlerin ifade GFP (%46/54 85 =)23.

Fare embriyo lazer delikli hasat günü. Lazer tedavisi için en uygun ayarı döllenmiş yumurtanın başına 3 delik oldu ve 250 Bayan lazer (Şekil 2) bir delik oluşturmak yerine zona ince amaçlanmıştır. Bu gelişmekte olan embriyo lentiviral iletim için keyfi olma süre sağlam bir encapsulating zona pelusida yarar sağlar. Bu deneylerde fare embriyo bir uzama faktör 1a organizatörü copepod GFP (kısaltılmış GFP) ifade edilen bir rekombinant lentivirus ile transduced. İletim için lentivirus 2 uL Kültür Medya içine tanıtıldı. Virüs miktarını artırarak, doğrudan blastosist23içine embriyo gelişimi olumsuz yönde etkileyen süre GFP ifade transduced embriyo sayısı etkilenen. Viral KSOM damla hacminin % 10 büyük birimler blastosist oluşumu (Örneğin virüs içinde 50 μL KSOM damla 5 μL büyüktür) da olumsuz yönde etkileyebilir.

Canlılığı doğrulamak için transduced fare embriyo cerrahi olarak sigara pseudopregnant fareler için transfer. Altı ayrı NTHE olaylar, 58 blastosist, toplam 12, transgenesis %2375 oranı verimli dışarı 9 GFP transgenik pups sonuçlandı toplam aktarma. NTHE Protokolü bizim deneylerde tespit edildi %21 verim kıyasla % 30-35 canlı Doğum28 vermeye bildirilmektedir (12/58). Lentiviral tedavisi embriyo gelişiminde bir rol oynadı ve düşük embriyo transfer hızı için katkıda olabilir. Yavru birden çok lentiviral entegrasyonlar ve GFP yüksek ifadesi ile görsel olarak bir mavi LED lamba (465-470 nm) altında yeşil (Şekil 3). Anonim GFP kopya sayısını 0-6 değişiyordu kopyalar ve yavru doku23kromozom DNA izole kalitatif PCR gerçekleştirerek belirlendi.

Figure 1
Şekil 1: Transduced fare gelişimi döllenmiş yumurta kültür. C57BL/6J fare döllenmiş yumurta gün 0 (hasat döllenmiş yumurta), gün 1 (iki hücreli) gün 2 (8-16 hücreleri), 3. gün (morula) ve gün 4 (blastosist) takip. Embriyo GFP gen taşıyan bir lentivirus ile transduced. Transduced embriyo floresans varlığında gün 2-3 tarafından belli oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: fare lazer tedavisi döllenmiş yumurta. Bir delik vs zona inceltme üretmek için zona perfore örnekleri.

Figure 3
Şekil 3: transgenik fareler GFP ifade. Karanlık okuyucu (DR Spot lamba, DRSL-9) karanlık bir ortamda GFP olumlu pups görselleştirmek için kullanıldı. Sigara transgenik denetim yavrular için kontrast grubuna eklenmiştir. Ortaya çıkan yavrular (kırmızı oklar) genotyped ve 0-6 içerdiği lentiviral gen/GFP kopyalarını.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lentiviruses onların ana bilgisayar genom entegre yeteneği onları istikrarlı gen teslim için ideal bir vektör yapar. Lentiviral vektörel çizimler ilâ 8.5 kilobaz çifti (kbp) hücre özgü veya indüklenebilir rehberleri, seçim işaretleri veya floresan moieties ağırlayacak genetik malzemesinin taşıyabilir. Anonim genomik malzeme onların ana bilgisayar genom parçası olarak çoğaltabilir ve hızlı veya istediğiniz zaman noktalarda devre dışı bırakmak için düzenlenir. Bu vektörler gen ifadesi çeşitli aşamalarında geliştirme ve marka lentiviruses olarak gen teslim için güçlü araçlar üzerinde kronolojik zamanmekansal denetim için izin verir.

