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Biology

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.

Abstract

Lentiviren sind effiziente Vektoren für gen-Lieferung für Säugerzellen. Nach Transduktion Lentivirale Genom ist stabil in das Host-Chromosom integriert und werden an die Nachkommen weitergegeben. Daher sind sie ideale Vektoren für die Schaffung von stabilen Zelllinien, in Vivo Lieferung von Indikatoren und Transduktion Einzelzelle befruchtete Eier transgene Tiere zu erstellen. Aber Maus befruchtete Eier und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen Lentivirale gen Lieferung bildet. Lentiviren sind zu groß, um die Zona durchdringen und werden in der Regel durch Mikroinjektion von viralen Partikel in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen geliefert. Der Bedarf an hochqualifizierten Technologen und spezialisierte Ausrüstung hat die Verwendung von Lentiviren für gen-Lieferung an Mäuseembryonen minimiert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Maus, die befruchteten Eier durch Perforation der Zona mit einem Laser permeabilizing. Laser-Perforation führt nicht Schäden an Embryonen und Lentiviren Zugriff auf embryonale Zellen für gen Lieferung ermöglicht. Ausgestrahlt Embryonen können entwickeln sich zu Blastozysten in-vitro- und wenn bei pseudopregnant Mäusen implantiert in transgenen Welpen entwickeln. Die in diesem Protokoll verwendeten Laser ist effektiv und einfach zu bedienen. Gene stabil von Lentiviren geliefert in embryonalen Mauszellen integrieren und Keimbahn übertragbare sind. Dies ist eine alternative Methode zur Erstellung von transgenen Mäusen, die keine Mikromanipulation erfordert und Mikroinjektion von befruchteten Eiern.

Introduction

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Diese Methode bietet detaillierte Anweisungen für die Zona Pellucida der Maus befruchtete Eier permeabilizing embryonale Zellen von Lentiviren gen Lieferung zugänglich zu machen. Lentiviren sind naturgemäß für effiziente gen Lieferung für Säugerzellen ausgelegt. Sie trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und ihre Gastgeber Chromosomen1das Lentivirale Genom integrieren. Das Lentivirale Wirtszellen ist leicht durch Pseudotyping der rekombinanten Lentivirus mit vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G), aufgrund der breiten Tropismus des VSV-G Protein2erweitert. Nach Transduktion Lentivirale Gene stabil integriert und als Teil ihrer Host-Chromosomen schaffen ein ideales Werkzeug zur Erzeugung transgener Tiere ausgedrückt. Frühen Stadium embryonalen Zellen geliefert, das Lentivirale Genom repliziert und ausgedrückt in den gesamten Organismus. Lentivirale Transduktion hat dazu geführt, die Produktion von Mäusen, Ratten, Huhn, Wachtel und Schwein3,4,5,6,7 unter anderen Arten von gentechnisch veränderten Pflanzen. Die typische Art der Lentivirale gen Lieferung, erfordert jedoch qualifizierte Techniker und Spezialgeräte, die Zona Pellucida-Barriere zu überwinden, die die frühen Embryonen kapselt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Zona mit Hilfe eines Lasers auf um Lentivirale gen Lieferung zu erleichtern permeabilize beschreiben.

Säugetier Eier sind von der Zona Pellucida umgeben, nach Befruchtung härtet, die befruchteten Eier gegen Polyspermy zu schützen und Umweltwechselwirkungen8,9zu beschränken. Die Zona bildet eine Barriere, die Lentiviren Weg von den embryonalen Zellen hält, bis die Embryonen als Blastozyste ausgebrütet werden. Kultivierte Maus befruchteten Eiern schlüpfen nach 4 Tagen und muss in pseudopregnant Mäuse vor der Schraffur für eine normale Entwicklung in Welpen implantiert werden. Daher sind für die Transduktion, Lentiviren vor dem schlüpfen aus der Zona in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen mikroinjiziert.

Die Zona Pellucida wird oft für in-vitro- Befruchtung der menschlichen Eizellen, die Befruchtung Rate10erhöhen entfernt. Jedoch chemische Entfernung der Maus Zona Pellucida nachteilig wirkt sich auf die Entwicklung des Embryos und ist schädlich für die embryonalen Zellen11,12. Andere Methoden für die gen-Lieferung an Maus befruchtete Eier überwunden die Zona Pellucida Barriere durch direkte Mikroinjektion von DNA in die Zelle Kern13. Man Mikroinjektion ist ein effizientes Mittel zur Bereitstellung von Genen für Embryonen. Da jedes Embryo im Ort individuell für die Mikroinjektion stattfindet, kann die Praxis mühsam und zeitaufwendig für einen Neuling jedoch.

Andere Methoden wie Electroporation und Photoporation eignen sich für transiente und kurzfristige gen Lieferung an Maus befruchtete Eier14,15,16. Mit diesen Methoden sind ausführlich für die Bereitstellung von CRISPR-Cas9 Komponenten und Rekombinasen. Electroporation und Photoporation Bereitstellung von Gene jedoch kann nicht effizient zum gentechnisch veränderten Pflanzen zu schaffen. Spermien, die aus punktierten Maus Nebenhoden gesammelt werden können auch von Lentiviren ausgestrahlt und für in-vitro- Befruchtung verwendet, um transgene Tiere17,18,19, zu produzieren 20.

In diesem Protokoll wird die Lentivirale gen Lieferung an Mäuseembryonen durch permeabilizing der Zona mit Hilfe eines Lasers erleichtert. Die XYClone Laser wurde als Hilfsmittel für in-vitro- Befruchtung21 und Anbau von embryonalen Stammzellen22entwickelt. Es ist ein kleiner Apparat, der einfach zu installieren und einfach zu bedienen ist. Einmal installiert am Mikroskop, es den Raum von einem Objektiv nimmt und die mitgelieferte Software ermöglicht mit dem Ziel des Lasers beim Blick durch das Mikroskop Okulare (siehe Protokoll: Abschnitt 3). Sobald die Zona vom XYClone Laser perforiert ist, können die Nährmedien für gen Lieferung23Lentiviren eingeführt. Mehreren Lentiviren könnte verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Gene für chromosomale Integration liefern.

Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie zu isolieren und Kultur Maus Eier befruchtet, veranschaulicht die Verwendung der Laser für die Perforation der Zona Pellucida und zeigt die Signalweiterleitung Maus embryonalen Zellen von Lentiviren.

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Protocol

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Alle tierischen Verfahren und Behandlungen, die in diesem Protokoll verwendeten wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der NIH/NIEHS Tierbetreuung und vom Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (ACUC) am NIH/NIEHS, Tier-Protokoll 2010-0004 genehmigt wurden.

1. Vorbereitungen

  1. Vorbereitung/Kauf rekombinante nicht propagieren Lentiviren tragen Ihre gen von Interesse. In dieser Studie, Lentivirus SBI511 mit dem Ausdruck schalenlose grün fluoreszierendes Protein (CopGFP; abgekürzt GLP) aus eine Dehnung Faktor-1a-Promoter für Transduktion verwendet wurde. Standard-Protokolle2 wurden verwendet, um zu produzieren und Titer Lentiviren bei Titer höher als 1e8 3D-Steuerung Einheiten pro mL (TU/mL).
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig und sämtliches Material, das in Kontakt mit Lentiviren wurden zu bleichen. Finden Sie in Ihrem Institut Richtlinien für sichere Anwendung und Handhabung von Lentiviren.
  2. Setup Brutpaare der gewünschten Maus Belastung am Tag vor der Ernte Embryonen. In diesem Experiment wurde C57BL/6J Stamm von Mäusen verwendet. Weibliche Mäuse für Eierstöcke und Eileiter Sammlung verwendet wurden nicht mit Hormonen für Superovulation behandelt.
  3. 2 bis 24 h vor der Ernte Maus befruchtete Eier, mehrere Kalium Simplex optimiert Medium24 (KSOM) Drop Platten wie folgt vorbereiten: einen Tropfen 50 μL KSOM Medium in die Mitte eines 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale und Deckel mit 2 mL Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) und bei 37 oC, 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 equilibrate.
    Hinweis: Sterile Einweggeschirr und verwerfen nach Exposition gegenüber Lentiviren.
  4. 1 X Lösung von Hyaluronidase in M2 Medium aus Stammlösung vorbereiten (100 X, 30 mg/mL, Lagerung bei-20 ° C). 100 x Stammlösung wurde im Wasser vorbereitet.
  5. 24 h post lasergestützte Transduktion von Maus befruchtete Eier, Brutpaare zwischen vasektomierten männlichen und weiblichen Mäusen pseudopregnant weibliche Mäusen Vorbereitung eingerichtet.

