Summary
このプロトコルが提供する接着剤の被膜のラット体内モデル。モデルには、肩甲上腕関節の運動 (ROM) と関節剛性の低下回転範囲で長期間関節縫合固定内部固定が含まれています。
Abstract
この提案は、この条件と匹敵する arthrofibrosis の他の病因学のための潜在的な治療法の選択肢の研究のための接着剤の被膜のラット生体内でモデルを作成することを目的と。モデルは、肩の関節固定ラットを介して肩甲骨は上腕骨縫合、関節内のスペースに侵入し、低下回転 ROM と増加の共同の結果なしセカンダリの拘縮の結果剛性。
本研究の目的のための 10 の Sprague-dawley ラットを使いました。ベースラインの ROM 測定は、肩甲上腕固定前に撮影されました。ラットは、固定縫合糸が削除され、ROM と関節剛性の変化を評価した前に 8 週間固定に服従しました。固定は ROM の大幅な削減につながったかどうかを評価するため運動の変化を求めた。ROM はフォロー アップの期間の時間の各ポイントで測定したし、ベースラインの内部および外部の ROM 測定と比較しました。剛性、関節の動態を評価するために初期の外旋 60 ° と 80 ° の初期内部回転に到達するために必要なトルク (textと tint ) の違いを決定することで算出しました。
フォロー アップの日 0 に関節の縫合固定を除去した後ベースラインと比較して総 ROM で 63% の減少を発見しました。19% 制限減速進行状況のフォロー アップ、5 週目まで継続的な改善を見ました。、フォロー アップの 8 週 0 日目フォロー アップにロマまた、の 18% 制限があった、13.3 Nmm ベースラインと比較して増加したトルクがわかった。1.4 ± 0.2 に 8 週の合計トルクを測定した Nmm の初期測定値よりも高い。この作品は、永続的な減らされた ROM と剛性と肩接着剤の被膜のラットのモデルを紹介します。
Introduction
肩の接着剤の被膜は、五十肩や肩の拘縮と呼ばれます。制限肩甲上腕運動と高度な線維症と関節拘縮1,2,3の結果としておそらく痛みが特徴です。条件には、共同カプセル2,3(タイプ I および III) 結果密なコラーゲン マトリックスと線維芽細胞および myofibroblast 細胞の動員が含まれます。関節の拘縮、性別、糖尿病、甲状腺機能亢進症、外傷、長期固定化4,5,6などを開発するための多くの可能な危険因子があります。
効果的な治療オプションが不足していると大抵保守的なケアで改善していない極端なケースで手術のリリースの形での介入での理学療法があります。最善の治療法は未定のままし、医療分野7,8年の大きな関心の対象となってきた。新しい治療方法の開発は、外傷性関節内に依存しない条件の再現可能な動物モデルを必要があります。最適な接着剤の被膜モデルは病気の 2 つの主要な特性を含むべきである: 拘縮肩関節包および運動 (ROM) の範囲の長期化。Schollmeierら9はイヌ科動物の肩拘縮を開発するキャストを使用して最初の関節拘縮モデルの 1 つを説明します。彼らはまた ROM と関節内の圧力の変化は、固定9中止後通常レベルに戻ったことを報告しました。ただし、研究で述べた重要な制限肢鋳造技術の使用のための動物の間で変動しています。再現性のあるモデル、菅野らを得るために10後で肩の固定を使用して接着剤の被膜ラット モデルを提示しました。ただし、彼らは彼らのモデルと ROM の大幅な削減を実現、彼らはない状態かどうかこれらの変更一時的または長期的です。本研究の目的は、モデルを作成する適切な体内肩拘縮ラット ROM と関節拘縮に及ぼす長期関節肩甲上腕関節固定を調査してでした。
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Protocol
研究は、制度的動物のケアとベス イスラエス ディーコネス メディカル センターで利用委員会によって承認されました。低体温症を避けるため、また不要な長時間麻酔を避けるために注意が払われました。動物それぞれの ROM 測定セッションで重く、減量のため監視します。
1. 調査対象
- 13 週間手術、体重 250-300 g 間の範囲の時に古い 10 の Sprague-dawley ラットを使用します。
2. 手術
- 麻酔下で外科的固定化の前に、60 ° 外旋と内旋 80 ° の回転角度の関数として基準トルクを測定 (ステップ 5 を参照してください)。
-
誘導チャンバー内の吸入を介して 5% イソフルレン麻酔し、手術中鼻の円錐形によって 2% イソフルラン維持します。
- 麻酔中に体温を維持するために動物の下の水ベースの加熱要素を使用します。
- 痛みのコントロールのためラットの体重に応じて 1.2 mg/kg の用量で皮下持続的なリリース ブプレノルフィンを管理します。
-
拉致 (上腕骨骨幹部と肩甲棘の間の角度)10の 60 ° の角度で固定左の肩甲上腕関節, 11.