Lentiviral transgenesis lazer destekli gen ifade içinde vivoiçin etkili ve kullanımı kolay bir yöntemdir. Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış içinde vivo protein üretimi, genetik olarak kodlanmış göstergeleri veya fonksiyonel çalışmalar ifade için. Diğer yöntemlerine göre lazer destekli lentiviral gen teslim pronuclear mikroenjeksiyon etkilidir ama hiçbir teknik beceri ya da pahalı mikroenjeksiyon iş istasyonları gerektirir. XYClone lazer küçük, taşınabilir ve kolayca çeşitli laboratuvarlar arasında paylaşılabilir.

Lentiviral gen lazer destekli teslimat istikrarlı ve değil geçicidir, Elektroporasyon veya fotoporasyon döllenmiş yumurta gibi olur. Geçici gen teslim'dır CRISPR Cas9 bileşenleri veya adlandırılan daha avantajlı olduğu için genişletilmiş ifade anormal sonuçlara yol açabilir. Bu protokol için integrase eksik lentiviruses (IDLVs) fare döllenmiş yumurta geçici iletim için yedek olabilir. IDLVs lentiviral infektivite korur ancak sadece bir kısmı (% 8'den az) lentiviruses29bütünleştirici yeteneğini muhafaza. Lentiviral transgenesis lazer destekli bir ek gen teslim seçeneği kullanıcıların değerlendirmek onların istenen sonucu üzerinde dayanır.

Büyük lentiviral iletim teslim edilen gen rasgele ekleme dezavantajdır. Ayrıca, aynı embriyo içindeki hücreleri mozaizm transgenik içinde yol açan birden çok lentiviral entegrasyonlar barındırabilir. Döl Genotipleme ve planlanan ıslah birden fazla mermi tek locus transgenik hayvan kurmak gereklidir. Benzer üreme stratejileri de geleneksel transgenesis yöntemleri30' istihdam edilmektedir.

Bu iletişim kuralı bir kritik lazer perforasyon üzerinde harcanan süreyi adımdır. KSOM içinde kültürlü fare döllenmiş yumurta 15 dk daha uzun süre inkübatör dışında tutulması olamaz. Bir acemi Kullanıcı, gelişmiş KSOM embriyo orta kullanın veya plaka başına embriyo sayısını sınırlamak döllenmiş yumurta M2 ortamına taşımak gerekir. Bizim sonucu göre %47 transduced kültürlü fare döllenmiş yumurta blastokistlerin23geliştirmek. Bu nedenle, 30-40 döllenmiş yumurta plaka başına kültür transduced blastokistlerin transfer pseudopregnant fareler içine bir tabak içinde yeterli sayıda sağlayacaktır.

Lazer destekli perforasyon fare döllenmiş yumurta zona, ayrıca diğer türler zona için geçerli olabileceğini ve virüs veya transfection reaktifler diğer türleri için giriş izni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Dr Robert Petrovich ve Dr Jason Williams için kritik okuma el yazması ve faydalı tavsiyeler için minnettarız. Biz de kabul ve Dr. Bernd Gloss, altını gizleme çekirdek, akış sitometresi tesis, floresans mikroskobu ve görüntüleme merkezi ve NIEHS Karşılaştırmalı Tıp şube tesislerin teknik katkılarından dolayı teşekkür ederiz istiyorum. Bay David Goulding Karşılaştırmalı Tıp şubesinden ve Bayan Lois Wyrick görüntüleme Merkezi, bize fotoğraf ve illüstrasyonlar ile sağlamak için NIEHS teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443, (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15, (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7, (4), e35335 (2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7, (12), e50817 (2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13, (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2, (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74, (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77, (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6, (11), e27677 (2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99, (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79, (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28, (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9, (3), e91892 (2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27, (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006, (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23, (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14, (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82, (14), 7111-7119 (2008).
Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter