Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

यहाँ हम एक उच्च प्रवाह प्रतिदीप्ति-आधारित परख का वर्णन है कि प्लाज्मा झिल्ली fluorometric और इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से रहने वाली कोशिकाओं में दक्षता को फिर से सील करने के उपाय । इस परख स्क्रीनिंग दवाओं या लक्ष्य जीन है कि प्लाज्मा स्तनधारी कोशिकाओं में सील झिल्ली को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

उनके शारीरिक वातावरण में, स्तनधारी कोशिकाओं अक्सर यांत्रिक और जैव रासायनिक तनाव के अधीन है कि प्लाज्मा झिल्ली क्षति में परिणाम । इन नुकसान के जवाब में, जटिल आणविक मशीनरी तेजी से प्लाज्मा झिल्ली को फिर से सील करने के लिए अपनी बाधा समारोह बहाल करने और सेल अस्तित्व को बनाए रखने । इस क्षेत्र में अनुसंधान के ६० साल के बावजूद, हम अभी भी सेल सील मशीनरी की एक पूरी तरह से समझ की कमी है । सेलुलर घटकों की पहचान करने के लक्ष्य के साथ कि प्लाज्मा झिल्ली रिसील या दवाओं है कि सुधार कर सकते है resealing, हम एक प्रतिदीप्ति आधारित उच्च प्रवाह परख है कि प्लाज्मा झिल्ली स्तनधारी कोशिकाओं में दक्षता को फिर से सील करने के उपाय विकसित किया है microplates में कल्चर्ड । प्लाज्मा झिल्ली की क्षति के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में, कोशिकाओं जीवाणु ताकना करने के लिए उजागर कर रहे हैं-विष listeriolysin O (LLO), जो रूपों बड़े 30-50 एनएम व्यास proteinaceous कोलेस्ट्रॉल युक्त झिल्ली में pores । एक तापमान नियंत्रित बहु मोड microplate रीडर का उपयोग brightfield और जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के साथ संयोजन में तेजी से और संवेदनशील spectrofluorometric माप के लिए अनुमति देता है । एक झिल्ली impermeant न्यूक्लिक अम्ल-बाध्यकारी fluorochrome द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति तीव्रता के काइनेटिक विश्लेषण कोशिका को सील करने की दक्षता की गणना के लिए अनुमति देता है, घाव भरने और कोशिका जनसंख्या स्तर पर पुन सील करने की हद तक दर्शाता है . प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कोशिकाओं के गणन के लिए अनुमति देता है, जो परमाणु प्रोटीन हिस्टोन बी एक फ्लोरोसेंट कल्पना व्यक्त constitutively, microplate के प्रत्येक में अच्छी तरह से उनकी संख्या में संभावित रूपों के लिए खाते में और अंततः के लिए अनुमति देता है विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान । यह उच्च प्रवाह परख एक शक्तिशाली मेजबान जीन या exogenously के लिए स्क्रीनिंग के माध्यम से झिल्ली की मरंमत तंत्र की हमारी समझ का विस्तार करने की उंमीद उपकरण यौगिकों कि नियंत्रण प्लाज्मा झिल्ली को पुनः सील कर जोड़ा है ।

Introduction

स्तनधारी कोशिकाओं यांत्रिक, आसमाटिक, और जैव रासायनिक तनाव, प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के अधीन हैं । तेजी से और कुशल फिर से सील के बिना, क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को जल्दी से क्रमादेशित या मौत का शिकार हो जाएगा । 1960 के दशक के बाद से, प्लाज्मा झिल्ली को फिर से सील करने की प्रक्रिया को समझने के प्रयासों को अपने शिथिलताओं के साथ जुड़े विनाशकारी परिणामों से प्रेरित किया गया है । दरअसल, इस तरह के अंग के रूप में रोग-करधनी पेशी Dystrophy, मधुमेह, और Chediak-हिगाशी सिंड्रोम की कमी प्लाज्मा झिल्ली जीन एंकोडिंग dysferlin में उत्परिवर्तनों के कारण मरंमत, उंनत glycation अंत उत्पादों के उत्पादन से जोड़ा गया है, और दोषों में lysosomal ्े नियामक CHS1, क्रमशः1,2,3,4,5,6। हालांकि, तारीख करने के लिए, झिल्ली resealing की हमारी समझ अभी भी सीमित है7। प्रारंभिक अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि झिल्ली resealing extracellular Ca की आमद द्वारा शुरू की है2 + क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से8,9,10। तब से, कई गैर पारस्परिक रूप से अनंय Ca2 +-निर्भर तंत्र को कोशिकाओं को फिर से सील करने का प्रस्ताव किया गया है । पैच परिकल्पना का प्रस्ताव है कि घाव करने के लिए निकटता में, intracellular बुलबुले एक दूसरे के साथ फ्यूज और क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली एक पैच के रूप में कार्य करने के लिए11,12,13,14. एक दूसरे मॉडल का प्रस्ताव है कि कैल्शियम पर निर्भर exocytosis lysosomes के घाव स्थल पर lysosomal एंजाइम एसिड sphingomyelinase, जो प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में sphingomyelin ceramide धर्मांतरित विज्ञप्ति । ceramide में लिपिड संरचना के परिणाम में यह अचानक परिवर्तन-चालित endocytosis के क्षतिग्रस्त क्षेत्र15,16,17. अंत में, तीसरे प्रस्तावित तंत्र endosomal छँटाई परिवहन (ESCRT) के लिए आवश्यक जावक के गठन को बढ़ावा देने के लिए एक भूमिका शामिल है-बुलबुले का सामना करना पड़ रहा है कि प्लाज्मा झिल्ली18से बंद कली । इन मॉडलों में केवल प्रोटीन के सीमित सेट की पहचान की गई थी और उनकी मशीनरी का आगे आविर्भाव होना आवश्यक है ।

यहां हम एक उच्च-प्रवाह परख का वर्णन है कि प्लाज्मा अनुयाई स्तनधारी कोशिकाओं में दक्षता सील रिकॉमबिनेंट listeriolysin ओ (LLO)19द्वारा मध्यस्थता नुकसान के अधीन झिल्ली के उपाय । LLO एक ताकना बनाने वाला विष (PFT) facultative intracellular रोगज़नक़ लिस्टिरिया monocytogenes20,21,22 से स्रावित है और MACPF/सीडीसी (झिल्ली हमला परिसर, perforin के अंतर्गत आता है, और कोलेस्ट्रॉल पर निर्भर cytolysin) superfamily. MACPF स्तनधारी ताकना-प्रतिरक्षा सुरक्षा में शामिल प्रोटीन बनाने हैं, जबकि CDCs बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों को मुख्य रूप से ग्राम द्वारा उत्पादित-सकारात्मक रोगजनकों कि क्षति मेजबान कोशिकाओं को अपने रोगजनक जीवन शैली को बढ़ावा देने के लिए23। CDCs पानी में घुलनशील मोनोमर या dimers के रूप में संश्लेषित कर रहे है कि प्लाज्मा झिल्ली और oligomerize में ५० उपइकाईयों के एक परिसर में ताकना में मौजूद कोलेस्ट्रॉल को बांध । फिर से बनाना परिसर में β-किस्में लिपिड bilayer भर में डालने के लिए पुनर्व्यवस्थित, एक β-बैरल ताकना है कि व्यास24,25,26,27में 30-50 एनएम spans के गठन.  इन बड़े में और सेल से बाहर आयनों और छोटे सेलुलर घटकों के प्रवाह की अनुमति है; हालांकि, कुछ अध्ययनों का प्रस्ताव किया है कि छोटे आकार के pores भी28,29,30का गठन कर रहे हैं । CDCs के अलावा, LLO अपरिवर्तनीय पीएच सहित अद्वितीय गुण प्रदर्शित करता है-और तापमान पर निर्भर एकत्रीकरण, जो उच्च-प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूल है31,३२। LLO 4 ˚ सी पर सेल संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है, एक तापमान स्वतंत्र कोशिकाओं को अपनी बाध्यकारी है, लेकिन नहीं ताकना परिसर के गठन के लिए । ताकना गठन की दीक्षा तो ३७ ˚ सी के लिए तापमान बढ़ाने के द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है, झिल्ली के विमान में विष अणुओं के कुशल प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए oligomers फार्म और के गठन के लिए ताकना पीढ़ी में शामिल remodeling । इसलिए, तापमान में स्विच के बाद, कोशिका क्षति के काइनेटिक प्लाज्मा झिल्ली को बाध्य विष की मात्रा पर निर्भर करेगा । महत्वपूर्ण बात, घुलनशील LLO (प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य नहीं) तेजी से और अचल समुच्चय जब तापमान ३७ ˚ सी है, जो दूर असीम विष अणुओं को धोने और समय के साथ झिल्ली क्षति की हद तक सीमित करने की आवश्यकता को दूर करने के लिए पहुंचता है । अंत में, क्योंकि LLO कोलेस्ट्रॉल और रूपों को बांध कोलेस्ट्रॉल युक्त झिल्ली में pores, इस परख स्तनधारी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदाई है । यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि LLO मेजबान सेल ताकना गठन के माध्यम से मुख्य रूप से संकेतन प्रभावित करता है, कुछ अपवाद है जो में ताकना-स्वतंत्र सेल संकेत हो सकता है के साथ३३,३४,३५,३६ ,३७,३८,३९. इसलिए, यह LLO संकेतन गतिविधियों झिल्ली की मरंमत की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते है कि बाहर रखा जा सकता है ।

