המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים
Summary
עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.
Abstract
Lentiviruses הם וקטורים יעיל למסירה גן בתרבית של תאים. בעקבות התמרה חושית, הגנום lentiviral stably הוא שולב כרומוזום המארח, מועברת אל רומא. לפיכך, הם וקטורים אידיאלי עבור יצירה של שורות תאים יציב, ויוו משלוח של אינדיקטורים, התמרה חושית של תא בודד מופרית ביצים כדי ליצור חיות מהונדס. עם זאת, העכבר מופרית ביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן lentiviral. Lentiviruses גדולים מדי כדי לחדור את סונה, מועברים בדרך כלל על ידי microinjection של נגיפים לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים. הדרישה לבעיותיהם מיומנים וציוד מיוחדים יש למזער את השימוש lentiviruses למסירה גן העוברים העכבר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור permeabilizing את הביצים העכבר מופרית על ידי לנקב את zona עם לייזר. לייזר-ניקוב לא לגרום כל נזק עוברי ומאפשר lentiviruses לקבל גישה לתאים עובריים למסירה גן. Transduced עוברי ניתן להתפתח הבלסטוציסט במבחנה, אם שהושתלו בעכברים pseudopregnant, להתפתח הטרנסגניים הגורים. הלייזר בשימוש פרוטוקול זה הוא יעיל, קל לשימוש. הגנים מועברים על ידי lentiviruses stably לשלב תאים עובריים בעכבר, germline שעוברת ביחסי. זה שיטה חלופית עבור יצירה של העכברים הטרנסגניים הדורשת אין המיקרומניפולציה ו- microinjection של הביצים.
Introduction
בשיטה זו מספק הוראות מפורטות עבור permeabilizing את pellucida zona של העכבר מופרית ביצים כדי להפוך תאים עובריים לנגיש עבור המסירה הגן על-ידי lentiviruses. Lentiviruses תוכננו על ידי הטבע למסירה גן יעיל בתרבית של תאים. הם להדביק תאים החלוקה הלא-חלוקת ולשלב את הגנום lentiviral שלהם מארח כרומוזומים1. טווח התאים מארח lentiviral ברצון מורחבת מאת pseudotyping את lentivirus רקומביננטי עם גליקופרוטאין וירוס vesicular stomatitis (VSV-G), בשל tropism רחב של חלבון VSV-G2. בעקבות התמרה חושית, גנים lentiviral stably משולב, הביע כחלק בכרומוזומים המארח שלהם יצירת כלי אידיאלי ליצירת חיות מהונדס. אם תימסר לתאים עובריים בשלב מוקדם, הגנום lentiviral משוכפלת, שבאה לידי ביטוי בכל המנגנון. התמרה חושית lentiviral הוביל הייצור של עכברים, עכברושים, עוף, שליו, חזיר3,4,5,6,,7 , בין מינים אחרים של transgenics. השיטה טיפוסי של המסירה הגן lentiviral, עם זאת, דורשת טכנאים מיומנים וציוד מיוחדים כדי להתגבר על המכשול zona pellucida המכיל את העוברים בשלב מוקדם. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לתאר כיצד permeabilize את zona באמצעות לייזר כדי להקל על המסירה הגן lentiviral.
ביצים יונקים מוקפים את pellucida zona אשר מתקשה בעקבות הפריה להגן על הביצים מפני polyspermy וכדי להגביל את האינטראקציות סביבתיים8,9. Zona יוצרת מחסום שמונע lentiviruses מן התאים מתחלקים עד העוברים בוקעים כמו הבלסטוציסט. העכבר בתרבית מופרית ביצים הפתח לאחר 4 ימים, חייב להיות מושתלים לתוך עכברים pseudopregnant לפני הבקיעה להתפתחות הרגילה לתוך הגורים. לכן, עבור התמרה חושית, lentiviruses הן microinjected לפני הבקיעה מן zona לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים.
Pellucida zona יוסר לעיתים קרובות עבור הפריה במבחנה של ביצים אנושי כדי להגביר את קצב הפריה10. אולם, הסרת כימי של העכבר zona pellucida לרעה משפיעה על התפתחות העובר העכבר, מזיקה תאים עובריים11,12. שיטות נוספות המסירה הגן ביצים העכבר מופרית להתגבר על המכשול zona pellucida על ידי microinjection ישירה של ה-DNA לתוך גרעין התא13. Pronuclear microinjection הוא אמצעי יעיל של אספקת גנים העוברים. עם זאת, מאז כל העובר מתקיים במקום בנפרד עבור microinjection, התרגול ניתן מפרך וצורכת זמן למשתמש המתחיל.
שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה photoporation שימושיים ארעי, המסירה הגן לטווח קצר העכבר מופרית ביצים14,15,16. שיטות אלה משמשים בהרחבה להעברת רכיבים CRISPR-Cas9 ו- recombinases. עם זאת, משלוח אלקטרופורציה ו- photoporation של גנים לא ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור transgenics. Spermatozoa הנאספות מן העכבר מנוקבת יותרת האשך יכול גם להיות transduced על ידי lentiviruses, שימוש עבור הפריה במבחנה להפקת חיות הטרנסגניים17,18,19, 20.
ב פרוטוקול זה, המסירה הגן lentiviral העכבר עוברי בהנחייתם permeabilizing את zona באמצעות לייזר. הלייזר XYClone פותחה ככלי סיוע עבור במבחנה הדישון21 וטיפוח של תאי גזע עובריים22. זה מנגנון קטן פשוט להתקנת וניתן קל לשימוש. פעם להתקין מיקרוסקופ, הנתפש המרחב של עדשת המטרה בתוכנה הנלווית מאפשר מכוון הלייזר תוך התבוננות דרך של עיניות מיקרוסקופ (ראה פרוטוקול: סעיף 3). ברגע סונה הוא מחורר על ידי לייזר XYClone, lentiviruses יכול להיות מוחדרים התקשורת תרבות עבור ג’ין משלוח23. ניתן להשתמש lentiviruses מרובים בו זמנית לספק מספר גנים של התאגדות כרומוזומלית.
פרוטוקול זה יתאר כיצד לבודד, תרבות העכבר מופרית ביצים, מדגים את השימוש בלייזר עבור ניקוב של pellucida zona, ממחישה את התמרה חושית של תאים עובריים בעכבר על-ידי lentiviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת של lentiviruses שילוב לתוך הגנום המארח שלהם גורם להם וקטור אידיאלי עבור המסירה הגן יציב. וקטורים lentiviral יכול לשאת kilobase עד 8.5 זוג (kbp) של חומר גנטי שיכול להכיל תאים ספציפיים או inducible היזמים, סמני הבחירה או moieties פלורסנט. החומר הגנומי incorporated יכולים לשכפל כחלק הגנום המארח שלהם, להיות מוסדרות כדי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS). . אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט פטרוביץ, ד ר ג’ייסון ויליאמס על קריאה ביקורתית של כתב היד, עצות מועילות. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ד ר ברנד מבריק, הליבה נוקאאוט, המתקן Cytometry זרימה, מיקרוסקופיה של זריחה, מרכז הדמיה ובמתקני ענף רפואה השוואתית NIEHS על תרומתם טכני. ברצוננו להודות מר דוד גולדינג מהענף רפואה השוואתית, גב’ לויס Wyrick של מרכז הדמיה ב NIEHS סיפק לנו תצלומים ואיורים.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
