Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Здесь мы описываем высокой пропускной способностью на основе флуоресценции assay, который измеряет плазматической мембраны, запечатывания эффективность через анализ флуориметрический и изображений в живых клетках. Этот assay может использоваться для скрининга наркотиков или целевых генов, которые регулируют плазматической мембраны запечатывания в mammalian клетках.

Abstract

В их физиологической среде часто подвергаются mammalian клеток механических и биохимических напряжений, которые приводят к повреждению плазматической мембраны. В ответ на эти убытки сложных молекулярных механизмов быстро запечатайте плазматической мембраны для восстановления ее барьерные функции и поддержания выживание клетки. Несмотря на 60 лет исследований в этой области мы все еще не имеют глубокое понимание ячейки запечатывания машины. С целью выявления клеточных компонентов этого управления плазматической мембраны запечатывания или препараты, которые могут улучшить запечатывания, мы разработали на основе флуоресценции высок объём assay, который измеряет плазматической мембраны, запечатывания эффективность в клетках млекопитающих культивируемых в планшет. Как модель системы для повреждения плазматической мембраны, клетки подвергаются бактериальной порами формирования токсин листериолизин O (LLO), который образует большие 30-50 Нм диаметр белковых поры в холестерин содержащих мембраны. Использование контролируемой температурой Гонав мульти-режим чтения позволяет для быстрого и чувствительной spectrofluorometric измерений в сочетании с brightfield и флуоресцентной микроскопии изображений живых клеток. Кинетический анализ интенсивности флуоресценции, испускаемых мембраны impermeant нуклеиновые кислоты привязки флюрохром отражает степень мембраны ранения и запечатывания на клеточном уровне населения, позволяя для расчета эффективности запечатывания ячейки . Флуоресцентной микроскопии изображений позволяет для перечисления клеток, которые конститутивно Экспресс флуоресцентные Химера ядерных белков гистонов 2b, в каждой скважине микропланшетов с учетом потенциальных различий в их количество и позволяет для возможного Идентификация отдельных клеточных популяций. Этот assay высок объём является мощным инструментом предполагается расширить наше понимание мембранных механизмов ремонта через скрининга для принимающих генов или экзогенно добавил соединений, что управления запечатывания плазматической мембраны.

Introduction

Mammalian клетки подвергаются механические, осмотического и биохимических стресс, что приводит к потере целостности плазматической мембраны. Без быстрого и эффективного запечатывания, поврежденные клетки быстро будет поддаваться запрограммирован или некротической смерти. С 1960 года усилия, чтобы понять плазматической мембраны, запечатывания процесса были вызваны разрушительные последствия, связанные с его дисфункции. Действительно заболеваний, таких как конечности-ремень мышечной дистрофии, сахарный диабет, Синдром Чедиака-Хигаси были связаны с недостатками плазматической мембраны ремонт из-за мутации гена кодирования dysferlin, производство Расширенный гликирования конечных продуктов и дефекты в лизосомальных людьми регулятор CHS1, соответственно1,2,3,4,5,6. Однако на сегодняшний день, наше понимание мембраны запечатывания является еще ограничен7. Первоначальные исследования показали, что мембрана запечатывания инициируется приток внеклеточного Ca2 + через повреждения плазматической мембраны8,9,10. С тех пор нескольких не являющихся взаимоисключающими Ca2 +-зависимых механизмов были предложены для запечатывания ячейки. Гипотеза патч предлагает, что в близости от раны, внутриклеточных везикулы сливаются друг с другом и повреждения плазматической мембраны в качестве патч11,12,,1314. Вторая модель предлагает что экзоцитоз кальций зависимых от лизосомы на рану сайт выпускает лизосомальных ферментов кислоты sphingomyelinase, который преобразует сфингомиелин Церамид в наружный листок плазматической мембраны. Это внезапное изменение в липидного состава приводит к инициативе Церамид эндоцитоза поврежденные региона15,16,17. Наконец третий предложенный механизм включает в себя роли для от англ сортировочный комплекс необходимых для транспорта (ESCRT) для поощрения формирования выходят на внешнюю сторону пузырьки, которые бутон от плазматической мембраны18. Только ограниченный набор белков была определена в этих моделях, и их оборудование должны далее осветил.

Здесь мы описываем пробирного высокой пропускной способности, что меры плазматической мембраны, запечатывания эффективность адэрентных клеток млекопитающих подвергается повреждению при посредничестве рекомбинантных листериолизин O (LLO)19. LLO поры формирование токсин (PFT) выделяется факультативная внутриклеточных патогенов Listeria monocytogenes20,,2122 и принадлежит к MACPF/CDC (комплекс нападения мембраны, Перфорины, и холестерин зависимой cytolysin) надсемейства. MACPF являются млекопитающих формирование пор белков, участвующих в иммунной защиты, тогда как СРНП в основном являются бактериальные токсины, производимые грамположительных возбудителей, которые повреждают клетки хозяина для содействия их патогенного образ жизни23. СРНП синтезируются как водорастворимые мономеров или димеры, привязанные к холестерина в плазматической мембраны и oligomerize в prepore комплекс до 50 подразделений. Комплекс prepore затем переставляет вставлять β-нити через липидный бислой, формируя поры β-ствол, который охватывает 30-50 Нм в диаметр24,25,,2627.  Эти большие поры позволяют флюсы ионов и малые клеточных компонентов и выход из клетки; Хотя некоторые исследования предложили, что поры меньших размеров, также сформированного28,29,30. Среди CDCs LLO отображает уникальные свойства, включая необратимым рН и температуры зависит от агрегации, который способствует высокой пропускной способности анализа31,32. LLO могут быть добавлены в среде культуры клеток на 4 ° c, температура разрешительной для его привязки к клеткам, но не в формировании порового комплекса. Начало порообразования затем могут быть синхронизированы с повышения температуры до 37 градусов, позволяя для эффективного распространения молекул токсина в плоскости мембраны к форме олигомеров и конформационные Ремоделирование участвующих в поры поколения. Поэтому следуя переключатель температуры, кинетическая повреждения клеток будет зависеть количество токсина, привязан к плазматической мембраны. Главное растворимых лло (не привязан к плазматической мембраны) быстро и необратимо агрегатов, когда температура достигает 37 градусов, который избавляет от необходимости смывать несвязанных токсин молекул и ограничивает степень повреждения мембраны с течением времени. И наконец потому что LLO связывает холестерин и формирует поры мембраны холестерина-богатые люди, этот assay поддается широкий спектр mammalian клеток. Это важно иметь в виду, что LLO влияет на клетки-хозяина сигнализации главным образом через порообразования, за некоторыми исключениями, в котором поры независимые ячейки сигнализации может произойти33,34,35,36 ,37,,3839. Таким образом, он не может быть исключено что LLO сигнализации деятельность может повлиять на процесс ремонта мембраны.

Этот assay непосредственно оценивает степень клеток ранив путем измерения включение клетки impermeant флюрохром, (например, пропидий йодидом) которая пассивно входит раненых клетки и становится весьма флуоресцентные, когда он ассоциируется с нуклеиновыми кислотами . Таким образом флюрохром может быть сохранен в среде культуры клеток на протяжении эксперимента, что позволяет в реальном времени анализ клеток ранив. Интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот связывание красителя будет возрастать концентрация токсина и для заданной концентрации токсина, будет возрастать с течением времени до тех пор, пока все поры образуются, а клетки полностью отремонтированы или пока не достигнут насыщения. Приток внеклеточного Ca2 + через поры мембраны является событием sine qua non для запечатывания. Таким образом, закрытия эффективности может быть косвенно подтверждается сравнения клеток, ранив в питательной среды, содержащие Ca2 + (ремонт разрешительной условие) до ранения в Ca2 +-бесплатный среднего (ремонт ограничительное условие). Потому что интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот связывание красителя прямо пропорциональна концентрации клеток в каждой скважине, важно для клеток семян на такой же концентрации на всех скважинах. Важно также для перечисления клеток в каждой скважине до и после assay чтобы отряд ячейки не происходит, как плавающие, агрегированные клетки могут скрывать флуоресценции чтений, которые могут затруднить интерпретацию данных. Для перечисления клетки, клетки, выражая-локализованных гистона 2B-GFP (H2B-GFP) были использованы в этом assay. Контролем температуры, мульти-режим, Гонав читателей объединить быстрой и высок объём измерения (используя формат 96 или 384-ну пластины) интенсивностью флюоресценции с микроскопии изображений живых клеток на 37 ° C. Последний может использоваться для перечисления количества клеток и наблюдать возможного формирования различных клеточных популяций.

В конечном счете этот assay предоставляет пользователям возможность расширить свои знания о сложности ремонта мембранных механизмов путем скрининга для принимающих молекул или ремонта экзогенно добавил соединений, которые может контролировать мембраны. Следующий протокол описывает экспериментальные шаги для определения эффективности закрытия клеток подвергается LLO и оценить последствия данного препарата или сотовой лечения по эффективности закрытия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. Мобильный покрытие
    Примечание: Человека шейки матки эпителиальных клеток HeLa и HeLa, выражая гистона 2B-GFP (H2B-GFP), были использованы в настоящем Протоколе, но этот assay может быть адаптирована к другим mammalian клеток19.
    1. Отсоедините адэрентных клеток от 75 см2 клетки культуры колбу путем промывания клетки с 2 мл трипсина-ЭДТА 0,25%. Замените используемые трипсина 2 мл свежего трипсина ЭДТА 0,25%.
    2. Инкубируйте клетки при 37 ° c за 5 мин до тех пор, пока клетки округлые и отделен от колбы.
    3. Ресуспензируйте клетки в 8 мл среднего роста (DMEM, содержащие 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл).
    4. Определение концентрации клеток с помощью Горяева и 10 мкл суспензии клеток.
    5. Разбавьте клетки в среднего роста к концентрации 2,5 x 105 клеток/мл.
    6. Налить суспензию клеток в стерильной пипеткой бассейна и тщательно перемешайте подвеска с помощью Пипетки серологические 10 мл.
    7. Использование 12-многоканальный микропипеткой и 200 мкл советы, распространять НеЬа клетки (2,5 х 104 клетки/100 мкл/хорошо) в трех экземплярах (или составленном) в 96-луночных плоская, ясно, черный полистирола культуры ткани лечение днище.
      Примечание: В качестве примера на рисунке 1представлен механизм покрытия.
    8. Культура клетки для 24 h в инкубатор культуры увлажненные клеток при 37 ° c и 5% CO2.
  2. Стоковый раствор подготовка
    1. Подготовка 1 Л 10 x запас буфера М (используется для подготовки М1 и м2), добавив 95 g Хэнкс сбалансированного солевого раствора, 0.476 g MgCl2 (5 мм) и 23,83 g HEPES (100 мм) до 900 мл воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 и поднять громкость до 1 л фильтр стерилизовать.
    2. Подготовка 50 мл 50 x (1,25 М) запасы глюкозы, добавив 11,26 g D-(+)-глюкозы в общей сложности 50 мл воды. Фильтр стерилизовать решение.
    3. Подготовка 50 мл 100 x (120 мм) запас кальция, добавив 0.666 g CaCl2 в общей сложности 50 мл воды. Фильтр стерилизовать решение.
    4. Подготовка 50 мл 10 x (50 мм) запас этиленгликоля bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', tetraacetic кислоты (EGTA), добавив 0.951 g EGTA 40 мл воды. Увеличение pH 8 с использованием NaOH распустить EGTA, а затем поднять объем до 50 мл. Фильтр стерилизовать решение.
    5. Для одной пластине 96-луночных, подготовить 50 мл средний 1 (M1, содержит Ca2 +), 50 мл 2 средних (м2, Ca2 +-бесплатно) и 15 мл 2 средних, дополненные EGTA, соответственно:
      1. Для M1 добавьте 5 мл 10 x буфер М, 0,5 мл 100 x CaCl2и 1 мл раствора глюкозы 50 x 43.5 мл воды.
      2. За м2 добавьте 5 мл 10 x буфер M и 1 мл раствора глюкозы 50 x 44 мл воды.
      3. За м2/EGTA, добавить 1,5 мл 10 x буфер М и 1,5 мл 10 x EGTA до 12 мл воды.
        Примечание: Все растворы, содержащие пропидий йодидом (PI) должен быть подготовлен непосредственно перед добавлением к клеткам.
  3. Пластина читателя/изображений цитометр параметры
    Примечание: Используйте читатель многорежимный пластины оснащен двумя блоки детектирования: spectrofluorometer и визуализации цитометр. Ограничьте воздействие флуоресценции, чтобы избежать Фотообесцвечивание флуорофоров.
    1. Предварительно теплой пластины читателя до 37 ° C перед выполнением assay.
    2. Настройка параметров для кинетического анализа соответственно в режиме параметров :
      1. Выбрать для оптических конфигурации монохроматора, FL (флуоресценции)и кинетической , читать режимы и читать типа, соответственно.
      2. В разделе Параметры волнывыберите 9 и 15 Нм возбуждения и выбросов bandpass, соответственно. Для анализов с использованием пропидий йодидом (PI) установите возбуждения и выбросах волн 535 и 617 Нм, соответственно.
      3. Плиты типавыберите 96 скважин для формат пластины и заранее установленные плиты конфигурации соответствует черно стена четких днище.
      4. В списке Области чтениявыделите скважин, которые будут проанализированы всей кинетической.
      5. ПЛТ и оптикапресет вспышки за чтение до 6 и установите флажок для чтения снизу.
      6. В срокивставить в поле Общее время выполнения для кинетического анализа 30 мин 00:30:00 и вставьте 00:05:00 для интервала.
        Примечание: Для каждой точки и одной длины волны, чтение времени полный 96-луночных плиты составляет 30 s.
      7. Подтверждение параметров, указанных в Информации параметров справа и выберите OK. Читать пресс начать кинетическая запуска.
    3. Установите параметры обработки изображений соответственно в режиме параметров:
      1. Выберите Minimax, Imagingи конечную точку для оптических конфигурации, читать режимы и читать типа, соответственно.
      2. В длинах волн, флажки, передаваемая свети один или оба флуоресценции соответствующие волны возбуждения и выбросов 456/541 Нм (ГПУП) и 625/713 Нм (PI).
      3. Используйте те же параметры для Типа плиты и Области чтения , как они определены в шагах 1.3.2.3 и 1.3.2.4.
      4. В разделе Также область настройкивыберите количество сайтов в рамках хорошо к записи образа.
        Примечание: 12 сайтов соответствует полной изображения.
      5. В разделе Параметры приобретения изображенийвыберите времени экспозиции для передачи света, 541 (КГВ) и 713 (PI). Для GFP изображение все хорошо с Выдержка 20 мс/изображения. Для передачи света (TL) и PI флуоресценции, приобрести единый образ центра каждой скважины с временем экспозиции 8 и 20 мс, соответственно.
      6. Подтверждение параметров, указанных в информации параметров справа и выберите OK. Приобретение для визуализации на всей поверхности каждой скважины (12 изображений/хорошо) 96-луночных плиты и одной волны время ~ 15 минут чтения пресс начать изображений.
        Примечание: Приобретение время одного изображения/хорошо 96-луночных плиты требует ~2.5 мин/пластины для одной длины волны. Описанные выше параметры соответствуют специального оборудования в нашей лаборатории. Spectrofluorometric измерения: ксеноновой лампы отображения волны возбуждения приращения 1.0 Нм (250-850 нм) с регулируемым 9 или 15 Нм полосовой, фотоэлектронный умножитель Трубка детектора с > 6 журнала динамический диапазон и регулируемый 15 или 25 Нм выбросов Bandpass. Imaging цитометр: источник света освещение, способный белого света, 460 Нм и 625 нм волны возбуждения с 20 Нм bandpass, фильтры выбросов, центрированного 541 Нм (108 Нм полосовой) и 713 Нм (123 Нм полосовой), соответственно, и объектив 4 X 1.25 12-битный зарядовой мегапиксела.

2. assay

Примечание: В то время assay клетки должны быть 70-90% притока. Во время мытья шаги следует удалены от средних и применяется к боковой стенке скважины (не непосредственно над клетки). Поддерживать температуру LLO в < 4 ° c для предотвращения агрегации до шага 3.1.5.

  1. Подготовьте запас 30 мкм PI в M1 и запас 30 мкм PI в м2 до нагревается в 37 градусов.
  2. Осторожно промойте клетки в плита 1, с помощью 12-многоканальный микропипеткой и 200 мкл советы, следующим образом:
    1. Для ремонта разрешительной условий удалите среднего роста и мыть, что клетки дважды с 200 мкл/хорошо M1 предварительно разогретую на 37 градусов. Замените носитель 100 мкл/скважина теплой M1 содержащие 30 мкм PI.
    2. Для ремонта ограничительных условий, удалите среднего роста и вымыть клетки один раз с 200 мкл/хорошо теплой м2, содержащие 5 мм EGTA хелат Ca2 +, следуют один умывальник с 200 мкл/хорошо м2. Замените носитель с 100 мкл/хорошо теплой м2 содержит 30 мкм PI.
    3. После роста средних промывают и заменить средства, содержащие пропидий йодидом, непосредственно перейти к шагу 2.1.3.
  3. Изображения пластина 1 под пропускаемого света, GFP и PI подробно под 1.3.3 (предварительно кинетический). Этот шаг занимает 15-20 мин.
  4. В период 15 мин на шаге 2.1.3 Подготовьте плита 2, с помощью 12-многоканальный микропипеткой и 200 мкл советы следующим образом:
    1. Место полипропиленовые Гонав 96-луночных круглым дном на льду. Настройка пластину с помощью экспериментальный дизайн, соответствующий пластина 1 (рис. 1).
    2. Для ремонта разрешительной условий, добавить 100 мкл/Ну ледяной М1 содержащие 60 мкм PI, с последующим добавлением 100 мкл/Ну ледяной М1, содержащих 4 x LLO или не для элемента управления.
    3. Для ремонта ограничительные условия, добавить 100 мкл/Ну ледяной м2 содержащие 60 мкм PI, с последующим добавлением 100 мкл/Ну ледяной м2, содержащих 4 x LLO или не для элемента управления.
  5. После визуализации пластина 1 (шаг 2.1.3), сразу же поместить его на льду, с помощью алюминиевой фольги для разделения пластину от прямого контакта со льдом. Разрешить плита 1, чтобы остыть в течение 5 мин.
  6. Использование 12-многоканальный микропипеткой и 200 мкл советы, передача 100 мкл от каждой скважины в плите 2 (шаг 2.1.4) соответствующие лунки в пластине 1. Должным образом распределить токсин в СМИ пластины 1, вставьте советы ниже мениска и осторожно извлечь тома без введения пузыри.
    Примечание: Не Пипетка вверх и вниз, как это случайно может отделить клетки.
  7. Оставьте пластину для дополнительного 1 мин позволить токсин привязать к клеткам и немедленно передавать пластина 1 пластина читателю для кинетической assay, с использованием режима spectrofluorometer (шаг 1.3.2).
  8. В конце кинетического анализа немедленно изображения пластина 1 (после кинетической) с помощью шаг 1.3.3.

3. Анализ: Клетки перечисление

  1. Определите количество клеток на основе ядерной флуоресценции, с использованием программного обеспечения ячейки перечисления микроплиты.
    1. В пределах параметров, выберите Re анализаи Параметры анализа изображений в разделе Категория выберите Сдержанный объект анализа с использованием 541 как волны для поиска объектов.
    2. В параметр найти объекты, используя опираться на изображения найти метод выберите ядер на вкладке Параметры и нажмите кнопку Применить.
    3. Нажмите OK и чтения инициировать алгоритм подсчета клеток.
  2. В качестве альтернативы если нет такой инструмент доступен, используйте программное обеспечение для анализа изображений например ImageJ для перечисления клетки.
    1. Откройте файл изображения в ImageJ, как стек.
    2. Преобразовать стек greyscale 8-битных изображений, щелкнув изображение в строке меню наведите тип и выберите пункт 8-битный.
    3. Вычитание фона: изображение нажмите в строке меню наведите настроитьи выберите Яркость/контраст. Отрегулируйте минимальное значение, чтобы удалить фоновый шум и выберите Применить.
    4. Порог для создания двоичного изображения: изображение нажмите в строке меню наведите настроитьи выберите порог. Выберите темный фон, корректировать минимальные и максимальные пороговые значения и нажмите кнопку Применить.
    5. В случае перекрытия ядер, водораздел инструмент может использоваться для сегмента ядер. Выберите процесс в меню, наведите двоичные и выберите водораздел.
      Примечание: Это будет автоматически отдельных подключенных ядер.
    6. Анализ изображений масках путем применения критериев, заданных пользователем (размер и округлость) для уточнения определения ядер и исключить ячейки мусор.
      1. Нажмите на анализ в меню, а затем анализ частиц. Установите желаемый размер (пиксель ^ 2) и округлость (значение 1 является идеальный круг) диапазонов, достаточно включить отдельные клетки/ядер.
      2. В раскрывающемся списке Показать выберите желаемый вариант(ы), проверьте суммироватьи нажмите кнопку OK для получения клеток.

4. Анализ: Кинетические кривые

  1. Перенесите кинетические данные из пластины читателя программного обеспечения аналитических данных программного обеспечения.
  2. Для каждого экспериментальные условия средняя интенсивность флуоресценции реплицирует на каждом timepoint, вместе с соответствующей стандартное отклонение и Среднеквадратичная ошибка среднего для каждой экспериментальной условия.
  3. Для каждого экспериментальные условия, отслеживать соответствующие кинетической кривой: PI интенсивности (ось y) против времени (ось x).
  4. Чтобы вычислить закрытия эффективность лечения данного состояния, рассчитать площадь под кривой (AUC) + LLO Н1 (AUC(M1)) и + LLO м2 (AUC(M2)). Использование подхода, предлагаемые ниже для оценки эффективности (E) запечатывания:
    Equation
  5. Выполняют сравнение между контроля и испытаний лечения определяется коэффициент эффективности (REff), указанные ниже:
    Equation 2
    EFF R = 1, тест лечение не влияет на ремонт
    REFF < 1, тест лечения препятствует ремонт
    EFF R > 1, тест лечение улучшает ремонт
  6. Вычислите площадь под кривой, используя следующее уравнение:
    Equation 3, где k — общее количество последующих мероприятий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Точность подсчета клеток: Клетки HeLa часто используются как линия клеток млекопитающих модель для изучения мембраны ремонт механизмов. При оценке мембраны ремонт на уровне популяции клеток, важно для плиты клетки на такой же концентрации на всех скважинах для правильной интерпретации. Это также важно для проверки во время анализа числа клеток эквивалент через скважины. Клетки HeLa, которые конститутивно Экспресс гистона 2B сливается с GFP (H2B-GFP) были введены в этот assay автоматически перечислить ячеек, основанных на обнаружении их флуоресцентных ядер. Чтобы установить точность в перечислении ячейки, двойная серийных разведений клеток HeLa H2B-ГФП были покрытием в трех экземплярах в 96-луночных пластине и культивировали в течение 4 ч. Это количество времени достаточно для клеток вложения и предоставляет ограниченный деление клеток. Полная скважин были образы в переданном свете (TL) и истолкования флуоресценции GFP и клеток были оценены на основании флуоресценции GFP с помощью программного обеспечения читателя анализа пластины (рис. 2A и 2B). Стандартное отклонение ± рассчитывает средний клеток был заговор против посева концентрации клеток, и линии наилучшего указывается последней соотношение количества клеток в ячейку посева, демонстрируя точность подсчета (рис. 2 c). Изображения всех скважин до кинетического анализа, может быть обеспечено, что числа клеток согласуются среди всех скважин. Кроме того изображения скважин после кинетического анализа, можно установить если воздействие токсина вызвал мобильный отряд.

Выражение гена GFP не мешать пропидий йодидом (PI) интенсивность измерения (IPI): обеспечить что H2B-GFP ядерной ассоциации не вмешиваться с PI инкорпорации или PI флуоресценции измерения силы (IPI), яPI сравнивали HeLa и HeLa H2B-GFP клеток, которые подверглись воздействию, или нет, до 1 Нм лло (рис. 3). В отсутствие PI была аналогичным образом низкий уровень фона флуоресценции в HeLa и HeLa H2B-КГВ, указывающий, что GFP не кровоточат через PI флуоресценции выбросов фильтры. Присутствии Пи, но отсутствие LLO был подобный базальной выбросов PI флуоресценции HeLa и HeLa H2B-GFP, который со временем не меняться. Это подтвердил, что выражение гена GFP не влияет на измерение PI флуоресценции и указал, что PI не проникают в клетки не повреждены через временные рамки эксперимента. Добавление LLO привело к увеличению в PI флуоресценции со временем, который был похож на HeLa и HeLa H2B-GFP. Это увеличение объясняется клеток, ранив по ЛЛО, в сочетании с PI ассоциации с нуклеиновыми кислотами. Вместе эти результаты устанавливают, что выражение гистон 2B-GFP не влияет на включение PI или измерения его флуоресценции.

PI флуоресценции не вмешиваться с GFP-основе клеток подсчета: взаимно, важно, чтобы убедиться, что ядерной включения PI раненых клетках не вмешиваться на основе GFP клеток подсчета. Представитель флуоресценции изображения HeLa и HeLa H2B-GFP подвергается 1 Нм LLO присутствии PI показали, что заметное накопление PI раненых клетках кинетики должность, как ожидается (Рисунок 4A). Изображения также показали, что PI может кровоточить через GFP флуоресценции обнаружения (Рисунок 4A и Таблица 1). Этот кроссовер флуоресценции лучше всего ценилась на пост кинетическая изображения клетки HeLa, которые не выражают GFP, но по-прежнему отображаться Зеленый флуоресцентный ядер (рис. 4A). Этот кроссовер может быть также подтверждается измерения интенсивности флуоресценции GFP (IGFP) в клетки HeLa H2B-GFP, которые значительно увеличилось после кинетическая по сравнению с предварительно кинетическая (рис. 4B). Важно отметить, что PI флуоресценции кроссовер не влияет на клетки подсчета, потому что процесс сегментации в перечислении ядер не влияет увеличение GFP флуоресцирования (рис. 4 c).

Измерения плазматической мембраны запечатывания эффективность: В этом разделе мы представляем основные методологии, используемой для измерения эффективности мембраны запечатывания. Для подтверждения процесс запечатывания мембраны, клетки HeLa H2B-ГФП были подвержены, или нет, 1 Нм LLO в присутствие (M1) или отсутствие (м2) внеклеточной Ca2 + (рис. 5). Как и ожидалось, в отсутствие LLO, яPI остается постоянным в М1 и м2. Добавление LLO в Ca2 +-содержащих среднего привело к устойчивый рост интенсивности флуоресценции PI (IPI), тогда как в отсутствие внеклеточного Ca2 +, был значительно круче увеличение PI флуоресценции, отражающие отсутствие мембраны запечатывания. Для оценки эффективности закрытия, которая определяется как способность клеток для восстановления в M1 относительно м2 (шаг 1.5.4.1), площадь под кривые М1 и м2 (AUC)) были определены и эффективность ремонта (E) было рассчитано быть 0,287.

Альтернативой PI: PI повсеместно используется в качестве маркера для повреждения плазматической мембраны. Однако есть другие красители привязки нуклеиновой кислоты, которые также подходят для этот assay. Например привязка нуклеиновой кислоты impermeant карбоцианиновыми мембраны красителя (CNABD) экспонатов спектра излучения, проникают далеко красный и имеет высокую специфичность для двойной мель ДНК. С другой стороны, PI связывает ДНК и РНК40,41. В отличие от PI возбуждения и выбросов спектры CNABD не дублируют GFP, позволяющие лучше спектральное разрешение между двумя флуорохромов. Кроме того CNABD, используемые в настоящем Протоколе имеет коэффициент вымирания почти в два раза, PI, который означает, что для их возбуждения соответствующих длинах волн, этот краситель более способны поглощать энергию чем Пи что приводит к сильной флуоресценции выбросов. Анализ количественных флуоресценции CNABD и GFP изображений, показал, что эта краска экспонаты большой флуоресценции динамический диапазон, не излучают значительно на длинах волн GFP флуоресценции и не влияет на количество клеток (рис. 6A-D). Действительно, клетки HeLa H2B-GFP инкубировали в M1 или M2 СМИ, содержащие CNABD и повреждены 1 Нм LLO выставлены на 4 - и 5.5 раз увеличение яCNABD по отношению к не поврежденных элементов управления, соответственно (рис. 7A). Для сравнения, клетки подвергаются 1 Нм LLO присутствии PI выставлены 2,5 и 3 раза увеличение интенсивности флуоресценции PI в М1 и м2, соответственно (рис. 5). Как Пи, CNABD экспонатов увеличение интенсивности флуоресценции с увеличением концентрации LLO в M1 (рис. 7A), и результирующий эффективность ремонта рассчитывалась как описано в шаге 1.5.4.1 (рис. 7B). Нам сообщают, что клетки, запечатывания уменьшается эффективность как LLO концентрация увеличивается. Это явление отражает тот факт, что клетки снижают их способность запечатывание когда чрезмерные повреждения.

Оценка качества пробирного ремонт мембраны: важнейший аспект любой пробирного является его надежность или возможности для обнаружения и устранения различий между элементами управления негативные и позитивные. Сигнал разнице между положительной и отрицательной контроля должны проявить достаточно динамический диапазон и воспроизводимость. В assay ремонт этой мембраны позитивные и негативные элементы управления являются клетки подвергаются LLO в ремонт разрешительных (M1) и ремонт ограничительные условия (м2), соответственно. Оценить надежность этот assay для высокой пропускной способности анализа были приняты два подхода. Во-первых, Z-фактор, или скрининг окна коэффициент, определяет, обеспечивает ли заданный набор условий большой достаточно динамический диапазон, время учета изменчивости сигнала. Z-факторы в диапазонах 0 < Z ≤ 0,5 и 0,5 < Z ≤ 1 соответствуют приемлемым и очень хорошо assay, соответственно42,43. Ограничение использования Z-фактор для оценки качества является, что испытания условия обычно exhibit более умеренные значения по сравнению с крайней положительной и отрицательной контроля. Поэтому, как второй подход мы рассчитали строго стандартизированной разницы средних (SSMD, β), который может идентифицировать различия между экспериментальных условиях, которые в противном случае было бы быть классифицированы как отрицательный результат, основанный на квалифицированных Z-фактор44 ,45. SSMD значения могут быть разделены на прочность влияния, начиная от никакого эффекта (β = 0) до очень сильного (β ≥ 5). Использование данных из рис. 7A и AUC для сравнения M1 против условий м2, подверженности 0,25 и 0,5 Нм LLO производится Z-фактор значения 0.3100813 и 0.137313 и β = 6.0672 и 4.803308, соответственно, показывающее, что окно концентраций LLO подходит для assay. Увеличением концентрации LLO за 1 Нм, разрыв в ICNABD кинетических кривых между M1 и M2 условий закрывает обусловило резкое снижение значения Z-фактор и SSMD (рис. 7B). Такая высокая концентрация LLO соответствуют условиям, в которых потенциал ремонт перевешивают ущерб и таким образом отрицает использование assay в выявлении факторов, участвующих в ремонте мембраны. Это далее подтверждается снижением эффективности (E) ремонт как LLO концентрация увеличивается (рис. 7B). Все данные (Z-фактор, SSMD и E) были созданы с 3 биологических реплицирует и 3 технических реплицирует за экспериментальной условие для проверки анализа. Вместе, эти данные показывают, что этот assay имеет ожидаемый надежности для высокой пропускной способности assay LLO концентрации уступает 1 Нм для НеЬа клетки.

Подтверждение принципа: после того, как надежность анализа была создана, мы провели дополнительные эксперименты как доказательство принципа, что этот assay имеет чувствительность и разрешение для выявления дефектов в процессе ремонта. Кроме того мы считали, что высок объём анализы используются как процесс отбора для определения «хитов» в рамках больших экранов, которые могут включать менее чем 3 биологических реплицирует. Таким образом уместно, что экспериментальный дизайн обеспечивает обнаружение мощности для выявления «хитов» в пределах одного пробирного. Таким образом под экран высокой пропускной способности, пробирного макета могут быть изменены для размещения 4 технические реплицирует увеличить статистической мощности в одном эксперименте. Клетки были покрытием в составленном и были предварительно очищенной 1 h до пробу с дезипрамин, фармакологические ингибитор кислоты sphingomyelinase лизосомальных белка (ASM), который играет роль в плазматической мембране ремонт15,17 ,46. Важно отметить, что лечение с дезипрамин не затрагивает клеток на протяжении assay, позволяя соответствующие сравнения между дезипрамин лечение и не лечить клетки (Рисунок 8A). Ингибирование ASM в клетках, обработанных дезипрамин привело дефект мембраны запечатывания эффективности под воздействием LLO, что подтверждается уменьшением в E и REff (Рисунок 8B и 8 C). Используя модель смешанных эффектов, сравнение дезипрамин лечение лечение клетки подвергаются 0,25 и 0,5 Нм, проявленные LLO в M1 p значения 0,0010 и 1 x 10-10, соответственно. Вместе данные показывают, что 0,25 и 0,5 Нм LLO соответствующей концентрации для выявления дефектов в ремонт в экспериментальных условиях высокой пропускной способности, с возможным статистический анализ одного эксперимента однажды технические реплицирует увеличиваются до четырех . Обратите внимание, что через несколько биологических реплицирует статистический подход модели смешанных эффектов между составленном не будут учтены для потенциальных вариантов. Любые важные выводы, используя один из биологических репликации должны быть проверены в дополнительных экспериментальных установках.

Figure 1
Рисунок 1: экспериментальный дизайн. Схема изображает представитель пластина дизайн, настроен для проверки эффекта семи тестовых условий по сравнению с клетки лечение управления. Дополнительные элементы управления должны быть включены, если это уместно, как пример наркотиков транспортных средств. Клетки покрыты (пластина 1) 24 ч до эксперимента. В день эксперимента, клетки в пластине 1 помыты с М1 или м2 средний, предварительно нагревают при 37 ° C, и пластина является фотосъемка (TL, GFP и PI флуоресценции) предварительно кинетическую. В течение 15 мин изображений, реагенты добавляются на льду плита 2. После съемки, пластина 1 немедленно помещается на льду на 5 мин, и 100 мкл/хорошо передаются от пластины 2 пластины 1. Пластина 1 помещается в читателя пластины для запуска кинетического анализа при 37 ° C за 30 мин, следуют изображений (TL, GFP и PI флуоресценции). Затем данные анализируются подсчитать ячейки и оценить эффективность ремонт во всех экспериментальных условиях. В больших наборов данных анализ может быть автоматизирован. Кроме того количество технических реплицирует может быть увеличена до 4 экранов высокой пропускной способности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: клеток подсчета точности. Клетки HeLa, выражая GFP-тегами гистона 2B были посеяны в triplicates в указанных концентрациях. (A) клетки были образы при 37 ° C под пропускаемого света (TL) и флуоресценции GFP (12 изображений/а) и алгоритм обнаружения клетки была использована для разграничения отдельных ядер (в фиолетовый). Шкалы бар = 1 mm. (Б) увеличение TL, GFP и образы обнаружения (фиолетовый) клеток (увеличенное 2 X). Шкалы бар = 100 мкм. (C) изображения, программное обеспечение для анализа был использован для подсчета количества клеток и клеток, которые графов были заговоре против первоначальных клеток посева концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: пропидий йодидом флуоресценции измерения не зависит от гистонов выражение 2B-GFP. Гистона 2B-GFP выражения и не выразив клетки НеЬа были подвержены, или нет, 1 Нм LLO в присутствии (сплошные линии) или отсутствие (пунктирные линии) 30 мкм PI в Ca2 +-содержащих среднего (M1). Кинетического анализа определяется интенсивностью флюоресценции PI spectrofluorometry каждые 5 мин за 30 мин при температуре 37 ° C. Данные являются средняя PI флуоресценции интенсивность (IPI) выражена в относительной флуоресценции единиц (РФС) ± SEM (n = 3 независимых экспериментов, каждый выполненных в triplicates). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: перечисление ячейки не подвержен влиянию PI флуоресценции. (A) представитель пред- и пост кинетическая изображения (TL, PI и GFP) клеток воздействию, или нет, 1 Нм LLO в M1. Шкалы бар = 100 мкм. (B) анализ микроскопии флуоресцирования количественные (яGFP± SEM) показали увеличение измерения флуоресценции GFP вследствие ядерного включения Пи на клетки, ранив по лло (после кинетический). (C) на основе GFP клеток перечисления был неизменным увеличением интенсивности GFP. Количество клеток в хорошо была выражена как среднее ± SEM. (в B и C: чёрные полосы = предварительно кинетических данных; красные полоски = пост кинетических данных; n = 3 независимых экспериментов, каждая выполнена в triplicates; 2-Стьюдента t тест использовался для анализа количественных флуоресценции интенсивность и клеток обвинения от полученных изображений, ** p < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: измерение плазматической мембраны запечатывания эффективности. Гистона 2B-GFP выражая НеЬа клетки подвергаются, или нет, 1 Нм LLO в Ca2 +-содержащих (M1) или Ca2 +-бесплатно (м2) носитель, содержащий 30 мкм PI. Кинетические данные представляют интенсивности флуоресценции PI (IPI) в относительные флуоресценции единиц (РФС) ± SEM, измеренные на 30 минут при 37 ° C. n = 3 независимых экспериментов, каждый выполненных в triplicates. Закрытия эффективность измеряется как указано в протоколе шаг 1.5.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: карбоцианиновыми нуклеиновой кислоты обязательных краситель как альтернативного краситель для оценки мембраны запечатывания. Клетки HeLa H2B-ГФП были подвержены, или нет, 0,5 Нм LLO 30 минут при 37 ° C в присутствии 1 мкм CNABD в Ca2 +-содержащих (M1) или Ca2 +-бесплатный среднего (м2). (A) клетки изображения HeLa H2B-ГФП были приобретены до и после кинетическая в M1 содержащий краситель. Шкалы бар = 100 мкм. (B и C) интенсивностью флюоресценции комплексного CNABD и ГФП были измерены с помощью тепловизионных цитометр и выражены в единицах относительной флуоресцирования (РФС) ± SEM. (D) GFP флуоресценции изображения были обработаны для перечисления HeLa H2B-GFP клетки (чёрные полосы = баров предварительно кинетических данных, красный = пост кинетические данные, n = 3 независимых экспериментов, каждый выполненных в triplicates). Двух-Стьюдента t тест использовался для анализа интенсивности флуоресценции количественных и клетки подсчитывает от полученных изображений, ** p < 0.01, *** p < 0,001) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: эффект LLO концентрации на запечатывания эффективности, Z-фактор и SSMD. (A) HeLa H2B-GFP клетки инкубировали в М1 или м2 содержащие 1 мкм CNABD были подвергается все большей концентрации LLO и подвергается кинетическая assay для 30 минут при 37 ° C. Данные выражаются как CNABD интенсивности (ICNABD) в относительные флуоресценции единиц (РФС) ± SEM. (B) Z-фактор и строго стандартизированной разницы средних (SSMD) были рассчитаны как оценка качества для надежности ремонта мембраны анализа, используя площадь под кривой (AUC)) в качестве метрики для кинетических кривых42,,4344,45. Закрытия эффективности рассчитывались как описано в разделах протокола и результаты (n = 3 независимых экспериментов, каждый выполненных в triplicates). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: воздействие клеток дезипрамин вызывает дефекты в запечатывания. Клетки HeLa H2B-GFP (покрытие в составленном) лечили до 30 мкм дезипрамин (или нет) за 1 ч при 37 ° C и затем подвергается 0,25 или 0,5 Нм LLO присутствии 1 мкм CNABD в Ca2 +-содержащих (M1) или Ca2 +-бесплатный среднего (м2). Клетки были образы (до и после кинетические) и подвергается кинетического анализа при 37 ° C за 30 мин (A) клетки были перечислены; Данные выражаются как средний клеток графов ± SEM. (B) CNABD флуоресценции интенсивности (ICNABD) выражается в относительной флуоресценции единиц (РФС) ± SEM. (C) Resealing эффективности рассчитывались в присутствии и отсутствии Дезипрамин. Смешанные последствия модель была использована на значения преобразования журнала интенсивности, предполагая случайного перехвата для каждой технической реплицировать. Захватить оба перехода и изменения в форму кинетических кривых, основной эффект лечения состояния и эффект взаимодействия между лечения состояние и время совместно были протестированы на статистическую значимость. Двух-Стьюдента t тест был использован для анализа клеток от полученных изображений. P значение была рассчитана с использованием модели смешанных эффектов. (4 технических реплицирует, один эксперимент). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Спецификации канала выбросов цитометр изображений
Флюорофор Флюорофор ex / Эм (Нм) Зелёный канал (ex / ет ± bandpass, Нм) Красный канал (ex / ет ± bandpass, Нм)
ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Таблица 1: GFP, PI и CNABD пики возбуждения и выбросов и зеленый и красный канал возбуждения и выбросов bandpasses для визуализации цитометр.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот assay измеряет эффективность мембраны запечатывания на уровне популяции клеток с высокой пропускной способностью. Он может использоваться экран для клеточных компонентов или наркотиков библиотек, которые могут повлиять на ремонт мембраны. Описанные assay используется формат 96-луночных пластины, но она может быть адаптирована к 384-ну пластины для более высокой пропускной способности. Преимуществом этого анализа является его способность получить измерения флуоресценции адэрентных живых клеток в режиме реального времени без необходимости в чрезмерных ячейки, обработка таких клеток отряда, фиксации или флуоресценции маркировки после фиксации. Многомодового пластины читателей, как он используется в настоящем Протоколе, обладающих достаточной чувствительностью для быстрого spectrofluorometric измерений на интервалы времени, как низко как 30 s 96-луночных пластины. Приобретение флуоресценции изображений обеспечивает дополнительную информацию, включая перечисление клеток, возможного изменения морфологии клеток, и потенциал идентификации отдельных клеточных популяций. Настоящий анализ не устанавливает кинетика плазматической мембраны запечатывания на уровне отдельной ячейки, но идентифицирует экспериментальных условий (фармакологические соединений или клеточных компонентов), которые могут повлиять на, положительно или отрицательно, процесс мембрана запечатывания на уровне популяции клеток.

Несколько других экспериментальных подходов были разработаны для оценки мембраны, запечатывания механизмов. Например механические нарушения микроиглы прокол, шарик истиранию и лазерной абляции были использованы для моделирования повреждений механического мембраны. Измерения ранив/ремонт привлекла флуоресцентной микроскопии или потока цитометрии количественной вход флуоресцентных зондов (FM 1-43, пропидий йодидом, флуоресцеин конъюгированных декстраны) или отслеживание флуоресцентный белок химер47 ,48,,4950. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества; Однако они не поддаются высокопроизводительного скрининга в живых клетках, представленные в этом assay.

Настоящий анализ был оптимизирован для анализа эффективности закрытия ранен поры формирование белка LLO, какие формы большие поры, которые позволяют массовый Ca2 + приток как спровоцированы механических разрывов плазматической мембраны клеток. Хотя формирование пор токсины представляют одной из форм повреждения плазматической мембраны, ремонт крупных токсинов поры и механические раны были предложены поделиться общей Ca2 +-зависимых путей17,51. Важно отметить что LLO взаимодействие с компонентами клеточной мембраны, таких как холестерин может повлиять на ячейку сигнализации и тем самым может влиять на мембраны, запечатывания механизмов по сравнению с механическим раны. