Summary
本协议提出了一种体内粘 capsulitis 的大鼠模型。该模型包括盂关节的内固定与关节缝合固定延长时间, 导致减少运动范围 (ROM) 和增加关节僵硬度。
Abstract
这项建议的目的是建立一个在体内的大鼠模型的粘合剂 capsulitis 研究潜在的治疗选择的这种情况和其他病因的可比 arthrofibrosis。该模型包括通过肩胛骨到肱骨缝合的大鼠肩关节外固定, 导致继发挛缩而不侵犯关节内空间, 导致旋转 ROM 减少, 关节增加刚度。
为了这项研究, 我们用了10大大鼠。基线 ROM 测量是在盂固定之前采取的。在切除固定缝线前, 对大鼠进行8周的固定, 评估 ROM 和关节僵硬度的变化。为评估固定化是否导致 ROM 显著减少, 计算了运动学的变化。在随访期间的每个时间点测量 ROM, 并与基线内部和外部 rom 测量进行比较。为了评估刚度, 通过确定80°初始外旋转所需的扭矩 (text和 tint ) 的差异来计算关节动力学。
在随访0天后, 除关节缝合固定术后, 我们发现总 ROM 比基线减少63%。我们观察到持续改进, 直到5周的后续行动, 随着进展放慢约19% 的限制。在8周的随访中, 仍然有18% 的限制 ROM. 此外, 在后续的一天 0, 我们发现扭矩增加了 13.3 Nmm 相比基线。在8周, 总扭矩被测量为 1.4, 0.2 Nmm 高于初始测量。本工作介绍了一种大鼠肩粘连 capsulitis 的模型, 其持久的降低 ROM 和增加的刚度。
Introduction
肩关节粘连 capsulitis 常被称为冻肩或肩挛缩。它的特点是受限盂运动和疼痛, 大概是由于晚期纤维化和关节挛缩1,2,3。在联合胶囊2,3中, 上皮细胞细胞与形成致密胶原基质 (I. 型和 III.) 相结合的胞内纤维蛋白。有许多可能的危险因素, 形成关节挛缩, 包括性别, 糖尿病, 甲状腺机能亢进, 外伤性损伤, 并延长固定4,5,6。
有效的治疗选择是缺乏的, 主要包括物理治疗, 干预的形式的手术释放在极端情况下没有改善保守护理。最好的治疗方法仍然是待定的, 多年来一直是一个很大兴趣的主题在医学领域7,8。开发新的治疗方案将需要一个可重现的动物模型的情况下, 不依赖关节内诱发外伤。最佳胶粘剂 capsulitis 模型应涉及疾病的两个主要特点: 肩囊挛缩和延长运动范围 (ROM)。Schollmeier等。9描述了第一关节挛缩模型之一, 使用石膏来发展犬肩挛缩。他们还报告说, 在停止固定化9后, ROM 和关节内压力的变化恢复到正常水平。然而, 研究中提到的一个重要的限制是动物之间的肢体位置的变化, 因为使用的铸造技术。为了获得更可重现的模型, 野雅明等。10后提出了一种粘附 capsulitis 大鼠模型, 采用刚性内固定的肩膀。然而, 尽管他们的模型大大减少了 ROM, 但他们并没有说明这些变化是暂时的还是长期的。本研究的目的是通过观察延长关节盂关节固定对 ROM 和关节僵硬的影响, 建立适合于体内的肩挛缩大鼠模型。
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Protocol
这项研究获得了在贝丝以色列女执事医疗中心的机构动物护理和使用委员会的批准。注意避免不必要的长时间的麻醉, 也避免体温过低。动物被加权在每个 ROM 测量会议和监测体重下降。
1. 学习科目
- 使用10大大鼠13周大的手术时间和范围之间的 250–300 g 的体重。
2. 手术方法
- 在麻醉和手术前的固定, 测量基线扭矩的功能的旋转角度之间的回旋的外部旋转和80°的内部旋转 (见步骤 5)。
-
在感应腔内吸入5% 异氟醚, 然后在整个手术过程中通过鼻锥维持2% 异氟醚的麻醉。
- 在麻醉过程中, 使用动物下面的水基加热元件来维持体温。
- 为了控制疼痛, 根据大鼠的体重, 在1.2 毫克/千克的剂量下, 管理缓释丁丙诺啡。
-
固定左盂关节的一个角度的绑架 (肱骨轴和肩胛脊柱之间的角度)10 , 11.
- 开始手术的过程中, 后纵切口, 平行于肱骨轴。使皮肤切口刚好低于盂关节, 并延长约3厘米。
- 使用2缝线 (编织聚酯) 固定盂关节, 通过穿透肩胛骨的侧面边缘和周围的肱骨轴的远端, 并随后收紧如图 1A所示。采取额外的努力, 以避免紧缩的关键结构, 如肱动脉。
注: 手术技术有优势, 可以限制盂关节在的诱拐 (Z) 不影响其他计划 (X & Y)。通过在肱骨周围放置缝合线, 通过肩胛骨的侧面边界, 在肩胛骨叶片平面上实现并维持两种结构的近似。在收紧缝线后, 当考虑 X & Y 平面时, 当考虑 Z 平面时, 手臂固定在静止位置。这被认为是限制的变化之间的动物, 可能会产生的错误微调的联合立场, 在三计划。
3. 闭合切口
- 在适当的止血后, 使用皮肤夹子关闭皮肤切口。
- 停止麻醉, 让动物在温暖的环境下, 在监督下恢复。在动物恢复足够的知觉维护胸骨卧床之后, 退回它回到它的笼子。
- 术后立即, 允许动物恢复正常活动。允许动物不受限制地移动, 主要依靠内部缝合来固定盂关节。
- 为了监测可能感染, 检查切口部位每天在第一个术后周。
- 手术后10天取出伤口夹。
注意: 手术过程中没有肌肉的操纵, 而且该技术不涉及关节内外伤, 从而保持囊膜和关节的连续性和解剖完整性。我们的议定书没有遵循外部限制和活动限制。 - 提供镇痛使用缓释丁丙诺啡, 注射在剂量1.2 毫克/千克开始麻醉诱导, 并重复每72小时, 如果需要。
4. 固定术后8周缝线切除
- 在感应腔内吸入5% 异氟醚, 然后通过鼻锥在整个手术中持续使用2% 异氟醚。为了控制疼痛, 根据大鼠的体重, 在1.2 毫克/千克的剂量下, 管理缓释丁丙诺啡。
- 在上面的伤口上做一个切口。
- 切开缝线, 从肱骨和肩胛骨中取出。
- 用伤口夹缝合切口。
- 检查切口部位每天在第一周内发现任何感染的迹象。监视疼痛和痛苦。
- 手术后10天取出伤口夹。
5. 运动和关节刚度测量范围
-
使用由 arm 钳、传感器组件和转轴11组成的自定义设备, 测量在固定前后的 ROM 和被动肩部力学。这是执行手术前 (基线) 和连续缝合后。
- 在缝合后立即测量 ROM (随访0天), 随后每周两次。
- 在记录少于上一时间点的10% 更改时, 减少每周一次的测量。
注意: 在测试 rom 数周后, 每种动物的 rom 在测试时间点之间没有发生剧烈变化 (小于10% 的变化)。在这一点上, ROM 似乎高原, 因此, 我们认为, 减少测试频率从每周两次到一周一次是足够的。
- 在麻醉下使用异氟醚通过精确的蒸发器进行测量, 在5% 进行感应, 2% 用于维护整个程序的全长 (约5分钟), 以便有效地进行测量。在麻醉过程中, 使用动物下面的水基加热元件来维持体温。
- 在激光引导下, 适当地将动物定位于 ROM 测量。将前肢放置在90°向前屈曲的手臂钳上, 传感轴与肱骨长轴对齐。通过手腕和肘部来保护前肢, 如图 1B所示。
- 通过步进电机控制被动前肢旋转, 以一致的方式评估 ROM 和扭矩。用单片机控制步进电机。使用测斜仪的输入, 连同从扭矩传感器的投入来指示测量的开始和结束。
- 使用内部开发的 MATLAB 代码将微控制器连接到计算机并进行控制。
- 仅对于基线测量, 将传感器组件循环3次, 在外部旋转和内部旋转80°之间进行, 以获得初始扭矩测量 (外部: text和内部: tint), 以便以后进行比较。
- 对于 ROM 测量, 使用每个动物的扭矩值在自己的基线测量 (text和 tint) 作为预设输入变量的程序, 以检测变化的旋转 ROM. 使用基线测量作为比较停止为后续 ROM 测量点。使用0.2°分辨率检测到更改。
- 对于刚度测量, 使用80°外部旋转的原始旋转角和内部旋转作为预设输入在程序中, 以检测扭矩的变化。检测到的更改的分辨率为 0.01 Nmm。
- 权衡动物在同一天的每一个 ROM 评估。把动物放在鳞片上, 记录他们的群众。这些数据被用作评估研究期间动物健康状况的工具之一。
- 恢复后, 把老鼠送到笼子里, 监视疼痛或窘迫的迹象。在这个测试中, 没有动物被留在无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床。
注意: ROM 和扭矩测量是通过一个定制的设备实现的, 以前我们的小组 {维拉 2015} 报告。该设备是一个定制的夹具, 由一个由步进电机旋转的轴和由一个自定义的 MATLAB 脚本控制。在试样的铰接过程中, 采用扭矩传感器和惯性测量单元捕获扭矩和位置数据。
6. 验尸后的 Immunohistologic 分析
- 在8周 ROM 测量期结束时, 弄死大鼠与 CO2接触。
- 解剖左 (固定) 和右 (健康控制) 肩膀通过脱节肱骨从尺骨, 并通过切片肩胛骨从锁骨和胸腔。
- 固定在10% 中性缓冲福尔马林溶液中的切除肩3天, 然后在10% 的乙二胺乙酸 (EDTA) 溶液中脱钙, 再再2月。
- 在此过程中, 在一个温和的搅拌周期的振动器放置样品, 并存储在4摄氏度。通过每周 microcomputed 层析成像 (uCT) 扫描监测盂关节的脱钙。