2. Isolierung der Maus befruchtete Eier

  1. 16 – 24 h Post Paarung, wählen Sie weibliche Mäuse mit vaginalen Stecker bezeichnend für erfolgreiche Paarung und Human einzuschläfern25. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden durch zervikale Dislokation unter tiefen CO2 oder Isofluran Inhalation eingeschläfert.
  2. Eierstöcke und Eileiter nach Standardprotokollen25zu isolieren.
  3. Übertragen Sie die Eierstöcke und Eileiter auf eine 35 mm-Schale mit M2-Medien.
  4. Reißen Sie für jeder Eierstock Ampulla auseinander um befruchtete Eier von Kumuluszellen umgeben zu lösen.
  5. Befruchtete Eier zu übertragen und Kumuluszellen bis 35 mm Schale mit 1 X Hyaluronidase in M2 Medium und bei 3 – 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Pipettieren befruchtete Eier nach oben und unten, die Kumuluszellen freizugeben.
  7. Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit M2 Medien und Pipettieren rauf und runter, Hyaluronidase abwaschen.
  8. Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit KSOM und Pipettieren rauf und runter, die restlichen M2 Medien und Hyaluronidase abwaschen.
  9. Übertragen Sie befruchtete Eier von Schritt 1.3 auf die vorbereiteten KSOM Drop Platten.
    Hinweis: Maus, die befruchteten Eier in KSOM müssen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 bis equilibrate gehalten werden. Entfernen von Platten aus dem Inkubator für länger als 15 min führt zu Schäden an Embryonen.
  10. Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in den Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.

(3) Perforation der Maus befruchtete Eier mit XYClone Laser

  1. Setup und Kalibrierung XYClone Laser nach Empfehlung des Herstellers. Andere Laser, normalerweise verwendet für in-vitro- Befruchtung, können für XYClone Laser zu perforieren befruchtete Eier ersetzt werden.
    1. Befestigen Sie den Laser Controller Box Draht Lasergerät am Mikroskop.
    2. Legen Sie die Laser-Controller-Box auf den Computer mit der Lasersoftware über einen USB-Anschluss. 3.1.3 der Laser-Controller anschließen und einschalten.
    3. Blick durch das Okular, Perforieren Sie eine Probe (z.B. trocken abwischbaren Markierungen auf einem Objektträger).
    4. Verwenden eines kleinen Schraubendrehers (enthalten in der Laser-Kit) Anpassung der X und Y-Position des Lasers entsprechen die LED Licht sichtbar durch das Mikroskop Okular und kalibrieren den Laser.
  2. Legen Sie eine KSOM Drop-Platte mit Maus befruchteten Eier auf den Mikroskoptisch. Halten Sie nicht die Platte außerhalb der Inkubator für länger als 15 Minuten.
  3. Blick durch das Mikroskop Okular und sicherstellen, dass der Embryo Zona Pellucida im Mittelpunkt steht und der Laser LED-Licht sichtbar ist.
  4. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, Zona mit dem LED-Licht/Laser Ziel.
  5. Legen Sie mithilfe der Computersoftware XYClone Laser auf 250 μs.
  6. Passen Sie die LED Licht Größe zum gewünschten Abmessungen (Einstellung 5 in diesem Experiment).
  7. Perforieren der Zona jeder befruchteten Eizelle dreimal mit dem Laser. Die Zona werden durchbohrt oder verdünnt. Mithilfe der oben genannten Einstellungen erzeugt der Laser ein Loch mit einem Durchmesser von 10 μm (Abbildung 2).
    Hinweis: Mit dem Ziel, in der Nähe der Polkörper Laser hält, Weg von der embryonalen Zelle.
  8. Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in der Gewebekultur Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.

(4) Transduktion Maus befruchtete Eier nach XYClone Laserperforation

  1. Pipettieren 2 μL der konzentrierten Lentivirus (größer als 1e8 TU/mL Titer) in den 50 μL KSOM Tropfen. Tun Sie nicht Pipettieren rauf und runter. Befruchtete Eier legen leicht bis zur Spitze pipettieren. Basierend auf unserer Erfahrung, 1e5 5e5 3D-Steuerung Einheiten des Lentivirus in einem Volumen von weniger als 3 μL ist optimal für gen-Lieferung.
  2. Lassen Sie befruchtete Eier für 4 Tage im Inkubator zu Blastozysten entwickeln. Keine Notwendigkeit, die Medien zu ändern.

5. nicht-chirurgische Übertragung von ausgestrahlt Mausembryonen Pseudo-schwangeren Mäusen

  1. Verwenden Sie pseudopregnant Mäuse, 3,5 Tage nach der Paarung im Schritt 1.5 vorbereitet.
  2. Verwenden Sie Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Gerät, in pseudopregnant Mäuse Maus-Embryonen einzupflanzen.
    1. Mit einem chirurgischen oder Mikroskop, sezieren einfügen ein vaginal Spekulum, den Gebärmutterhals zu visualisieren.
    2. Das nicht-chirurgische Embryo Transfer (NSET) Gerät ca. 5 mm in die Zervix und Kaution Embryonen in einem Volumen von ca. 2 μL einsetzen.
      Hinweis: Ist eine sterile NSET Gerät für jede Übertragung verwendet und nach dem Eingriff verworfen. Alle Reagenzien in der Manipulation der Embryonen müssen steril sein.
  3. Übertragen Sie 10 – 15 gesunde Blastozyste 2 μL Volumen der KSOM auf jeder pseudopregnant Mäuse.
  4. Weiter zur Überwachung und Messung der Gewichtszunahme bei pseudopregnant Mäusen an folgenden Tagen um festzustellen, ob die NSET erfolgreich war.
  5. Indem die schwangere Mäuse gebären natürlich oder Durchführung einen Kaiserschnitt 17 Tage nach dem Embryotransfer26Welpen zu erholen. Ein Kaiserschnitt ist oft notwendig, wenn sehr wenige Embryonen vorhanden sind und sie zu groß für die natürliche Geburt wachsen.
  6. Sammeln Sie Gewebe von Welpen für die Genotypisierung zur Bestimmung des Transgenese27.

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Representative Results

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Entwicklung von isoliert/ausgestrahlt Maus befruchteten Eiern kann unter dem Mikroskop täglich (Abbildung 1) überprüft werden. Gesunde Embryonen entwickeln sich zu Blastozysten innerhalb von 3 – 4 Tagen. In diesem Protokoll entwickeln 60 – 70 % der unbehandelten Embryonen sich zu Blastozysten23. Aus 114 Laser perforiert ausgestrahlt Embryonen, 54 entwickelte sich zu Blastozysten (Höhe von 47 %) und 46 Blastozysten ausgedrückt GFP (46/54 = 85 %)23.