- 上腕骨骨幹部に平行後部縦切開で手術を開始します。関節肩甲上腕の直下の皮膚切開を行うし、約 3 cm の拡張します。
- 外側縁、肩甲骨と上腕骨骨幹部の遠位三分の二を通した穿孔による肩甲上腕関節を固定する 2 縫合糸 (編組ポリエステル) を使用し、図 1 aに示されているようにその後締め。上腕動脈などの重要な構造の収縮を避けるために余分な労力がかかります。
注: 手術手技 (X
3. 切開を閉じる
- 適切な止血後皮膚クリップを使用して皮膚切開を閉じる。
- 麻酔を中止し、暖かい環境で監督の下で回復する動物を許可します。動物が胸骨の横臥を維持するために十分な意識を回復した後は、そのケージに戻ります。
- 術後すぐに通常の活動に戻ります動物を許可します。肩甲上腕関節を修正する内部の縫合に主に依存する制限なしに移動する動物を許可します。
- 感染の可能性を監視するためには、最初の術後 1 週間の間に毎日切開部位を調べます。
- 手術後 10 日目傷のクリップを削除します。
注: している最中、筋肉の操作はなかったし、技術がこのように莢膜と関節の継続性と解剖学的整合性を維持、任意の関節内トラウマを伴わない。どちらも外部拘束も活動の制限は、我々 のプロトコルに続いた。 - 徐放ブプレノルフィンを使用して鎮痛麻酔導入から始まる 1.2 mg/kg の用量で皮下注射し、必要な場合、すべての 72 h を繰り返すを提供します。
4. 抜糸固定後 8 週間
- 誘導チャンバー内の吸入を介して 5% イソフルレン麻酔、手術中鼻の円錐形によって 2% イソフルランの維持します。痛みのコントロールのためラットの体重に応じて 1.2 mg/kg の用量で皮下持続的なリリース ブプレノルフィンを管理します。
- 前の手順からの傷の上に切開を行います。
- 縫合糸をカットし、上腕骨と肩甲骨から削除します。
- 切開傷のクリップを閉じます。
- 感染の兆候を検出する最初の週の間に毎日切開部位を調べます。痛みと同様に苦痛を監視します。
- 手術後 10 日目傷のクリップを削除します。
5. 範囲の動きと関節の硬さ測定
-
固定アーム クランプ センサー アセンブリ、ピボット車軸11から成るカスタマイズされたデバイスを使用して前後に ROM とパッシブの肩力学を測定します。これは手術前に実行されます (ベースライン) と抜糸後継続的に。
- 抜糸 (フォロー アップ日 0)、直後にメジャー ROM と週に 2 回その後。
- 週に 1 度、10% 未満を記録したら前の時点から変更する測定を減らします。
注: 週間 ROM をテストした後各動物の ROM 間で変更されなかった大幅にテスト時間ポイント (10% 未満に変更)。ROM は、この時点で高原に見えた、したがって、テスト頻度を週 2 回から週に一度の減少は十分なと感じました。
- 測定を効率的に促進するために誘導のための 5% と 2% (約 5 分) の手順の完全な長さのメンテナンスのためにイソフルランによる精度気化器を使用して麻酔下で測定を行います。麻酔中に体温を維持するために動物の下の水ベースの加熱要素を使用します。
- レーザー ガイドの助けを借りて ROM 測定のために適切の動物を配置します。検出軸で 90 ° 前方への屈曲位置アーム クランプの前肢は、上腕骨の長軸に揃えられます。手首と肘の図 1 bに示すように前肢を保護します。
- 一貫した方法で ROM とトルクを評価するステッピング モーターによって受動的な前肢の回転を制御します。マイクロ コント ローラーとステッピングモータを制御します。開始と測定の終了を示すトルク センサーからのそれらと組み合わせて、傾斜計からの入力を使用。
- マイクロ コント ローラーをコンピューターと、社内開発の MATLAB のコードを使用して、コントロールに接続します。
- ベースライン測定のみ、サイクル センサー アセンブリ 3 回外旋 60 ° と 80 ° イニシャル トルク測定を取得する内部の回転の間の (外部: textと内部: tint) 後で比較のため。
- ROM 測定トルクの値を使用各動物独自のベースライン測定値 (textと tint) でプログラムのプリセット入力変数としてローマを使用して回転のベースライン測定停止比較として変更を検出するにはその後の ROM 測定のポイント。変更は、0.2 ° の分解能で検出されました。
- 剛性測定のトルクの変化を検出するためにプログラムのプリセット入力として 60 ° 外旋と 80 ° の内部回転の元の回転角度を使用します。0.01 Nmm の解像度の変更が検出されました。
- 各 ROM アセスメントとして同じ日に動物の重量を量る。スケールに動物を配置し、その質量を記録します。これらのデータは、調査の間に動物の健康状態を評価するためのツールの一つとして使用されました。
- 次の回復、檻にラットを戻り、痛みや苦痛の兆候を監視します。このテストを通して動物まで、残ってない無人それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。
注: カスタマイズされたデバイスは、以前私たちのグループ {ヴィラ カマチョ 2015} によって報告された ROM とトルクの測定を実現しました。デバイスは、ステッピング モーターで回転させる、カスタム MATLAB スクリプトによって制御シャフトで構成されるカスタムメイドの治具です。トルク センサー、慣性計測ユニットは、トルクをキャプチャし、供試体の構音時位置データに使用されます。
6. 事後免疫組織学的解析
- 8 週間 ROM 測定期間の終わりに、CO2の露出でラットを安楽死させます。
- 左両方を解剖 (固定化) と右 (健常者) 肩の disarticulating から尺骨、上腕骨、鎖骨と胸腔内から肩甲骨を区分します。
- 10% 中性緩衝ホルマリン液、別の 2 ヶ月間の pH 7.4 でエチレンジアミン四酸 (EDTA) の 10% のソリューションで脱灰処理に続いて 3 日間、摘出の肩を修正します。
- この過程で、穏やかな攪拌サイクルでシェーカーでサンプルを配置し、4 ° C で保存肩関節毎週マイクロ断層レントゲン写真撮影 (uCT) スキャンでの脱灰を監視します。
注: EDTA は、結晶サイズ12,13,14を徐々 に減らしてアパタイト結晶の外側面からカルシウム イオンを結合するキレート剤です。このプロセスは非常にゆっくりと、穏やかな、免疫組織染色 (IHC) などの技術を保持する必要があります特定の組織要素の検出に使用されます。EDTA decalcifies 標本率は pH と溶液の濃度に依存しています。PH、面でそれの範囲 7 から 7.4, 脱灰スピードを上げるよりアルカリ性の溶液中でです。ただし、pH レベルの高いソリューションは、主要組織を損傷することが。また、このような実験のため通常 EDTA 濃度、間 10% から 14% にあるが、これは、少なくとも 3 〜 4 回脱灰液の交換を必要とするので、カルシウムを接着したら、アクティブなエージェントの枯渇になることは非常に重要です。毎週15。 - 脱灰処理を締結、一度組織切片用スタックとパラフィンの肩甲上腕関節をマウントします。コロナのスライスを許可するサンプルを向けます。上腕骨頭の深度を 50% で得られたスライス (センターで半ば歯肉)図 1に示します。関節の線維組織の存在を示すためにペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法を用いた免疫組織染色を行います。4,9,10,16
- クエン酸ナトリウム緩衝液 (クエン酸ナトリウム 10 mM、0.05 のトゥイーン 20%、pH 6.0、95 ~ 100 ° C で 5 分間予熱) プラスチック Coplin jar および正規電子レンジに 10 分置くことでスライドを水没によってマイクロ波照射による抗原検索を実行します。で媒体。室温で 30 分間冷却するスライドを許可します。
- 30 分間ヤギ血清を使用してブロックを実行し、プライマリ マウス単クローン抗体 (希釈 1: 400) 4 ° C で一晩フィブロネクチンに標本を孵化させなさい
- 一次抗体の孵化、洗い流して PBS で 2 回標本 (0.5 μ G/ml) 10 分;二次抗体、ヤギ抗マウス IgG ペルオキシダーゼ共役 (1: 400 希釈) 30 分の間孵化させなさい。
- PBS で 2 回標本を洗う (2.5 μ g/mL) 10 分、暗闇のなかで 10 分対比染色 Carazzi ヘマトキシリン 3, 30 ジアミノベンジジン テトラヒドロアントロキノン塩化物と 30% 過酸化水素に公開シェーカーで。
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Representative Results
動きの範囲
フォロー アップは、0 日目、我々 を発見したベースラインと比較して総 ROM で 63% の減少 (P <.001。19% 制限で進行が停止したとき、我々 はフォロー アップ、5 週目まで ROM の緩やかな改善を観察 (P < 0.001)。残りの制限、合計 ROM の 18% はフォロー アップの 8 週目でまだ明らかだった (P < 0.001)。
剛性
フォロー アップ日 0、ベースラインと比較して総トルク 13.3 Nmm の増加を発見 (P < 0.001);8.9 Nmm 外部 (P =.002) と 4.4 Nmm 内部的 (P < 0.001)、159.6% 増加した 138.8% 外部回転トルクの増加、その結果、内部の回転トルク、合計 149.2% 全体的なトルクを増加しました。1.4 ± 0.2 に全測定トルクがわかった、フォロー アップの 8 週の Nmm のベースラインよりも高く (P = 0.115)、外部トルク 0.6 ± 0.1 Nmm 増加 (P = 0.369) と内部トルク 0.7 ± 0.2 Nmm 上昇 (P = 0.036)。これはトルクが増加 10% 外部 25.7% と内部的には、全体の 17.9% 増加のことを示します。術後 3 週の初めには、剛性の向上は頭打ち。
組織学的結果
図 2 aに見られるように、そのままグループはカプセルと大腿骨頭と通常の細胞組織の関節面との間の適切な分離を表示されます。さらに、関節軟骨、滑膜組織では通常の細胞組織が認められました。ただし、外科的固定化グループは、莢膜の癒着の証拠肩甲上腕の下面共同です。さらに、周囲の組織は密度減少関節腔 (図 2 b) と緊密なカプセルにつながる、そのまま肩と比較した場合に表示されます。フィブロネクチンのステンド グラスのスライス表示被膜厚さを増し契約手術グループ (図 2 b)。健康的なコントロール (図 2 a) と比較して。これらの所見は関節固定10の動物モデルで報告された文献を以前と一致しているし、適切な拘縮モデルの作成をサポートします。
図 1: 試験装置。(A) 肩関節、肩甲骨の外側端と上腕骨の間にしっかりと合格の 2 の編みポリエステル縫合糸で固定(B) カスタマイズされた ROM とパッシブの肩力学測定装置a) ステッピング モニター。B から成るセンサー アセンブリ) 反応トルク センサーと c) 方位センサー。d) のアームのクランプ。(C) 内部または (D)11肩甲上腕関節の外旋。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 上腕骨頭の辺縁系。画像は、フィブロネクチン (IHC) 40 倍の倍率で得られたステンド グラス。スケール バー = 200 μ m (A) 健康管理。(B) 手術コントロール。赤い矢印は、共同の被膜厚さを概説します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 正規化された両方の健康と外科的制限ラット肩甲上腕関節トルクと可動域.内部回転は、肯定的な外部回転が負の値として表されます。灰色の領域を示しています 95% 信頼区間 (CI)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、肩甲上腕関節の内部固定による肩関節の癒着のラット モデルを提案します。さらに、それは固定の除去後、少なくとも 8 週間合計 ROM の拡張の減少を示しています。ROM の異なる時点での変化を計算するために測定が動物の特定のベースラインと比較されました。逆に、菅野ら10は前のヴィヴォROM の変更を決定するためにすべての動物の標準化されたトルクを使用しました。
2008 年、サーヴァーら17は、非外科的外固定による肩関節拘縮に報告しました。彼らの調査の一時的な増加関節拘縮の固定化が負傷し、肩の治療後フォロー アップの 8 週によって解決されます。まだ、本研究では、トルクと角度、むしろ多項式フィット (図 3) の線形関係見つかりません我々 でした。さらに、のみである関節拘縮の内部回転の評価時にベースラインと比較して統計的に有意な差固定の 8 週間後の剛性の 25.7% 増加の保存します。
独自の内部統制として各動物のベースラインの ROM と剛性の測定を使用しました。動物18間の可能なバリエーションを指定すると、内部統制として同じ動物の対側の肩を使用内部妥当性が高まり、必要な動物の数を減らすことができます。