注: EDTA 是一种螯合剂, 它将钙离子与磷灰石晶体外表面结合, 逐渐降低晶体尺寸12、13、14。这个过程是非常缓慢和温和的, 它被用来检测特定的组织元素, 必须保存的技术, 如免疫组化 (IHC)。EDTA decalcifies 试样的速率取决于溶液的 pH 值和浓度。在 pH 值方面, 它的范围从7到 7.4, 有更多的碱性溶液可以加速脱钙速度。然而, pH 值较高的溶液会损伤关键的组织元素。此外, 这种实验通常的 EDTA 浓度介于10% 到14% 之间, 但重要的是要记住, 当活性剂一旦与钙结合后就会耗尽, 因此这就需要更换脱钙液至少3到4倍。每星期15。 - 在脱钙过程结束后, 在石蜡堆中安装盂关节进行组织学切片。将样品定向到允许冠状切片。在50% 深度的肱骨头 (在中心, 中封闭) 获得切片如图 1所示。用过氧化物酶-抗过氧化物酶法进行免疫组化染色, 以表示关节内纤维组织的存在。4,9,10,16
- 用微波辐照进行抗原检索, 方法是在柠檬酸钠缓冲液 (10 毫米枸橼酸钠, 0.05% 吐温 20, pH 6.0, 预热为5分钟在95–100°c) 的塑料 Coplin 罐中的幻灯片, 并放置在一个普通的微波炉10分中等功率。允许幻灯片在室温下冷却30分钟。
- 用山羊血清阻断30分钟, 用一只小鼠单克隆抗体 (1:400 稀释) 对纤连蛋白进行4摄氏度的夜间培养。
- 用原抗体孵化后, 用 PBS (0.5 微克/毫升) 两次冲洗标本10分钟;用二级抗体孵育, 山羊 antimouse IgG-过氧化物酶共轭 (1:400 稀释) 30 分钟。
- 用 PBS (2.5 µg/毫升) 在振动筛上清洗两次样品10分钟, 在黑暗中暴露到 330-diaminobenzidine 四氢氯和30% 过氧化氢, Counterstain Carazzi 苏木精。
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Representative Results
运动范围
在随访日 0, 我们发现总 ROM 比基线减少 63% (P < 001)。我们观察到, ROM 的逐步改善, 直到5周的随访, 当进展停止在19% 限制 (P < 0.001)。其余的限制, 18% 的总 ROM, 仍然是明显的8周的后续行动 (P < 0.001)。
刚度
在随访日 0, 我们发现总扭矩比基线增加 13.3 Nmm (P < 0.001);8.9 Nmm 外部 (p = 002) 和 4.4 Nmm 内部 (p < 0.001), 导致在外部旋转扭矩的138.8% 增加, 159.6% 增加内部转动扭矩, 并且一共149.2% 增加扭矩整体。在8周的随访中, 我们发现总测量的扭矩是 1.4, 0.2 Nmm 高于基线 (p = 0.115), 与 0.6 # 0.1 Nmm 增加外部扭矩 (p = 0.369) 和 0.7 @ 0.2 Nmm 增加内部扭矩 (p = 0.036)。这表明扭矩增加10% 外部和25.7% 内部, 为整体17.9% 增量。在术后3周的开始, 刚度停滞不前的改善。
组织学结果
如图 2A所示, 完整组显示了囊与股骨头关节面和正常细胞组织之间的适当分离。此外, 在滑膜组织和关节软骨中也观察到正常的细胞组织。然而, 手术固定化组显示的证据, 囊粘连的盂关节的下一面。此外, 与完整的肩膀相比, 周围的组织似乎更密集, 导致一个更紧的胶囊与减少关节空间 (图 2B)。纤维粘连蛋白切片显示, 收缩手术组的囊膜厚度增加 (图 2B)。与健康的控件相比 (图 2A)。这些发现与以前报道的关于关节固定化10动物模型的文献一致, 并支持建立一个适当的挛缩模型。
图 1: 检测仪器.(A) 固定的盂关节与2编织聚酯缝合, 通过牢固地通过在肩胛骨和肱骨的侧缘之间;(B) 用于测量 ROM 和被动肩部力学的定制装置;a) 步进显示器。由 b) 反应扭矩传感器和 c) 定向传感器组成的传感器组件。d) 一个手臂钳。(C) 盂联合11的内部或 (D) 外部轮换。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 肱骨头冠状片.图像染色的纤维连接蛋白 (IHC) 获得40X 放大。刻度条 = 200 µm (A) 健康控制。(B) 手术控制。红色箭头勾勒出关节囊的厚度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 健康和手术限制的大鼠盂关节的运动范围与归一化扭矩.内部旋转表示为正, 外部旋转为负值。阴影区域显示95% 置信区间 (CI)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本研究通过盂关节内固定, 提出了一种大鼠肩粘 capsulitis 模型。此外, 它显示在摘除固定后至少8周内总 ROM 的延长减少。为了计算不同时间点 ROM 的变化情况, 将测量结果与动物特定基线进行了比较。反之, 野雅明等。10使用了标准化扭矩为所有动物为了确定前体 ROM 变动。
在 2008年, Sarver等。17报告了非手术外固定术后肩关节僵硬的情况。他们的研究显示关节僵硬度的短暂增加后, 固定的受伤和治疗肩, 这是解决了8周的随访。然而, 在目前的研究中, 我们没有发现扭矩和角度之间的线性关系, 而是一个多项式拟合 (图 3)。此外, 我们发现在内部旋转评估中, 关节刚度与基线相比有统计学意义上的差异, 在8周的固定化后, 25.7% 的刚度持续增加。
我们使用基线 ROM 和刚度测量每个动物作为自己的内部控制。考虑到动物之间可能的变异18, 使用同一种动物的对侧肩部作为内部控制增加内部有效性并且帮助减少需要的动物的数量。
我们研究的一个局限性是, 用来测量 ROM 的仪器不能稳定肩胛骨。然而, 一只老鼠的肩胛骨比人类更倾向于倾斜, 甚至更向上旋转。仰卧位大鼠应在理论上控制肩胛骨倾斜, 因为肩胛骨靠的是测试夹具的牢固板。研究的一个进一步局限是, 我们只评估盂关节的内部旋转和外部旋转。这部分是由于绑架, 屈曲和头顶活动需要彻底的外部固定或限制 scapulothoracic 关节在 ROM 测试, 这需要一个不同的系统比我们。
胶粘剂 capsulitis 的发病机制和治疗仍未得到充分了解。无论病因如何, 都表明它是胶囊的挛缩, 导致疼痛和限制盂运动1,3,11。此外, 有人建议, 有炎症诱因导致关节纤维化, 从而导致挛缩10。虽然我们的大鼠模型不能模拟最初的炎症性损伤的初步挛缩, 但它充分复制的特征动力学的粘合剂 capsulitis 和其病理变化10,19。该模型呼吁持久减少 ROM 和增加关节僵硬度, 允许全面评估目前和潜在的治疗治疗肩关节挛缩症。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
作者希望感谢汤姆先生和夫人和菲利斯 Froeschle 为这个项目提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA | 250-300 g | |
| Surgical tool: | |||
| Injection needle | BD 1' 30 guage | ||
| Needle holder | |||
| 5% isoflurane | |||
| 2% isoflurane | |||
| Nose cone | |||
| Skalpel and skalpel holder | No. 11 scalpel | ||
| Curved hemostat forceps | |||
| Staright hemostat forceps | |||
| Tissue retractor | |||
| Toothed tissue forceps | |||
| Plain tissue forceps | |||
| Dissecting scissors | |||
| Suture scissors | |||
| Skin clip applicator | Any standard staples for wound closure | ||
| Immobilization material | Ethicon | No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization | |
| Other materials: | |||
| Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp | Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper | ||
| Orientation sensor (part of sensor assembly) | MicroStrain Inc., Williston, VT, USA | 3DM-GX3-15 | |
| Reaction torque sensor (part of sensor assembly) | Futek Inc., Irvine, CA, USA | TFF400 | |
| Stepper Motor | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | https://www.sparkfun.com/products/13656 | |
| Microcontroller | Torino, Italy). | Arduino UNO, R3 | |
| MATLAB code | MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA | ||
| Weight Scale | Ohaus |
References
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