यह परख सीधे एक सेल impermeant fluorochrome (जैसे, propidium आयोडाइड) कि निष्क्रिय घायल कोशिकाओं में प्रवेश करती है और अत्यधिक फ्लोरोसेंट हो जाता है एक बार यह न्यूक्लिक एसिड के साथ सहयोगियों के शामिल मापने के द्वारा घायल सेल की हद तक का आकलन . इसलिए, fluorochrome प्रयोग भर में सेल संस्कृति माध्यम में बनाए रखा जा सकता है, सेल के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति घायल । न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता विष की एकाग्रता के साथ वृद्धि होगी और, विष की एक दी एकाग्रता के लिए, समय के साथ वृद्धि होगी जब तक सभी pores का गठन कर रहे हैं, और कोशिकाओं को पूरी तरह से मरम्मत कर रहे हैं या जब तक संतृप्ति तक पहुँच गया है. extracellular Ca की आमद2 + झिल्ली pores के माध्यम से एक साइन शर्त गैर घटना को फिर से सील करने के लिए है । इसलिए, प्रतिसील दक्षता परोक्ष रूप से एक सीए2+-मुक्त मध्यम (मरंमत प्रतिबंधात्मक शर्त) में घायल करने के लिए (मरंमत स्वतंत्र हालत) सीए2 युक्त संस्कृति मध्यम में घायल सेल की तुलना द्वारा सबूत हो सकता है । क्योंकि न्यूक्लिक एसिड की प्रतिदीप्ति तीव्रता-बाध्यकारी डाई सीधे प्रत्येक कुआं में कोशिका एकाग्रता के लिए आनुपातिक है, यह सभी कुओं में एक ही एकाग्रता में बीज कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी एक अच्छी तरह से पहले और परख के बाद कि कोशिका टुकड़ी नहीं होती है सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में चल, एकत्रित कोशिकाओं अस्पष्ट कर सकते है प्रतिदीप्ति रीडिंग जो डेटा व्याख्या जटिल हो सकता है । कोशिकाओं की गणना करने के लिए, परमाणु-स्थानीयकृत हिस्टोन बी-GFP (H2B-GFP) व्यक्त कोशिकाओं इस परख में इस्तेमाल किया गया । तापमान नियंत्रित, बहु-मोड, microplate पाठकों ३७ डिग्री सेल्सियस पर रहने वाले कोशिकाओं की सूक्ष्म इमेजिंग के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रयोग तेजी से, उच्च प्रवाह मापन (एक ९६ या ३८४-well प्लेट प्रारूप का उपयोग) । बाद के लिए सेल संख्या की गणना और विशिष्ट कोशिका आबादी के अंतिम गठन का निरीक्षण किया जा सकता है ।

अंत में, इस परख उपयोगकर्ताओं को मेजबान अणुओं या exogenously जोड़ा यौगिकों कि झिल्ली की मरंमत नियंत्रण कर सकते है के लिए स्क्रीनिंग द्वारा झिल्ली की मरंमत तंत्र की जटिलता के अपने ज्ञान का विस्तार करने की क्षमता प्रदान करता है । निम्न प्रोटोकॉल LLO करने के लिए उजागर कोशिकाओं की सील दक्षता को मापने के लिए प्रयोगात्मक चरणों का वर्णन करता है और एक दी दवा या सेलुलर उपचार के प्रभाव को फिर से सील करने पर दक्षता का मूल्यांकन.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी

  1. सेल चढ़ाना
    नोट: मानव ग्रीवा उपकला कोशिकाओं, हेला और हेला व्यक्त हिस्टोन बी-GFP (H2B-GFP), इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया, लेकिन इस परख अन्य स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है19.
    1. Trypsin के 2 मिलीलीटर-EDTA ०.२५% के साथ कोशिकाओं को धोने से एक ७५ सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी से अनुयाई कोशिकाओं को अलग । ताजा trypsin के 2 मिलीलीटर-EDTA ०.२५% के साथ इस्तेमाल किया trypsin बदलें ।
    2. जब तक कोशिकाओं गोल और कुप्पी से अलग है 5 मिनट के लिए ३७ ˚ C पर कोशिकाओं की मशीन ।
    3. वृद्धि मध्यम के 8 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend (DMEM युक्त 10% हीट-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin) ।
    4. सेल निलंबन के एक hemocytometer और 10 µ एल का उपयोग कर कोशिका एकाग्रता का निर्धारण ।
    5. वृद्धि मध्यम में कोशिकाओं २.५ की एकाग्रता के लिए पतला x 105 कोशिकाओं/
    6. एक बाँझ पिपेट बेसिन में सेल निलंबन डालो और अच्छी तरह से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर निलंबन मिश्रण ।
    7. एक 12-मल्टीचैनल micropipette और २०० µ l टिप्स का उपयोग कर, हेला कोशिकाओं को वितरित (२.५ x 104 कोशिकाओं/100 µ एल/अच्छी तरह से) में तपसिल (या quadruplicate) में एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट, साफ नीचे, काले polystyrene ऊतक संस्कृति-इलाज प्लेट ।
      नोट: एक चढ़ाना व्यवस्था चित्रा 1में एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है ।
    8. संस्कृति ३७ ˚ सी और 5% CO2में एक humidified सेल संस्कृति मशीन में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं ।
  2. स्टॉक समाधान तैयारी
    1. 1 एल के एक 10x स्टॉक के बफर एम तैयार (M1 और M2 तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया) के ९५ जी जोड़कर हैंक्स संतुलित नमक समाधान, MgCl के ०.४७६ जी2 (5 मिमी), और HEPES के २३.८३ ग्राम (१०० मिमी) के लिए ९०० मिलीलीटर पानी. ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें और 1 एल फिल्टर निष्फल करने के लिए मात्रा बढ़ा ।
    2. ५० मिलीलीटर की एक 50x (१.२५ मीटर) का स्टॉक ग्लूकोज के ११.२६ g को जोड़कर तैयार करें-(+)-ग्लूकोज को कुल ५० मिलीलीटर पानी की. फ़िल्टर निष्फल समाधान ।
    3. एक 100x के ५० मिलीलीटर तैयार (१२० मिमी) CaCl2 के ०.६६६ ग्राम जोड़कर कैल्शियम का स्टॉक ५० मिलीलीटर पानी की कुल । फ़िल्टर निष्फल समाधान ।
    4. ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (2-aminoethylether)-n, n, n ', n ', tetraacetic एसिड (EGTA) के ०.९५१ ग्राम को जोड़कर ४० मिलीलीटर पानी की ५० मिलीलीटर की एक 10x (५० मिमी) स्टॉक तैयार करें । EGTA को भंग करने के लिए NaOH का उपयोग करके पीएच को बढ़ाएं, फिर ५० मिलीलीटर की मात्रा बढ़ाएं । फ़िल्टर निष्फल समाधान ।
    5. एक एकल ९६-well प्लेट के लिए, मध्यम 1 (M1, ca2 +), ५० मिलीलीटर के मध्यम 2 (M2, ca2 +मुक्त), और 15 एमएल मध्यम 2 EGTA के साथ पूरक के ५० मिलीलीटर तैयार करते हैं, तदनुसार:
      1. M1 के लिए, 10x बफर एम के 5 मिलीलीटर, 100x CaCl2के ०.५ मिलीलीटर, और 50x ग्लूकोज की 1 मिलीलीटर पानी की ४३.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. M2 के लिए, 10x बफर एम के 5 मिलीलीटर और 50x ग्लूकोज की 1 मिलीलीटर के लिए पानी की ४४ मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. M2/EGTA के लिए, १.५ मिलीलीटर 10x बफर एम और 10x EGTA के १.५ मिलीलीटर के लिए 12 मिलीलीटर पानी जोड़ें ।
        नोट: propidium आयोडाइड (PI) युक्त सभी समाधानों को कक्षों में जोड़ने से पहले सीधे तैयार किया जाना चाहिए ।
  3. प्लेट रीडर/इमेजिंग Cytometer सेटिंग्स
    नोट: एक spectrofluorometer और एक इमेजिंग cytometer: दो का पता लगाने इकाइयों के साथ सुसज्जित एक बहु-मोड प्लेट रीडर का उपयोग करें. fluorophores photobleaching से बचने के लिए प्रतिदीप्ति एक्सपोज़र सीमित करें ।
    1. पूर्व-३७ ° c करने के लिए प्लेट रीडर परख प्रदर्शन से पहले गर्म ।
    2. तदनुसार सेटिंग्स मोड के भीतर काइनेटिक परख के लिए निर्धारित मापदंडों:
      1. ऑप्टिकल विंयास के लिए Monochromator, FL (प्रतिदीप्ति), और काइनेटिक चुनें, मोड पढ़ें, और प्रकार पढ़ा, क्रमशः ।
      2. तरंग दैर्ध्य सेटिंग्सके अंतर्गत, क्रमशः एक 9 और 15 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन bandpass का चयन करें । propidium आयोडाइड (PI) का उपयोग परख के लिए, क्रमशः ५३५ और ६१७ एनएम के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट ।
      3. प्लेट प्रकारके तहत, प्लेट प्रारूप और एक पूर्व सेट प्लेट विन्यास एक काले दीवार स्पष्ट नीचे प्लेट के लिए इसी के लिए ९६ कुओं का चयन करें ।
      4. पढ़ें क्षेत्रके तहत, कुओं कि काइनेटिक भर में विश्लेषण किया जाएगा पर प्रकाश डाला ।
      5. पीएमटी और प्रकाशिकीके तहत, पूर्व निर्धारित करने के लिए 6 पढ़ने के प्रति चमक और नीचे से पढ़नेके लिए बॉक्स की जांच करें ।
      6. समयके तहत, एक 30 मिनट काइनेटिक परख के लिए कुल चलाते समय बॉक्स में 00:30:00 डालें, और अंतरालके लिए 00:05:00 डालें ।
        नोट: प्रत्येक समय बिंदु और एक तरंग दैर्ध्य के लिए, एक पूर्ण ९६-अच्छी तरह से थाली के पढ़ने के समय 30 एस है ।
      7. सही करने के लिए सेटिंग्स जानकारी में निर्दिष्ट सेटिंग्स की पुष्टि करें और ठीकचुनें । प्रेस पढ़ें काइनेटिक चलाने शुरू करने के लिए ।
    3. सेटिंग्स मोड में तदनुसार इमेजिंग पैरामीटर सेट करें:
      1. Minimax, इमेजिंग, और समापन बिंदु ऑप्टिकल कॉंफ़िगरेशन, पढ़ने के लिए मोड, और प्रकार पढ़ने के लिए क्रमश: चुनें ।
      2. तरंग दैर्ध्यके तहत, संचारित प्रकाशका चयन करें, और या तो या दोनों प्रतिदीप्ति उत्तेजना और 456/541 एनएम (GFP) और 625/713 एनएम (PI) के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए इसी बक्से ।
      3. प्लेट प्रकार और पढ़ने के क्षेत्र के लिए एक ही विकल्प का प्रयोग करें के रूप में कदम 1.3.2.3 और 1.3.2.4 में परिभाषित किया ।
      4. अच्छी तरह से क्षेत्र की स्थापनाके तहत, एक अच्छी तरह से छवि के भीतर साइटों की संख्या का चयन करें ।
        नोट: 12 साइटें एक पूर्ण-अच्छी छवि के अनुरूप हैं ।
      5. छवि प्राप्ति सेटिंग्सके अंतर्गत, संचार लाइट, ५४१ (GFP), और ७१३ (PI) के लिए एक्सपोज़र समय का चयन करें । GFP के लिए, छवि 20 ms की एक जोखिम समय के साथ पूरी तरह से चित्र/ संचारित प्रकाश (TL) और PI प्रतिदीप्ति के लिए, क्रमशः 8 और 20 ms के जोखिम समय के साथ प्रत्येक के केंद्र की एक छवि प्राप्त ।
      6. सही करने के लिए सेटिंग्स जानकारी में निर्दिष्ट सेटिंग्स की पुष्टि करें और ठीकचुनें । इमेजिंग के लिए अधिग्रहण समय एक अच्छी तरह से की पूरी सतह (12 छवियों/एक ९६ के लिए अच्छी तरह से प्लेट और एक तरंग दैर्ध्य के लिए है ~ 15 min. इमेजिंग प्रारंभ करने के लिए पढ़ें दबाएं ।
        नोट: एक ही छवि के अधिग्रहण समय/९६-अच्छी तरह से थाली की आवश्यकता है ~ २.५ मिनट एक तरंग दैर्ध्य के लिए/ ऊपर वर्णित मापदंडों हमारी प्रयोगशाला में विशिष्ट उपकरणों के अनुरूप है । Spectrofluorometric माप: एक क्सीनन फ़्लैश लैंप प्रदर्शित १.० एनएम वेतन वृद्धि उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (250-850 एनएम) एक समायोज्य 9 या 15 एनएम bandpass के साथ, एक > 6 लॉग गतिशील रेंज और एक समायोज्य 15 या 25 एनएम उत्सर्जन के साथ एक photomultiplier ट्यूब डिटेक्टर bandpass. इमेजिंग cytometer: एक रोशनी प्रकाश स्रोत सफेद प्रकाश, ४६० एनएम और ६२५ एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक 20 एनएम bandpass के लिए सक्षम, उत्सर्जन फ़िल्टर ५४१ एनएम (१०८ एनएम bandpass) और ७१३ एनएम (१२३ एनएम bandpass), क्रमशः, और एक 4x के लिए युग्मित उद्देश्य के साथ एक १.२५ मेगापिक्सेल 12-बिट चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा ।

2. परख

नोट: परख के समय, कोशिकाओं 70-90% धाराप्रवाह होना चाहिए । धो चरणों के दौरान, मध्यम से हटा दिया जाना चाहिए और अच्छी तरह से (नहीं सीधे कोशिकाओं के ऊपर) की ओर दीवार के लिए लागू किया । < 4 ˚ सी पर LLO के तापमान को बनाए रखने के लिए कदम 3.1.5 जब तक इसके एकत्रीकरण को रोकने के लिए ।

  1. M1 में 30 µ एम पीआई का स्टॉक तैयार करें और M2 में 30 µ मीटर पीआई का शेयर ३७ ˚ सी में प्री-वार्म ।
  2. धीरे प्लेट 1 में एक 12-मल्टीचैनल micropipette और २०० µ l सुझावों का उपयोग कर, इस प्रकार के रूप में कोशिकाओं धो:
    1. सुधार-स्वतंत्र स्थितियों के लिए, वृद्धि मध्यम निकालें और २०० µ l/well M1 के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने ३७ ˚ सी पर पूर्व गर्म । 30 µ एम PI युक्त गर्म एम 1 के साथ १०० µ एल के साथ मध्यम बदलें ।
    2. मरंमत प्रतिबंधात्मक शर्तों के लिए, वृद्धि मध्यम निकालें और २०० µ एल के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने/अच्छी तरह से गर्म 5 मिमी EGTA युक्त chelate Ca के लिए2 +, २०० µ एल के साथ एक धोने के बाद/ १०० µ एल के साथ मध्यम बदलें/अच्छी तरह से गर्म M2 युक्त 30 µ एम PI ।
    3. के बाद वृद्धि मध्यम धोया गया है और propidium आयोडाइड युक्त मध्यम के साथ प्रतिस्थापित, सीधे कदम 2.1.3 के लिए कदम ।
  3. 1.3.3 (पूर्व काइनेटिक) के तहत विस्तृत रूप में संचारित प्रकाश, GFP, और PI के अंतर्गत छवि प्लेट 1 । यह चरण 15-20 min लेता है ।
  4. चरण 2.1.3 में 15 मिनट की अवधि के दौरान, प्लेट 2 एक 12-मल्टीचैनल micropipette और २०० µ l सुझावों का उपयोग कर निम्नानुसार तैयार करें:
    1. बर्फ पर एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे microplate प्लेस । एक प्रयोगात्मक 1 प्लेट (1 चित्रा) के लिए इसी डिजाइन का उपयोग कर थाली विन्यस्त करें ।
    2. सुधार-स्वतंत्र स्थितियों के लिए, जोड़ें १०० µ l/६० युक्त आइस-कोल्ड m1 के µ एम PI, के अलावा द्वारा पीछा १०० µ l/अच्छी तरह से बर्फ ठंडा m1 4x LLO युक्त या नियंत्रण के लिए नहीं ।
    3. मरंमत-प्रतिबंधात्मक शर्तों के लिए, जोड़ें १०० µ एल के साथ बर्फ ठंडा m2 के ६० µ एम PI, १०० µ एल के अलावा के द्वारा पीछा/बर्फ ठंडा m2 के 4x LLO युक्त या नियंत्रण के लिए नहीं ।
  5. इमेजिंग प्लेट 1 (कदम 2.1.3) के बाद, तुरंत बर्फ पर जगह, एल्यूमीनियम पंनी का उपयोग करने के लिए बर्फ के साथ सीधे संपर्क से प्लेट अलग । प्लेट 1 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें ।
  6. एक 12-मल्टीचैनल micropipette और २०० µ l टिप्स का उपयोग कर, प्लेट 2 (स्टेप 2.1.4) में प्रत्येक अच्छी तरह से १०० µ एल स्थानांतरण 1 प्लेट में इसी कुएँ को. ठीक से प्लेट 1 के मीडिया में विष वितरित करने के लिए, meniscus नीचे युक्तियां डालें और धीरे बुलबुले शुरू करने के बिना मात्रा बेदखल ।
    नोट: पिपेट ऊपर और नीचे नहीं है, के रूप में यह अनजाने में कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं ।
  7. एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए थाली छोड़ने के लिए विष की कोशिकाओं को बांध और तुरंत काइनेटिक परख के लिए प्लेट रीडर को spectrofluorometer मोड (चरण 1.3.2) का उपयोग कर प्लेट 1 हस्तांतरण की अनुमति है ।
  8. काइनेटिक परख के अंत में, तुरंत छवि 1 प्लेट (पोस्ट-काइनेटिक) कदम 1.3.3 का उपयोग कर ।

3. विश्लेषण: सेल गणन

  1. microplate प्रकोष्ठ गणन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए नाभिकीय प्रतिदीप्ति के आधार पर कक्ष गणना निर्धारित करें ।
    1. सेटिंग्स के भीतर, फिर से विश्लेषणका चयन करें, और छवि विश्लेषण सेटिंग्स के भीतर श्रेणी अनुभाग के तहत का चयन विचारशील वस्तु विश्लेषण वस्तुओं को खोजने के लिए तरंग दैर्ध्य के रूप में ५४१ का उपयोग ।
    2. ऑब्जेक्ट ढूंढें विकल्प के भीतर, विधि ढूंढने वाली छवियां पर आरेखित करें का उपयोग करके, सेटिंग्स टैब के अंतर्गत नाभिक चुनें, और लागूकरें दबाएं ।
    3. प्रेस ठीक है और कक्ष गिनती एल्गोरिथ्म आरंभ करने के लिए पढ़ें ।
  2. वैकल्पिक रूप से, यदि ऐसा कोई उपकरण उपलब्ध नहीं है, तो कक्षों की गणना करने के लिए ImageJ जैसे छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
    1. ImageJ में, छवि फ़ाइल को किसी स्टैक के रूप में खोलें ।
    2. मेनू पट्टी में छवि क्लिक करके स्टैक को 8-बिट greyscale छवियों में कनवर्ट करें, इस प्रकार पर होवर करें, और 8-बिटचुनें ।
    3. पृष्ठभूमि घटाना: मेनू पट्टी में छवि पर क्लिक करें, समायोजितपर जाएं, और चमक/कंट्रास्टका चयन करें । पृष्ठभूमि शोर को निकालने के लिए न्यूनतम मान समायोजित करें और लागूकरेंका चयन करे ।
    4. बाइनरी छवियाँ बनाने के लिए थ्रेशोल्ड: मेनू पट्टी में छवि पर क्लिक करें, समायोजितपर हॉवर करें और थ्रेशोल्डचुनें. अंधेरे पृष्ठभूमिका चयन करें, न्यूनतम और अधिकतम थ्रेशोल्ड मान समायोजित करें, और लागूकरेंक्लिक ।
    5. अतिव्यापी नाभिक के मामले में, एक वाटरशेड उपकरण नाभिक खंड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मेनू में प्रक्रिया पर क्लिक करें, बाइनरी पर जाएं और वाटरशेडचुनें ।
      नोट: यह स्वचालित रूप से कनेक्ट नाभिक अलग होगा ।
    6. नाभिक की पहचान को परिष्कृत करने और सेल मलबे को बाहर करने के लिए उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट मानदंड (आकार और परिपत्र) लागू करके नकाबपोश छवियों का विश्लेषण ।
      1. मेनू में विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर कणों का विश्लेषण. इच्छित आकार सेट करें (पिक्सेल ^ 2) और प्रचलन (1 का मान एक परिपूर्ण वृत्त है) श्रेणियां जो व्यक्तिगत कक्षों/नाभिक को शामिल करने के लिए पर्याप्त हैं ।
      2. ड्रॉपडाउन दिखाएं बॉक्स में, इच्छित विकल्प का चयन करें, सारांशदेखें, और कक्ष संख्याएं प्राप्त करने के लिए ठीक क्लिक करें ।

4. विश्लेषण: काइनेटिक घटता

  1. प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से काइनेटिक डेटा एक विश्लेषणात्मक डेटा सॉफ्टवेयर के लिए स्थानांतरण ।
  2. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, प्रत्येक timepoint पर प्रतिकृति के प्रतिदीप्ति तीव्रता औसत के साथ संगत मानक विचलन और प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए मतलब की मानक त्रुटि के साथ.
  3. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, इसी काइनेटिक वक्र ट्रेस: PI तीव्रता (y-अक्ष) बनाम समय (x-अक्ष).
  4. किसी दी गई उपचार स्थिति की प्रतिसील दक्षता की गणना करने के लिए, वक्र (ईमेज) के अंतर्गत क्षेत्र की गणना + LLO में m1 (ईमेज (M1)) और + LLO में m2 (ईमेज (m2)) । नीचे दिए गए दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए दक्षता (ई) के पुनर्सील का आकलन:
    Equation
  5. नीचे दर्शाई गई दक्षता अनुपात (REff) का निर्धारण करके नियंत्रण और परीक्षण उपचार के बीच तुलना निष्पादित करें:
    Equation 2
    REFF = 1, परीक्षण उपचार की मरंमत पर कोई प्रभाव नहीं है
    REFF < 1, परीक्षण उपचार मरंमत रोकता है
    REFF > 1, परीक्षण उपचार सुधार को बेहतर बनाता है
  6. निम्न समीकरण का उपयोग करके वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की गणना करें:
    Equation 3, जहां k अनुवर्ती अप की कुल संख्या है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सेल सटीकता की गिनती: हेला कोशिकाओं अक्सर एक मॉडल स्तनधारी कोशिका लाइन के रूप में उपयोग किया जाता है झिल्ली की मरंमत तंत्र का पता लगाने । जब कोशिका जनसंख्या के स्तर पर झिल्ली की मरंमत का आकलन, यह उचित डेटा व्याख्या के लिए सभी कुओं में एक ही एकाग्रता में प्लेट कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी परख है कि कक्ष संख्या कुओं के बराबर है के समय पर सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हेला कोशिकाओं है कि constitutively एक्सप्रेस हिस्टोन बी GFP से जुड़े (H2B-GFP) इस परख में पेश करने के लिए स्वचालित रूप से अपने फ्लोरोसेंट नाभिक का पता लगाने पर आधारित कोशिकाओं की गणना कर रहे थे । सेल गणन में सटीकता स्थापित करने के लिए, हेला H2B-GFP कोशिकाओं के दोहरा धारावाहिक कमजोर पड़ने तपसिल में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया गया और 4 एच के लिए संस्कृति । समय की यह राशि सेल लगाव के लिए पर्याप्त है और सीमित सेल प्रभाग प्रदान करता है । पूर्ण कुओं (TL) और GFP प्रतिदीप्ति रोशनी और सेल काउंट्स के तहत imaged थे GFP प्लेट रीडर विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 2a और बी) का उपयोग प्रतिदीप्ति के आधार पर मूल्यांकन किया गया । औसत सेल काउंट्स ± मानक विचलन कोशिका बोने की सांद्रता के खिलाफ साजिश रची थी, और सबसे अच्छा फिट की एक पंक्ति एक 1.08: सेल बीज के लिए कोशिका गिनती के 1 अनुपात संकेत दिया, गिनती की सटीकता का प्रदर्शन (चित्रा 2c). इमेजिंग द्वारा एक काइनेटिक परख करने से पहले कुओं के सभी, यह सुनिश्चित किया जा सकता है कि कोशिका संख्या सभी कुओं के बीच संगत कर रहे हैं । इसके अलावा, इमेजिंग कुओं द्वारा काइनेटिक परख के बाद, एक स्थापित कर सकते है अगर विष को जोखिम कोशिका टुकड़ी के कारण ।

GFP की अभिव्यक्ति propidium आयोडाइड (pi) तीव्रता मापन (ipi) के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है: यह सुनिश्चित करने के लिए कि H2B-GFP नाभिकीय संबद्धता pi के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है या pi प्रतिदीप्ति तीव्रता माप (ipi), मैंpi हेला और हेला H2B-GFP कोशिकाओं है कि सामने आ रहे थे, या नहीं, 1 एनएम LLO (चित्रा 3) में तुलना में था । pi के अभाव में, हेला और हेला H2B-GFP में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का एक समान निम्न स्तर था, यह दर्शाता है कि GFP पीआई प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से खून नहीं करता है । pi की उपस्थिति में, लेकिन LLO के अभाव, दोनों हेला और हेला H2B-GFP में एक समान बेसल PI प्रतिदीप्ति उत्सर्जन था कि समय के साथ बदल नहीं किया । यह पुष्टि की कि GFP की अभिव्यक्ति pi प्रतिदीप्ति की माप को प्रभावित नहीं करता है और संकेत दिया कि pi प्रयोग की समय सीमा पर गैर-क्षतिग्रस्त कक्षों घुसना नहीं है । LLO के अलावा PI प्रतिदीप्ति में वृद्धि के परिणामस्वरूप समय है कि दोनों हेला और हेला H2B-GFP में समान था के साथ । इस वृद्धि न्यूक्लिक एसिड के साथ पीआई एसोसिएशन के साथ संयुक्त LLO द्वारा घायल सेल के कारण है । एक साथ, इन परिणामों हिस्टोन की अभिव्यक्ति की स्थापना-बी-GFP PI या इसके प्रतिदीप्ति का माप शामिल नहीं प्रभावित करता है ।

pi प्रतिदीप्ति GFP-आधारित कक्ष गणना के साथ हस्तक्षेप नहीं: पारस्परिक रूप से, यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण था कि पीआई परमाणु शामिल घायल कोशिकाओं में GFP-आधारित सेल गिनती के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों के हेला और हेला H2B-GFP उजागर 1 एनएम LLO की उपस्थिति में pi दिखाया गया है कि घायल कोशिकाओं में pi के एक चिह्नित संचय पोस्ट कैनेटीक्स, के रूप में की उंमीद (4a) । इमेजिंग भी पता चला कि PI GFP प्रतिदीप्ति डिटेक्शन (चित्रा 4a और 1 तालिका) के माध्यम से खून बह सकता है । इस प्रतिदीप्ति अंतरराष्ट्रीय सबसे अच्छा के बाद हेला कोशिकाओं है कि GFP व्यक्त नहीं की काइनेटिक छवियों पर सराहना की थी, लेकिन अभी भी हरी फ्लोरोसेंट नाभिक (4a आंकड़ा) प्रदर्शित । यह क्रॉसओवर भी हेला H2B-GFP कोशिकाओं में GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता (IGFP) की माप द्वारा सबूत हो सकता है, जो पूर्व काइनेटिक (चित्रा 4B) की तुलना में काफी वृद्धि हुई पोस्ट-काइनेटिक । महत्वपूर्ण रूप से, PI प्रतिदीप्ति क्रॉसओवर सेल गणना को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि नाभिक के गणन में शामिल फॉल्ट प्रक्रिया GFP प्रतिदीप्ति (figure 4c) में वृद्धि से अप्रभावित है ।

प्लाज्मा को सील करने की क्षमता को मापने दक्षता: इस खंड में, हम मूल कार्यप्रणाली को सील झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए इस्तेमाल किया । सबूत के लिए झिल्ली को सील करने की प्रक्रिया, हेला H2B-GFP कोशिकाओं को उजागर किया गया है, या नहीं, 1 एनएम LLO में उपस्थिति (M1) या अनुपस्थिति (M2) के extracellular Ca2 + (चित्रा 5) । के रूप में की उंमीद है, LLO के अभाव में, मैंPI M1 और M2 में लगातार बने रहे । इसके अलावा ca में LLO के2 +-युक्त मध्यम pi प्रतिदीप्ति तीव्रता (मैंpi) में एक स्थिर वृद्धि में हुई, जबकि extracellular Ca के अभाव में2 +, pi प्रतिदीप्ति में एक काफी तेजी से वृद्धि हुई थी, को प्रतिबिंबित झिल्ली के अभाव को फिर से सील । पुनर्सीलिंग दक्षता, जो m2 के सापेक्ष m1 (चरण 1.5.4.1) में सुधार करने के लिए कक्षों की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है का आकलन करने के लिए, m1 और m2 curves (ईमेज) के अंतर्गत क्षेत्र निर्धारित किए गए थे और सुधार की दक्षता (E) ०.२८७ होने के लिए परिकलित किया गया था ।

pi के लिए एक विकल्प: pi बैरे प्लाज्मा झिल्ली क्षति के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, वहां अंय न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी रंजक है कि इस परख के लिए भी उपयुक्त हैं । उदाहरण के लिए, एक झिल्ली impermeant carbocyanine न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई (CNABD) एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम सुदूर लाल में पहुंच प्रदर्शित और डबल असहाय डीएनए के लिए एक उच्च विशिष्टता है । दूसरी ओर PI दोनों डीएनए और आरएनए४०,४१बांधती है । PI के विपरीत, उत्तेजना और CNABD के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दो fluorochromes के बीच बेहतर वर्णक्रमीय संकल्प के लिए अनुमति GFP के उन लोगों के साथ ओवरलैप नहीं करता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया CNABD एक विलुप्त होने गुणांक लगभग दो बार है कि pi की, जिसका अर्थ है कि उनके संबंधित उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए, इस डाई एक मजबूत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप pi से ऊर्जा को अवशोषित करने में अधिक सक्षम है । CNABD और GFP छवियों के मात्रात्मक प्रतिदीप्ति विश्लेषण से पता चला कि इस डाई एक बड़ी प्रतिदीप्ति गतिशील रेंज प्रदर्शित करता है, GFP प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य में काफी उत्सर्जन नहीं है, और सेल गिनती (चित्रा 6A-डी) को प्रभावित नहीं करता है । दरअसल, हेला H2B-GFP कोशिकाओं M1 या M2 मीडिया में CNABD युक्त और 1 एनएम LLO द्वारा क्षतिग्रस्त एक 4-और ५.५-मैं गैर क्षतिग्रस्त नियंत्रण के सापेक्षCNABD में गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया, क्रमशः (चित्रा 7A) । तुलना के लिए, pi की उपस्थिति में 1 एनएम LLO उजागर कोशिकाओं M1 और M2 में pi प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक २.५-और 3 गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया, क्रमशः (चित्रा 5) । PI की तरह, CNABD (चित्रा 7A) M1 में LLO एकाग्रता में वृद्धि के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाने दर्शाती है, और परिणामी मरंमत दक्षता चरण 1.5.4.1 (चित्रा 7B) में वर्णित के रूप में गणना की गई । हम रिपोर्ट करते हैं कि कोशिका को सील करने की दक्षता LLO एकाग्रता के रूप में बढ़ जाती है. इस घटना तथ्य यह है कि कोशिकाओं को अपनी क्षमता को कम करने के लिए जब अत्यधिक नुकसान का कारण रहे है सील को दर्शाता है ।

झिल्ली की मरंमत परख के गुणवत्ता मूल्यांकन: किसी भी परख का एक महत्वपूर्ण पहलू अपनी मजबूती या क्षमता का पता लगाने और नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के बीच मतभेदों को हल है । धनात्मक और ऋणात्मक नियंत्रणों के बीच संकेत भिंनता को पर्याप्त डायनेमिक श्रेणी और reproducibility प्रदर्शित करना आवश्यक है । इस झिल्ली की मरंमत परख में, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को मरंमत में LLO से अवगत कराया-स्वतंत्र (M1) और मरंमत-प्रतिबंधात्मक (M2) शर्तों, क्रमशः । दो दृष्टिकोण उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए इस परख की मजबूती का आकलन करने के लिए ले जाया गया । सबसे पहले, Z-कारक, या स्क्रीनिंग विंडो गुणांक, निर्धारित करता है कि स्थितियों का एक दिया सेट एक बड़ी पर्याप्त गतिशील रेंज उपलब्ध कराता है, जबकि संकेत परिवर्तनशीलता के लिए लेखांकन । z-0 श्रेणियों के भीतर कारक < z ≤ ०.५ और ०.५ < z ≤ 1 एक स्वीकार्य और बहुत अच्छी परख के अनुरूप, क्रमशः४२,४३। गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए Z-कारक का उपयोग करने की एक सीमा है कि परीक्षण किया स्थितियों आम तौर पर अत्यधिक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में अधिक उदारवादी मूल्यों का प्रदर्शन । इसलिए, एक दूसरे दृष्टिकोण के रूप में, हम कड़ाई से मानकीकृत मतलब अंतर गणना (SSMD, β), जो प्रयोगात्मक शर्तों के बीच अंतर की पहचान कर सकते हैं कि अन्यथा एक योग्य Z-फैक्टर ४४ के आधार पर एक नकारात्मक परिणाम के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा ,४५. SSMD मूल्यों प्रभाव कोई प्रभाव से लेकर शक्ति में वर्गीकृत किया जा सकता (β = 0) अत्यंत मजबूत करने के लिए (β ≥ 5). M1 बनाम M2 शर्तों की तुलना के लिए चित्रा 7A और ईमेज से डेटा का उपयोग करना, ०.२५ और ०.५ एनएम LLO के लिए जोखिम ०.३१००८१३ और ०.१३७३१३ के Z-कारक मूल्यों का उत्पादन किया, और β = ६.०६७२ और ४.८०३३०८, क्रमशः, यह दर्शाता है कि LLO सांद्रता की एक खिड़की है परख के लिए उपयुक्त । के रूप में LLO की एकाग्रता 1 एनएम के पार बढ़ जाती है, मैं M1 और M2 शर्तों के बीचCNABD काइनेटिक घटता में अंतर काफी कम Z-कारक और SSMD मूल्यों (चित्रा 7B) में जिसके परिणामस्वरूप बंद हो जाता है । LLO के इस तरह के उच्च सांद्रता शर्तों के अनुरूप है जिसमें मरंमत क्षमता क्षति से अधिक है और इस प्रकार झिल्ली की मरंमत में शामिल कारकों की पहचान करने में परख के उपयोग को नकारती है । यह आगे मरंमत दक्षता में कमी (ई) के रूप में LLO एकाग्रता बढ़ जाती है (चित्रा 7B) द्वारा सचित्र है । सभी डेटा (Z-कारक, SSMD, और ई) 3 जैविक प्रतिकृतियां और 3 तकनीकी परख सत्यापन के लिए प्रायोगिक शर्त प्रति दोहराने के साथ उत्पंन किया गया । एक साथ, इन आंकड़ों से पता चलता है कि इस परख एक उच्च LLO सांद्रता हेला कोशिकाओं के लिए 1 एनएम के लिए अवर एकाग्रता के साथ प्रवाह परख के लिए मजबूती की उंमीद है ।

सिद्धांत का सबूत: एक बार परख की मजबूती की स्थापना की थी, हम सिद्धांत का सबूत है कि इस परख संवेदनशीलता और समाधान के लिए मरंमत की प्रक्रिया में एक दोष की पहचान है के रूप में अतिरिक्त प्रयोग किया । इसके अलावा, हम मानते है कि उच्च प्रवाह परख एक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के रूप में इस्तेमाल के लिए बड़ी स्क्रीन के भीतर "हिट" की पहचान कर रहे हैं, जो कम से 3 जैविक दोहराने शामिल हो सकते हैं । इस प्रकार, यह उचित है कि प्रयोगात्मक डिजाइन का पता लगाने के लिए एक एकल परख के भीतर "हिट" की पहचान करने की शक्ति प्रदान करता है । इसलिए, एक उच्च प्रवाह स्क्रीन के तहत, परख लेआउट समायोजित किया जा सकता है 4 तकनीकी को समायोजित करने के लिए एक ही प्रयोग में सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि दोहराने । कोशिकाओं quadruplicate में चढ़ाया और पूर्व थे 1 एच इलाज desipramine, lysosomal प्रोटीन एसिड sphingomyelinase (एएसएम) जो प्लाज्मा झिल्ली मरंमत15,17 में एक भूमिका निभाता है की एक औषधीय अवरोधक के साथ परख से पहले ,४६. महत्वपूर्ण बात, desipramine के साथ उपचार परख भर में कोशिका गिनती को प्रभावित नहीं किया, desipramine के बीच उचित तुलना के लिए अनुमति-इलाज और गैर कोशिकाओं का इलाज (चित्रा 8A) । desipramine में एएसएम के निषेध-इलाज कोशिकाओं LLO के लिए जोखिम पर दक्षता resealing, के रूप में ई में कमी और आरEff (चित्रा 8B और 8C) द्वारा सचित्र झिल्ली में एक दोष के परिणामस्वरूप । एक मिश्रित प्रभाव मॉडल का उपयोग करना, desipramine-इलाज करने के लिए गैर-इलाज कोशिकाओं के संपर्क में ०.२५ और ०.५ एनएम LLO में M1 दिखाया p-मान ०.००१० और 1 x 10-10, क्रमशः । एक साथ, डेटा संकेत मिलता है कि ०.२५ और ०.५ एनएम LLO एक उच्च प्रवाह प्रयोगात्मक सेटिंग में मरंमत में दोषों की पहचान करने के लिए उपयुक्त सांद्रता हैं, एक ही प्रयोग के संभावित सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ एक बार तकनीकी प्रतिकृति चार बढ़ जाती है . ध्यान दें कि quadruplicate के बीच मिश्रित प्रभाव मॉडल के सांख्यिकीय दृष्टिकोण एकाधिक जैविक प्रतिकृति में संभावित विविधताओं के लिए खाता नहीं होगा । किसी भी महत्वपूर्ण निष्कर्षों का उपयोग कर एक जैविक दोहराने अतिरिक्त प्रयोगात्मक सेटिंग्स में सत्यापित किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन । प्रवाह आरेख एक प्रतिनिधि प्लेट डिजाइन गैर इलाज कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में सात परीक्षण की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया दर्शाया गया है. अतिरिक्त नियंत्रण यदि उपयुक्त हो, उदाहरण के लिए दवा वाहनों के रूप में शामिल किया जाना चाहिए । कोशिकाओं (प्लेट 1) 24 एच प्रयोग करने से पहले चढ़ाया जाता है । प्रयोग के दिन, प्लेट 1 में कोशिकाओं M1 या M2 मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म के साथ धोया जाता है, और प्लेट (TL, GFP और PI प्रतिदीप्ति) पूर्व काइनेटिक imaged है । इमेजिंग के 15 मिनट के दौरान, रिएजेंट बर्फ पर 2 थाली को जोड़ रहे हैं । इमेजिंग के बाद, 1 प्लेट तुरंत 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया है, और १०० μL/ प्लेट 1 प्लेट रीडर में 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर काइनेटिक परख चलाने के लिए रखा है, इमेजिंग द्वारा पीछा किया (TL, GFP, और PI प्रतिदीप्ति) । डेटा तो कोशिकाओं की गणना और सभी प्रयोगात्मक स्थितियों में मरंमत दक्षता का आकलन करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । बड़े डेटा सेट्स में, विश्लेषण स्वचालित हो सकता है. साथ ही, तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या 4 के लिए उच्च-प्रवाह स्क्रीन में increased किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल सटीकता गिनती । हेला कोशिकाओं GFP व्यक्त-टैग हिस्टोन बी b संकेत सांद्रता पर triplicates में वरीयता प्राप्त थे । (a) कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर संचरित प्रकाश (TL) और GFP प्रतिदीप्ति (12 छवियों/अच्छी तरह से) और एक सेल का पता लगाने एल्गोरिथ्म चित्रित व्यक्तिगत नाभिक (बैंगनी में) के लिए इस्तेमाल किया गया था के तहत imaged थे । स्केल बार = 1 mm. (B) TL, GFP, और सेल डिटेक्शन (पर्पल) इमेजेस (ज़ूम्ड 2x) का उच्च आवर्धन । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (ग) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और सेल गिनती प्रारंभिक कोशिका बोने की एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची गई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Propidium आयोडाइड प्रतिदीप्ति माप हिस्टोन 2 बी-GFP अभिव्यक्ति से प्रभावित नहीं है. हिस्टोन बी 2-GFP व्यक्त और गैर व्यक्त हेला कोशिकाओं को उजागर किया गया, या नहीं, उपस्थिति (ठोस लाइनों) में 1 एनएम LLO करने के लिए या अनुपस्थिति (डैश्ड लाइनें) में 30 माइक्रोन PI के Ca1 +-मध्यम (M1) । काइनेटिक परख ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हर 5 मिनट spectrofluorometry द्वारा PI प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा । डेटा औसत pi प्रतिदीप्ति तीव्रता (मैंPI) रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ± SEM (n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों, प्रत्येक triplicates में प्रदर्शन) में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: PI प्रतिदीप्ति द्वारा कक्ष गणन अप्रभावित है । (A) प्रतिनिधि पूर्व और पोस्ट-काइनेटिक छवियां (TL, PI, और GFP) की कोशिकाओं को उजागर, या नहीं, M1 में 1 एनएम LLO करने के लिए । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (ख) मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण (मैंGFP± SEM) LLO द्वारा घायल सेल पर PI परमाणु निगमन के कारण वृद्धि हुई GFP प्रतिदीप्ति माप से पता चला (पोस्ट-काइनेटिक) । (C) GFP-आधारित कक्ष गणन GFP तीव्रता में वृद्धि से अप्रभावित रहा । सेल गणना अच्छी तरह से औसत ± SEM के रूप में व्यक्त किया गया था । (बी और सी में: काली सलाखों = पूर्व काइनेटिक डेटा; लाल सलाखों के बाद = काइनेटिक डेटा; n = 3 स्वतंत्र प्रयोग, प्रत्येक triplicates में प्रदर्शन; एक दो पूंछ छात्र टी परीक्षण के लिए मात्रात्मक प्रतिदीप्ति विश्लेषण किया गया अधिग्रहीत छवियों से तीव्रता और सेल मायने रखता है, * * p < ०.०१). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्लाज्मा को सील करने की क्षमता को मापने । हिस्टोन 2 बी-GFP व्यक्त हेला कोशिकाओं को उजागर किया गया है, या नहीं, 1 एनएम LLO में करने के लिए 3+-युक्त (M1) या ca2 +-मुक्त (M2) मध्यम 30 माइक्रोन PI युक्त । काइनेटिक डेटा ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मापा, रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ± SEM में pi प्रतिदीप्ति तीव्रता (मैंPI) का प्रतिनिधित्व करते हैं । n = 3 स्वतंत्र प्रयोग, प्रत्येक triplicates में प्रदर्शन किया । resealing दक्षता प्रोटोकॉल चरण 1.5.4 में इंगित किया गया के रूप में मापा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक वैकल्पिक डाई के रूप में Carbocyanine न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई झिल्ली resealing का आकलन करने के लिए । हेला H2B-GFP कोशिकाओं को उजागर किया गया, या नहीं, ०.५ एनएम LLO 30 मिनट के लिए ३७ ° c में 1 माइक्रोन CNABD की उपस्थिति में ca2 +-युक्त (M1) या ca2 +-मुक्त (M2) मध्यम । (क) हेला H2B-GFP कोशिकाओं की छवियां पूर्व और बाद में डाई युक्त M1 में काइनेटिक का अधिग्रहण किया गया । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (ख और ग) एकीकृत CNABD और GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग cytometer का उपयोग कर मापा और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ± SEM में व्यक्त किया गया । (घ) GFP प्रतिदीप्ति छवियों को हेला H2B-GFP की गणना करने के लिए संसाधित किया गया कोशिकाओं (काली सलाखों = पूर्व काइनेटिक डेटा, लाल सलाखों के बाद = काइनेटिक डेटा, n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों, प्रत्येक triplicates में प्रदर्शन किया) । एक दो पूंछ छात्र टी परीक्षण के लिए मात्रात्मक प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण और अधिग्रहीत छवियों से सेल मायने रखता था, * * पी < ०.०१, * * * p < ०.००१) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए किया गया ।

Figure 7
चित्र 7: LLO एकाग्रता का प्रभाव दक्षता, जेड-फैक्टर, और SSMD को फिर से सील करने पर । (क) हेला H2B-GFP कोशिकाओं M1 में मशीन या 1 माइक्रोन CNABD युक्त M2 LLO की सांद्रता बढ़ाने के लिए सामने आ रहे थे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए काइनेटिक परख के अधीन । डाटा CNABD तीव्रता के रूप में व्यक्त कर रहे है (मैंCNABD) सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ± SEM । (ख) Z-कारक और कड़ाई से मानकीकृत माध्य अंतर (SSMD) झिल्ली की मरंमत की मजबूती के लिए एक गुणवत्ता के आकलन के रूप में गणना की गई परख, वक्र के तहत क्षेत्र का उपयोग (ईमेज) काइनेटिक curves४२,४३,४४,४५के लिए एक मीट्रिक के रूप में । पुनर्सीलिंग क्षमता प्रोटोकॉल और परिणाम वर्गों में वर्णित के रूप में गणना की गई (n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों, प्रत्येक triplicates में प्रदर्शन किया) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: desipramine के लिए सेल एक्सपोजर resealing में दोषों का कारण बनता है । हेला H2B-GFP कोशिकाओं (quadruplicate में चढ़ाया) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 30 माइक्रोन desipramine (या नहीं) के साथ पूर्व इलाज किया गया और फिर ०.२५ को उजागर या ca 2+-युक्त (M1) या ca2 +-मुक्त (M2) मध्यम में 1 माइक्रोन CNABD की उपस्थिति में ०.५ एनएम LLO । कोशिकाओं (पूर्व और पोस्ट-काइनेटिक) और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर काइनेटिक परख के अधीन थे (एक) कोशिकाओं को गणना की गई; डेटा औसत कोशिका गिनती ± sem के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । (ख) CNABD प्रतिदीप्ति तीव्रता (ICNABD) के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ± sem में व्यक्त किया जाता है । (ग) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में पुनर्सील करने की क्षमता की गणना की गई desipramine । एक मिश्रित प्रभाव मॉडल पर इस्तेमाल किया गया था लॉग-बदल तीव्रता प्रत्येक तकनीकी दोहराने के लिए एक यादृच्छिक अवरोधन मान मान । दोनों को पकड़ने के लिए एक बदलाव और काइनेटिक घटता के आकार में परिवर्तन, उपचार हालत और उपचार की स्थिति और समय के बीच बातचीत के प्रभाव का मुख्य प्रभाव संयुक्त रूप से सांख्यिकीय महत्व के लिए परीक्षण किया गया । एक दो पूंछ छात्र टी परीक्षण के लिए अधिग्रहीत छवियों से सेल गिनती का विश्लेषण किया गया था । p-मान मिश्रित प्रभाव मॉडल का उपयोग कर परिकलित किया गया था । (4 तकनीकी प्रतिकृति, एक प्रयोग) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इमेजिंग Cytometer उत्सर्जन चैनल निर्दिष्टीकरण
Fluorophore Fluorophore पूर्व/ ग्रीन चैनल (पूर्व/em ± bandpass, एनएम) लाल चैनल (पूर्व/em ± bandpass, एनएम)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
Pi 533/617
CNABD 642/661

तालिका 1: GFP, PI, और CNABD उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों और इमेजिंग bandpasses के लिए हरे और लाल चैनल उत्तेजना और उत्सर्जन cytometer ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह परख उच्च प्रवाह क्षमता के साथ कोशिका जनसंख्या के स्तर पर फिर से सील झिल्ली की दक्षता उपाय । यह सेलुलर घटकों या झिल्ली की मरंमत को प्रभावित कर सकता है कि दवा पुस्तकालयों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्णित परख एक ९६-अच्छी तरह प्लेट प्रारूप का इस्तेमाल किया, लेकिन यह ३८४ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-अच्छी तरह से उच्च प्रवाह के लिए प्लेटें । इस परख का एक लाभ अपने सेल टुकड़ी, निर्धारण, या प्रतिदीप्ति लेबल पद निर्धारण के रूप में अत्यधिक सेल प्रोसेसिंग के लिए की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में अनुयाई रहने वाले कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माप प्राप्त करने की क्षमता है । बहुपद्वति प्लेट पाठकों, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एक के रूप में, एक ९६-well थाली के लिए के रूप में कम के रूप में 30 एस समय अंतराल पर तेजी से spectrofluorometric माप के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता है । प्रतिदीप्ति छवियों का अधिग्रहण सेल गणन, कक्ष आकृति विज्ञान में अंतिम परिवर्तन, और विशिष्ट कोशिका आबादी की संभावित पहचान सहित अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है । वर्तमान परख कैनेटीक्स प्लाज्मा झिल्ली के एक सेल स्तर पर फिर से सील स्थापित नहीं करता है, लेकिन प्रयोगात्मक स्थितियों (औषधीय यौगिकों या सेलुलर घटकों) है कि प्रभावित कर सकते है की पहचान, सकारात्मक या नकारात्मक, की प्रक्रिया कोशिका जनसंख्या के स्तर पर फिर से सील झिल्ली ।

कई अंय प्रायोगिक दृष्टिकोण के लिए झिल्ली सील तंत्र का आकलन विकसित किया गया है । उदाहरण के लिए, microneedle पंचर, मनका घर्षण, और लेजर पृथक द्वारा यांत्रिक व्यवधान मॉडल यांत्रिक झिल्ली क्षति के लिए इस्तेमाल किया गया है । मरंमत/घाव की माप फ्लोरोसेंट जांच (एफएम 1-43, propidium आयोडाइड, fluorescein-संयुग्मित dextrans) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन chimeras४७ ट्रैकिंग की प्रविष्टि को बढ़ाता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry शामिल है ,४८,४९,५०. इन तरीकों में से प्रत्येक अपने फायदे हैं; हालांकि, वे इस परख में प्रस्तुत के रूप में रहने वाले कोशिकाओं में उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदाई नहीं हैं ।

वर्तमान परख के लिए ताकना-बनाने प्रोटीन LLO, जो बड़े रूपों कि विशाल Ca2 + आमद की अनुमति के रूप में प्लाज्मा झिल्ली के यांत्रिक टूटना से भड़का द्वारा घायल कोशिकाओं के resealing दक्षता का विश्लेषण अनुकूलित किया गया था । हालांकि ताकना बनाने विषाक्त पदार्थों प्लाज्मा झिल्ली क्षति के एक फार्म का प्रतिनिधित्व करते हैं, बड़े विष की मरंमत pores और यांत्रिक घावों साझा करने के लिए प्रस्तावित थे आम Ca2 +-निर्भर रास्ते17,५१। यह ध्यान रखें कि कोशिका झिल्ली घटकों के साथ इस तरह के कोलेस्ट्रॉल के रूप में LLO बातचीत सेल सिग्नलिंग को प्रभावित कर सकता है और इस तरह जब यांत्रिक घावों की तुलना में झिल्ली resealing तंत्र को प्रभावित कर सकते है महत्वपूर्ण है । झिल्ली की मरंमत के बारे में हमारे ज्ञान अभी भी सीमित है और आगे के अध्ययन के लिए स्थापित करने के लिए आवश्यक है अगर यांत्रिक घावों के सील करने से अलग विष pores के गठन के बाद सील । LLO का उपयोग करने के कई फायदे हैं । सबसे पहले, झिल्ली क्षति की दीक्षा 4 से ३७ डिग्री सेल्सियस तापमान को बढ़ाने के द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । दूसरा, LLO के घुलनशील रूप (कोशिका झिल्ली के लिए बाध्य नहीं) तटस्थ पीएच और ३७ ° c में अचल समुच्चय, इस प्रकार साइटोटोक्सिक प्रभाव सीमित और कोशिकाओं को धोने की जरूरत abrogating. अंत में, क्षति की डिग्री विष की एकाग्रता अलग से समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, इस परख की एक सीमा ३७ और 4 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान स्विच है, जो इस तरह के vesicular परिवहन, endocytosis के रूप में मरंमत तंत्र को प्रभावित कर सकता है, और झिल्ली तरलता, अंय प्रक्रियाओं के बीच, जो५२तापमान से प्रभावित कर रहे हैं, ५३,५४. यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि किसी भी औषधीय अवरोधक परख में शामिल LLO के गठन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता pores की उपस्थिति में एक hemolysis परख प्रदर्शन (बनाम अनुपस्थिति) दवा५५। LLO गतिविधि में संभावित बैच मतभेदों के कारण, यह एक पूरे उच्च प्रवाह स्क्रीन५५के लिए काफी बड़ा है कि LLO का एक शेयर तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

हम कोशिकाओं के उपयोग के परमाणु स्थानीयकृत हिस्टोन-बी-GFP कल्पना एक्सप्रेस के रूप में एक से पहले और झिल्ली की मरंमत परख के बाद सूक्ष्म इमेजिंग द्वारा स्वचालित छवि विश्लेषण के बाद कोशिकाओं की गणना करने का मतलब के रूप में शामिल थे । महत्वपूर्ण बात, समकक्ष कोशिका शर्तों भर में गिना जाता है और अपरिवर्तित कोशिका गिनती से पहले और बाद काइनेटिक परख PI के रूप में महत्वपूर्ण है या CNABD प्रतिदीप्ति तीव्रता आसानी से सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है । वास्तव में, सेल गिनती में एक अंतर LLO की एक दी एकाग्रता द्वारा क्षति की डिग्री में अंतर में परिणाम होगा, जो प्रतिदीप्ति मानकीकरण दक्षता (चित्रा 7) में बदलाव के कारण के लिए के माध्यम से सही नहीं किया जा सकता है । हमने दिखाया है कि हिस्टोन-बी-GFP अभिव्यक्ति PI या CNABD निगमन या प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । इसके विपरीत, PI या CNABD निगमन GFP-आधारित कक्ष गणन को प्रभावित नहीं करता है । यदि fluorophores के अंय संयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, यह fluorochromes के बीच संभावित वर्णक्रमीय ओवरलैप का आकलन करने के लिए आवश्यक होगा, के रूप में इस काम में प्रदर्शन किया गया था । PI बड़े पैमाने पर झिल्ली क्षति को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है हालांकि, हम CNABD एक उत्कृष्ट विकल्प है कि उच्च प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज प्रदर्शित करता है, एक बड़ा गतिशील निस्र्पक resealing दक्षता के लिए उपयुक्त रेंज में जिसके परिणामस्वरूप है ।

Z-फैक्टर और SSMD की पुष्टि की है कि इस परख के लिए उच्च प्रवाह विश्लेषण प्रदर्शन आवश्यक मजबूती है । पुनर्सीलिंग दक्षता की गणना संभावित हिट की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण और विश्वसनीय उपकरण है । इसके अलावा, मिश्रित प्रभाव मॉडल एक सांख्यिकीय उपकरण के लिए एक एकल परख के भीतर हिट मूल्यांकन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रायोगिक योजना के तीन तकनीकी दोहराने की एक ंयूनतम शामिल करना चाहिए अगर स्क्रीन कई बार दोहराया जा सकता है । Quadruplicates उपयोग किया जाना चाहिए यदि सांख्यिकीय उपकरण, जैसे मिश्रित प्रभाव मॉडल, एक ही प्रयोग में शामिल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, या नहीं यह दोहराया जाएगा. यह सलाह दी जाती है लेकिन कई बार स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए और पूरक प्रयोगों के प्रदर्शन से परिणामों को मान्य करने के लिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ यिशै Kwiek स्वीकार करते है (ओहियो राज्य विश्वविद्यालय) के लिए कृपया हमें अपनी बहु कुछ प्रारंभिक प्रयोगों के लिए मोड का पता लगाने के मंच का उपयोग करने की अनुमति । इस लेख में बताया गया अनुसंधान स्टेफ़नी Seveau को पुरस्कार संख्या RO1AI107250 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ प्लाज्मा झिल्ली resealing झिल्ली की मरंमत मांसल dystrophy propidium आयोडाइड carbocyanine न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई ताकना-बनाने विष listeriolysin हे
स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter