Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

Abstract

Lentiviruses הם וקטורים יעיל למסירה גן בתרבית של תאים. בעקבות התמרה חושית, הגנום lentiviral stably הוא שולב כרומוזום המארח, מועברת אל רומא. לפיכך, הם וקטורים אידיאלי עבור יצירה של שורות תאים יציב, ויוו משלוח של אינדיקטורים, התמרה חושית של תא בודד מופרית ביצים כדי ליצור חיות מהונדס. עם זאת, העכבר מופרית ביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן lentiviral. Lentiviruses גדולים מדי כדי לחדור את סונה, מועברים בדרך כלל על ידי microinjection של נגיפים לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים. הדרישה לבעיותיהם מיומנים וציוד מיוחדים יש למזער את השימוש lentiviruses למסירה גן העוברים העכבר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור permeabilizing את הביצים העכבר מופרית על ידי לנקב את zona עם לייזר. לייזר-ניקוב לא לגרום כל נזק עוברי ומאפשר lentiviruses לקבל גישה לתאים עובריים למסירה גן. Transduced עוברי ניתן להתפתח הבלסטוציסט במבחנה, אם שהושתלו בעכברים pseudopregnant, להתפתח הטרנסגניים הגורים. הלייזר בשימוש פרוטוקול זה הוא יעיל, קל לשימוש. הגנים מועברים על ידי lentiviruses stably לשלב תאים עובריים בעכבר, germline שעוברת ביחסי. זה שיטה חלופית עבור יצירה של העכברים הטרנסגניים הדורשת אין המיקרומניפולציה ו- microinjection של הביצים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשיטה זו מספק הוראות מפורטות עבור permeabilizing את pellucida zona של העכבר מופרית ביצים כדי להפוך תאים עובריים לנגיש עבור המסירה הגן על-ידי lentiviruses. Lentiviruses תוכננו על ידי הטבע למסירה גן יעיל בתרבית של תאים. הם להדביק תאים החלוקה הלא-חלוקת ולשלב את הגנום lentiviral שלהם מארח כרומוזומים1. טווח התאים מארח lentiviral ברצון מורחבת מאת pseudotyping את lentivirus רקומביננטי עם גליקופרוטאין וירוס vesicular stomatitis (VSV-G), בשל tropism רחב של חלבון VSV-G2. בעקבות התמרה חושית, גנים lentiviral stably משולב, הביע כחלק בכרומוזומים המארח שלהם יצירת כלי אידיאלי ליצירת חיות מהונדס. אם תימסר לתאים עובריים בשלב מוקדם, הגנום lentiviral משוכפלת, שבאה לידי ביטוי בכל המנגנון. התמרה חושית lentiviral הוביל הייצור של עכברים, עכברושים, עוף, שליו, חזיר3,4,5,6,,7 , בין מינים אחרים של transgenics. השיטה טיפוסי של המסירה הגן lentiviral, עם זאת, דורשת טכנאים מיומנים וציוד מיוחדים כדי להתגבר על המכשול zona pellucida המכיל את העוברים בשלב מוקדם. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לתאר כיצד permeabilize את zona באמצעות לייזר כדי להקל על המסירה הגן lentiviral.

ביצים יונקים מוקפים את pellucida zona אשר מתקשה בעקבות הפריה להגן על הביצים מפני polyspermy וכדי להגביל את האינטראקציות סביבתיים8,9. Zona יוצרת מחסום שמונע lentiviruses מן התאים מתחלקים עד העוברים בוקעים כמו הבלסטוציסט. העכבר בתרבית מופרית ביצים הפתח לאחר 4 ימים, חייב להיות מושתלים לתוך עכברים pseudopregnant לפני הבקיעה להתפתחות הרגילה לתוך הגורים. לכן, עבור התמרה חושית, lentiviruses הן microinjected לפני הבקיעה מן zona לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים.

Pellucida zona יוסר לעיתים קרובות עבור הפריה במבחנה של ביצים אנושי כדי להגביר את קצב הפריה10. אולם, הסרת כימי של העכבר zona pellucida לרעה משפיעה על התפתחות העובר העכבר, מזיקה תאים עובריים11,12. שיטות נוספות המסירה הגן ביצים העכבר מופרית להתגבר על המכשול zona pellucida על ידי microinjection ישירה של ה-DNA לתוך גרעין התא13. Pronuclear microinjection הוא אמצעי יעיל של אספקת גנים העוברים. עם זאת, מאז כל העובר מתקיים במקום בנפרד עבור microinjection, התרגול ניתן מפרך וצורכת זמן למשתמש המתחיל.

שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה photoporation שימושיים ארעי, המסירה הגן לטווח קצר העכבר מופרית ביצים14,15,16. שיטות אלה משמשים בהרחבה להעברת רכיבים CRISPR-Cas9 ו- recombinases. עם זאת, משלוח אלקטרופורציה ו- photoporation של גנים לא ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור transgenics. Spermatozoa הנאספות מן העכבר מנוקבת יותרת האשך יכול גם להיות transduced על ידי lentiviruses, שימוש עבור הפריה במבחנה להפקת חיות הטרנסגניים17,18,19, 20.

ב פרוטוקול זה, המסירה הגן lentiviral העכבר עוברי בהנחייתם permeabilizing את zona באמצעות לייזר. הלייזר XYClone פותחה ככלי סיוע עבור במבחנה הדישון21 וטיפוח של תאי גזע עובריים22. זה מנגנון קטן פשוט להתקנת וניתן קל לשימוש. פעם להתקין מיקרוסקופ, הנתפש המרחב של עדשת המטרה בתוכנה הנלווית מאפשר מכוון הלייזר תוך התבוננות דרך של עיניות מיקרוסקופ (ראה פרוטוקול: סעיף 3). ברגע סונה הוא מחורר על ידי לייזר XYClone, lentiviruses יכול להיות מוחדרים התקשורת תרבות עבור ג'ין משלוח23. ניתן להשתמש lentiviruses מרובים בו זמנית לספק מספר גנים של התאגדות כרומוזומלית.

פרוטוקול זה יתאר כיצד לבודד, תרבות העכבר מופרית ביצים, מדגים את השימוש בלייזר עבור ניקוב של pellucida zona, ממחישה את התמרה חושית של תאים עובריים בעכבר על-ידי lentiviruses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים בבעלי חיים וטיפולים בשימוש פרוטוקול זה היו בהתאם להנחיות NIH/NIEHS טיפול בבעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה (ACUC) ב NIH/NIEHS, חיה פרוטוקול 2010-0004.

1. תכשירים

  1. להכין/רכישה של recombinant lentiviruses הפצת שאינו נושא את הגן עניין. במחקר זה, lentivirus SBI511 ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק שטרגליים (copGFP; מקוצר GFP) של התארכות פקטור 1a יזם שימש עבור התמרה חושית. פרוטוקולים סטנדרטיים2 שימשו כדי לייצר, כייל נוגדנים lentiviruses ב titers גבוה יותר 1e8 יחידות transducing mL (טו/mL).
    הערה: שימוש באזהרה, אקונומיקה כל חומר זה יצר קשר עם lentiviruses. עיין ההנחיות של המכון שלך שימוש בטוח וטיפול lentiviruses.
  2. ההתקנה זוגות של העכבר הרצוי זן יום לפני הקטיף עוברי. בניסוי זה, שימשה C57BL/6J זן של עכברים. לא טופלו עכברים הנשי משמש השחלות ואוסף oviduct עם כל ההורמונים עבור superovulation.
  3. 2 – 24 שעןת לפני הקטיף העכבר מופרית ביצים, להכין מספר בינוני ממוטב סימפלקס אשלגן24 (KSOM) ירידה צלחות כדלקמן: להוסיף טיפה 50 μL KSOM בינוני עד לאמצע 35 מ מ שטופלו תרביות רקמה צלחת ומכסים עם 2 מיליליטר Dimethylpolysiloxane (DMPS5X), במקום 37 oC, 5% CO2, 5% O2 ו 90% N2 כדי equilibrate.
    הערה: השתמש צלחות פלאסטיק חד פעמי סטרילי וזורקים בעקבות החשיפה lentiviruses.
  4. להכין x 1, תמיסת hyaluronidase M2 בינוני מהפתרון מניות (100 x, 30 מ"ג/מ"ל, לאחסן ב-20 ° C). 100 x פתרון מניות הוכן במים.
  5. h 24 שעות ביממה פוסט לייזר בסיוע התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים, להגדיר זוגות בין עיקור עכברים זכר ונקבה להכין עכברים הנשי pseudopregnant.