我々 の研究の制限の 1 つは、ROM を測定に使用される装置が肩甲骨を安定しませんです。しかし、ラットの肩甲骨は人間のよりもさらに多くの上向きの回転をさらに斜めから指向です。検査冶具のしっかりしたプレートに対して、肩甲骨がかかっているよう仰臥位でラットを持つべきである肩甲骨傾斜の制御理論的に。研究のさらなる制限は、内部回転と肩甲上腕関節の外部回転の評価をのみことです。これは部分的に事実というため外転、屈曲、オーバーヘッドの活動徹底した外固定または私達のものとは異なるシステムを必要とする ROM テスト、中に共同の胸郭の制限を必要とします。
病態と癒着の治療は不十分な理解される続けます。関係なく、病因、痛みを引き起こし、肩甲上腕運動1,3,11を制限するカプセルの拘縮であることが示されています。さらに、原因となり、拘縮10関節の線維症は、炎症性のトリガーがあることが示唆されています。私たちのラットのモデルは、プライマリ拘縮の初期炎症侮辱を真似できないがそれにもかかわらず、それは十分に接着剤の被膜とその病理学的変化10,19の特徴的な動態をレプリケートします。このモデルは、ROM と増加の関節拘縮、拘縮肩に対する現在および潜在的な治療上の処置の包括的な評価を可能にする永続的な削減を呼び出します。
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Disclosures
どれも
Acknowledgments
著者は、このプロジェクトへの財政支援を提供するため氏と夫人トム ・ フィリス Froeschle を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA | 250-300 g | |
| Surgical tool: | |||
| Injection needle | BD 1' 30 guage | ||
| Needle holder | |||
| 5% isoflurane | |||
| 2% isoflurane | |||
| Nose cone | |||
| Skalpel and skalpel holder | No. 11 scalpel | ||
| Curved hemostat forceps | |||
| Staright hemostat forceps | |||
| Tissue retractor | |||
| Toothed tissue forceps | |||
| Plain tissue forceps | |||
| Dissecting scissors | |||
| Suture scissors | |||
| Skin clip applicator | Any standard staples for wound closure | ||
| Immobilization material | Ethicon | No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization | |
| Other materials: | |||
| Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp | Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper | ||
| Orientation sensor (part of sensor assembly) | MicroStrain Inc., Williston, VT, USA | 3DM-GX3-15 | |
| Reaction torque sensor (part of sensor assembly) | Futek Inc., Irvine, CA, USA | TFF400 | |
| Stepper Motor | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | https://www.sparkfun.com/products/13656 | |
| Microcontroller | Torino, Italy). | Arduino UNO, R3 | |
| MATLAB code | MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA | ||
| Weight Scale | Ohaus |
References
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