Die Maus-Embryonen wurden am Tag der Ernte Laser perforiert. Die optimale Einstellung für die Laser-Behandlung war 3 Löcher pro befruchtetes Ei und 250 Ms. der Laser sollte zur dünnen Zona anstatt ein Loch (Abbildung 2). Dies ermöglicht die entwickelnden Embryonen eine intakte Verkapselung Zona Pellucida profitieren, während immer freizügig, Lentivirale Transduktion. In diesen Experimenten wurden Mausembryonen ausgestrahlt mit einem rekombinanten Lentivirus, die schalenlose GFP (abgekürzt GLP) zum Ausdruck von einer Dehnung Faktor-1a-Promoter. Für die Transduktion wurde in der Nährmedien 2 uL Lentivirus eingeführt. Erhöhung der Menge des Virus, beeinflusst direkt die Anzahl der ausgestrahlt Embryonen, die GFP ausgedrückt während der Embryonalentwicklung in Blastozyste23zu beeinträchtigen. Virale Volumen größer als 10 % der KSOM Tropfen würde auch Blastozyste Bildung (z. B. größer als 5 μL des Virus in einem 50 μL KSOM Tropfen) beeinträchtigen.

Um die Tragfähigkeit zu validieren, wurden ausgestrahlt Mausembryonen nicht chirurgisch pseudopregnant Mäuse übertragen. Sechs verschiedene NSET Ereignisse übertragen von insgesamt 58 Blastozyste, führte zu 9 GFP transgenen Welpen von insgesamt 12, 75 % Rate der Transgenese 23nachgeben. Die NSET Protokoll wird berichtet, dass die Ausbeute von 30-35 % Lebendgeburten28 im Vergleich zu 21 % Ausbeute, die in unseren Experimenten beobachtet wurden (12/58). Die Lentivirale Behandlung möglicherweise spielte eine Rolle in der Entwicklung des Embryos haben und dazu beigetragen, die niedrige Embryo Übertragungsrate. Welpen mit mehreren Lentivirale Integrationen und hohe Expression der GLP waren optisch grün unter einer blauen LED-Lampe (465-470 nm) (Abbildung 3). Die Anzahl der eingearbeiteten GFP Kopien reichten von 0-6 kopiert und war entschlossen, indem die qualitative PCR auf isolierte chromosomale DNA von Welpen Gewebe23.

Figure 1
Abbildung 1: Entwicklung der ausgestrahlt Maus befruchtete Eier in der Kultur. Die C57BL/6J Maus befruchtete Eier wurden am Tag 0 (geernteten befruchtete Eizelle), Tag1 (zwei Zellen), Tag2 (8-16 Zellen), Tag3 (Morula) und Tag 4 (Blastozyste) überwacht. Embryonen wurden mit einer Lentivirus tragen ein GLP-gen ausgestrahlt. Präsenz der Fluoreszenz in ausgestrahlt Embryonen zeigte sich tagsüber 2-3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Laser-Behandlung von Maus befruchtete Eier. Beispiele für Perforieren Zona um ein Loch gegen Ausdünnung von der Zona zu produzieren.

Figure 3
Abbildung 3: transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck GFP. Dunkel-Reader (DR Spot Lampe, DRSL-9) wurde zur GFP-positiven Welpen in einer dunklen Umgebung zu visualisieren. Nicht-transgenen Kontroll-Welpen wurden in der Gruppe für den Kontrast aufgenommen. Daraus resultierenden Welpen (rote Pfeile) wurden genotypisiert und von 0-6 enthaltenen Kopien der Lentivirale gen/GLP.

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Discussion

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Die Fähigkeit der Lentiviren, in deren Wirtsgenom integrieren macht sie einen idealen Vektor für stabile gen Lieferung. Lentivirale Vektoren können bis zu 8,5 Kilobase paar (Kbp) des genetischen Materials führen, die zellspezifische oder induzierbaren Promotern, Selektionsmarker oder fluoreszierende Moieties aufnehmen können. Eingearbeitete genomische Material kann als Bestandteil ihrer Wirtsgenom replizieren und zu äußern oder zu gewünschten Zeitpunkten deaktivieren geregelt werden. Diese Vektoren ermöglichen räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression in verschiedenen Stadien der Entwicklung und der Marke Lentiviren als leistungsfähige Werkzeuge für die gen-Lieferung.

Lasergestützte Lentivirale Transgenese ist eine effektive und einfach zu bedienende Methode für gen Ausdruck in Vivo. Diese Methode kann für in Vivo Eiweißerzeugung Ausdruck der genetisch codierten Indikatoren oder funktionelle Studien verwendet werden. Im Vergleich zu anderen Methoden, lasergestützte Lentivirale gen Lieferung ist genauso wirksam wie man Mikroinjektion aber erfordert keine technischen Fähigkeiten oder kostspielige Mikroinjektion Arbeitsstationen. Die XYClone Laser ist klein, tragbar, und können leicht mehrere Labors geteilt werden.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung ist stabil und nicht vergänglich, wie Elektroporation oder Photoporation der befruchteten Eier. Transiente gen Lieferung denn mehr Vorteile für die Lieferung von CRISPR-Cas9 Komponenten oder Rekombinasen erweiterten Begriff aberranten Konsequenzen führen könnte. In diesem Protokoll können die Integrase mangelhaft Lentiviren (IDLVs) für transiente Transduktion Maus befruchtete Eier ersetzt werden. IDLVs behalten Lentivirale Infektiosität aber nur einen Bruchteil (weniger als 8 %) der integrativen Funktion von Lentiviren29behalten. Lasergestützte Lentivirale Transgenese ist ein zusätzliches Gen Lieferoption für die Nutzer zu bewerten, basierend auf ihre gewünschte Ergebnis.

Der größte Nachteil der Lentivirale Transduktion ist das zufällige Einfügen des gelieferten Gens. Auch könnten Zellen innerhalb der gleichen Embryo host mehrere Lentivirale Integrationen, die evtl. in der transgenen führt. Genotypisierung der Nachkommen und mehrfache Umläufe der geplanten Zucht ist notwendig, einen einzigen Locus transgenen Tieres zu etablieren. Ähnliche Zuchtstrategien werden auch im konventionellen Transgenese Methoden30eingesetzt.

Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Länge der Zeitaufwand für die Laserperforation. Maus, die befruchteten Eier in KSOM kultiviert können nicht außerhalb der Inkubator für länger als 15 Minuten gehalten werden. Ein unerfahrener Benutzer sollte die befruchteten Eier M2 Medium verschieben, verwenden Sie erweiterte KSOM Embryo Medium oder die Anzahl der Embryonen pro Platte. 47 % der ausgestrahlt kultivierten Maus befruchtete Eier entwickeln je nach unser Ergebnis in Blastozysten23. Daher wird die Kultivierung von 30-40 befruchteten Eier pro Platte genügend ausgestrahlt Blastozysten in eine Platte für die Übertragung in pseudopregnant Mäuse sichergestellt.

Lasergestützte Perforation der Maus befruchtet Ei Zona kann auch für die Zona anderer Arten gelten und für andere Arten von Viren oder Transfektion Reagenzien zuzulassen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch die Intramural Research Program des National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt. Wir sind dankbar, Dr. Robert Petrovich und Dr. Jason Williams für kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Ratschläge. Wir möchten auch anerkennen und Dr. Bernd Gloss, der Ko-Kern, Flow Cytometry Anlage, die Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Center und die vergleichende Medizin Zweig Einrichtungen des NIEHS für ihre technische Beiträge danken. Wir möchten danken Mr David Goulding aus dem vergleichenden Medizin Zweig und Frau Lois Wyrick des Imaging Center bei NIEHS für die uns mit Fotos und Illustrationen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

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References

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Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier
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Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

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