2. בידוד של העכבר מופרית ביצים

  1. 16-24 h פוסט ההזדווגות, בחרו עכברים נקבה עם מעידה על הזדווגות מוצלחת מהנרתיק פקקים, בצורה הומאנית המתת חסד25. העכברים השתמשו במחקר זה היו מורדמים מאת נקע בצוואר הרחם תחת עמוק CO2 או איזופלוריין באינהלציה.
  2. לבודד את השחלות, oviducts על פי פרוטוקולים סטנדרטיים25.
  3. העבר את השחלות ואת oviducts תבשיל 35 מ מ המכיל M2 מדיה.
  4. עבור כל השחלה, דמעה ampulla לגזרים לשחרר את הביצים מוקף תאים קומולוס.
  5. להעביר את הביצים, תלולית לתאים 35 מ מ מאכל המכיל hyaluronidase x 1 בינוני M2 דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
  6. Pipet מופרית ביצים למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים קומולוס.
  7. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכיל pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף hyaluronidase ומדיה M2.
  8. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכילות KSOM ואת pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף את המדיה M2 הנותרים ואת hyaluronidase.
  9. העברת הביצים הלוחות טיפה KSOM מוכן מהשלב 1.3.
    הערה: העכבר מופרית ביצים KSOM חייב להישמר בתוך חממה תרביות רקמה של 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 ו 90% N2 כדי equilibrate. הסרת לוחות החממה יותר מ 15 דקות לגרום לנזק עוברי.
  10. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה לפני המעבר לשלב הבא.

3. ניקוב של העכבר מופרית ביצים עם לייזר XYClone

  1. התקנה, לכייל XYClone לייזר על-פי ההמלצה של היצרן. . הרבה לייזרים אחרים, משמש בדרך כלל עבור הפריה במבחנה , XYClone לייזר ניקבה את הביצים.
    1. לצרף את החוט תיבת לייזר בקר המנגנון לייזר על המיקרוסקופ.
    2. לצרף את תיבת בקר לייזר למחשב שבו פועל התוכנה לייזר דרך יציאת USB. 3.1.3. הכנס את בקר לייזר, הפעילו את זה.
    3. מחפש דרך העיינית של המצלמה, לנקב מדגם הבדיקה (למשל מחיקה יבש סימונים על משטח זכוכית).
    4. להשתמש הנהג בורג קטן (כלול בערכה לייזר) כדי להתאים את ה-X ואת Y המיקום של הלייזר כדי להתאים את ה-LED אור נראה דרך העיינית של המצלמה מיקרוסקופ לכייל את הלייזר.
  2. מניחים צלחת טיפה KSOM המכילים ביצים העכבר מופרית על הבמה מיקרוסקופ. אל תשמור את הצלחת מחוץ החממה יותר מ 15 דקות.
  3. להסתכל דרך העינית מיקרוסקופ ולהבטיח כי zona pellucida של העובר נמצא המוקד והיא הלייזר נורית LED הוא גלוי.
  4. הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למקד את zona עם LED האור/הלייזר.
  5. שימוש בתוכנת מחשב מוגדר XYClone לייזר 250 μs.
  6. להתאים את גודל אור LED לממדים הרצויים (הגדרת 5 בניסוי זה).
  7. לנקב את zona של הביצית המופרית כל שלוש פעמים עם הלייזר. Zona יכול להיות או פירסינג או מדולל. באמצעות ההגדרות לעיל, הלייזר יהיה לייצר חור בקוטר של 10 μm (איור 2).
    הערה: כיוון הגופה קוטב שומר לייזר מן התא העוברי.
  8. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה תרביות רקמה לפני המעבר לשלב הבא.

4. התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים בעקבות ניקוב לייזר XYClone

  1. Pipet 2 μL של lentivirus מרוכז (גדול מ 1e8 TU/mL כייל נוגדנים) לתוך הירידה KSOM 50 μL. לא pipet למעלה ולמטה. הביצים בקלות לצרף הטיפ pipet. על סמך הניסיון שלנו, 1e5-5e5 יחידות transducing של lentivirus של אמצעי אחסון פחות מ 3 μL הוא אופטימלי המסירה הגן.
  2. לאפשר הביצים להתפתח הבלסטוציסט ארבעה ימים בחממה. אין צורך לשנות את התקשורת.

5. ניתוחי העברת העכבר Transduced עוברי עכברים מדומים בהריון

  1. השתמש עכברים pseudopregnant, 3.5 יום לאחר ההזדווגות, מוכן בשלב 1.5.
  2. להשתמש בהתקן להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כדי להשתיל עוברי העכבר לתוך עכברים pseudopregnant.
    1. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי או ויבתר, הכנס עם ספקולום וגינלי להמחיש את צוואר הרחם.
    2. הכנס את המכשיר להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כ 5 מ מ העוברים צוואר הרחם ואת הפיקדון באמצעי אחסון כ- 2 μL.
      הערה: התקן NSET סטרילי המשמש עבור כל העברה, יימחקו לאחר ההליך. כל ריאגנטים בשימוש המניפולציה של העוברים חייב להיות סטרילי.
  3. להעביר 10 – 15 בריא הבלסטוציסט μL 2, ףקיהב KSOM כל העכברים pseudopregnant.
  4. להמשיך לעקוב ולמדוד את העלייה במשקל בעכברים pseudopregnant בימים הבאים כדי לקבוע NSET הצליחה.
  5. לשחזר הגורים מאת ומאפשר העכברים בהריון ללדת באופן טבעי או ביצוע של ניתוח קיסרי 17 ימים אחרי העובר להעביר26. ניתוח קיסרי נחוץ לעיתים קרובות אם העוברים מעט מאוד נוכחים, הם גדלים גדול מדי עבור לידה טבעית.
  6. לאסוף רקמות הגורים עבור genotyping לקבוע שיעור transgenesis27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיתוח של ביצים מבודד/transduced העכבר מופרית ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ מדי יום (איור 1). העוברים בריאים להתפתח הבלסטוציסט תוך 3-4 ימים. ב פרוטוקול זה, 60-70% ללא טיפול עוברי להתפתח הבלסטוציסט23. מתוך 114 מחורר בלייזר transduced עוברי 54 התפתחה הבלסטוציסט (שיעור של 47%) 46 blastocysts והביע GFP (46/54 = 85%)23.

העוברים העכבר היו מחורר בלייזר ביום של קציר. ההגדרה המיטבית עבור הטיפול בלייזר 3 חורים לכל ביצה מופרית, גב' 250 הלייזר צריך להיות מכוון לדלל את zona במקום ליצור חור (איור 2). פעולה זו מאפשרת את העוברים פיתוח להפיק תועלת pellucida zona encapsulating שלם תוך כדי להיות מתירני כדי lentiviral התמרה חושית. בניסויים אלה, העכבר העוברים היו transduced עם lentivirus רקומביננטי לידי ביטוי שטרגליים GFP (GFP מקוצרת) של יזם 1a התארכות פקטור. עבור התמרה חושית, 2 uL של lentivirus הוכנס התקשורת תרבות. להגדיל את כמות וירוס, מושפעת ישירות את מספר העוברים transduced לידי ביטוי GFP תוך כדי להשפיע לרעה על התפתחות העובר לתוך הבלסטוציסט23. נגיפי הכרכים הגדולים מ- 10% KSOM טיפה נפח להשפיע לרעה גם היווצרות הבלסטוציסט (למשל גדול מ- 5 μL של וירוס בטיפה KSOM 50 μL).

כדי לאמת את הכדאיות, העכבר transduced עוברי הועברו שאינו בניתוח עכברים pseudopregnant. 6 NSET אירועים נפרדים, העברת סך של הבלסטוציסט 58, גרמו 9 גורים הטרנסגניים GFP מתוך סך של 12, מניב שיעור 75% transgenesis 23. פרוטוקול NSET מדווח להניב 30-35% לידות חי28 לעומת 21% תשואה, זה נצפתה בניסויים שלנו (12/58). הטיפול lentiviral אולי יש תפקיד בהתפתחות העובר, תרמו קצב ההעברה של העובר נמוכה. הגורים עם שילובי lentiviral מרובות, וביטוי גבוהה של GFP היו ירוקים באופן חזותי תחת מנורת LED כחול (465-470 ננומטר) (איור 3). מספר העותקים GFP incorporated נע בין 0-6 עותקים, נקבע על-ידי ביצוע PCR איכותי על ה-DNA כרומוזומלית מבודד מן הרקמה גור23.

Figure 1
איור 1: פיתוח של העכבר Transduced מופרית ביצים בתרבות. הביצים העכבר מופרית C57BL/6J נוטרו ביום 0 (ביצה מופרית שנקטפו), יום 1 (שני תאים), ביום 2 (8-16 תאים), ביום השלישי (morula) ו- 4 יום (הבלסטוציסט). העוברים היו transduced עם lentivirus נושא גן ה-GFP. נוכחות של קרינה פלואורסצנטית עוברי transduced התברר ביום 2-3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: טיפול לייזר של העכבר מופרית ביצים. דוגמאות ניקוב של zona לייצר חור vs לדלדול של סונה.

Figure 3
איור 3: העכברים הטרנסגניים לבטא GFP. הקורא כהה (ד ר במקום המנורה, DRSL-ג'י 9) שימש כדי להמחיש GFP הגורים חיובית בסביבה חשוכה. שליטה ללא-הטרנסגניים הגורים נוספו לקבוצה ' ניגוד '. הגורים וכתוצאה מכך (חצים אדומים) היו genotyped ומצומצם מגיל 0-6 עותקים של lentiviral הגן/GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת של lentiviruses שילוב לתוך הגנום המארח שלהם גורם להם וקטור אידיאלי עבור המסירה הגן יציב. וקטורים lentiviral יכול לשאת kilobase עד 8.5 זוג (kbp) של חומר גנטי שיכול להכיל תאים ספציפיים או inducible היזמים, סמני הבחירה או moieties פלורסנט. החומר הגנומי incorporated יכולים לשכפל כחלק הגנום המארח שלהם, להיות מוסדרות כדי להביע או לבטל בנקודות הזמן הרצויים. וקטורים אלה מאפשרים שליטה ייתכן על ביטוי גנים בשלבים שונים של פיתוח, lentiviruses מותג כמו כלים רבי-עוצמה המסירה הגן.

לייזר בסיוע transgenesis lentiviral היא שיטה יעילה, קלה לשימוש עבור ג'ין ביטוי ויוו. שיטה זו יכולה לשמש ויוו ייצור החלבון, ביטוי של אינדיקטורים מקודדים גנטית, או לימודים פונקציונלי. לעומת שיטות אחרות, המסירה לייזר בסיוע הגן lentiviral יעיל כמו pronuclear microinjection אבל לא דורש כישורים טכניים או תחנות עבודה microinjection יקר. הלייזר XYClone הוא קטן ונייד, ולא בקלות ניתן לשתף בין מספר מעבדות.

המסירה לייזר בסיוע הגן lentiviral הוא יציב, לא חולף, אלקטרופורציה או photoporation של הביצים. המסירה הגן ארעית היא יתרונות רבים יותר עבור משלוח של הרכיבים CRISPR-Cas9 או recombinases שכן הביטוי המורחבת יכול להוביל לתוצאות חריגה. ב פרוטוקול זה, lentiviruses לקוי integrase (IDLVs) הרבה מכדי התמרה חושית ארעית של העכבר מופרית ביצים. IDLVs לשמור על lentiviral infectivity אבל רק חלק קטן (פחות מ-8%) של יכולת אינטגרטיבית של lentiviruses29. לייזר בסיוע transgenesis lentiviral הוא אפשרות משלוח גנים נוספים עבור משתמשים כדי להעריך בהתבסס על התוצאה הרצויה שלהם.

החיסרון העיקרי של התמרה חושית lentiviral היא החדרת הגן ונמסרו אקראי. בנוסף, תאים בתוך העובר אותו יוכל לארח מספר שילובי lentiviral שמוביל פסיפס ב הטרנסגניים. Genotyping צאצאים מרובים סיבובים של רבייה המתוכנן יש צורך להקים חיה הטרנסגניים לוקוס בודד. אסטרטגיות רבייה דומים מועסקות גם שיטות קונבנציונליות transgenesis30.

שלב קריטי ב פרוטוקול זה הוא משך הזמן שהושקע מחורר בלייזר. ביצים העכבר מופרית תרבותי ב KSOM לא יכולה להישמר מחוץ החממה יותר מ 15 דקות. למשתמש מתחיל צריך לעבור הביצים M2 בינוני, שימוש מתקדם KSOM העובר בינוני או להגביל את מספר העוברים לכל צלחת. על פי התוצאות שלנו, 47% מכלל הביצים transduced העכבר בתרבית מופרית להתפתח blastocysts23. לכן, culturing 30-40 הביצים לכל צלחת יבטיח מספר blastocysts transduced בצלחת אחת עבור העברת לתוך עכברים pseudopregnant.

לייזר בסיוע לחירור של zona ביצה העכבר מופרית עשוי גם להיות רלוונטי zona של מינים אחרים ולאפשר כניסה עבור סוגים אחרים של וירוסים או תרביות תאים ריאגנטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS). . אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט פטרוביץ, ד ר ג'ייסון ויליאמס על קריאה ביקורתית של כתב היד, עצות מועילות. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ד ר ברנד מבריק, הליבה נוקאאוט, המתקן Cytometry זרימה, מיקרוסקופיה של זריחה, מרכז הדמיה ובמתקני ענף רפואה השוואתית NIEHS על תרומתם טכני. ברצוננו להודות מר דוד גולדינג מהענף רפואה השוואתית, גב' לויס Wyrick של מרכז הדמיה ב NIEHS סיפק לנו תצלומים ואיורים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443, (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15, (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7, (4), e35335 (2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7, (12), e50817 (2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13, (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2, (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74, (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77, (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6, (11), e27677 (2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99, (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79, (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28, (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9, (3), e91892 (2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27, (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006, (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23, (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14, (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82, (14), 7111-7119 (2008).
המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter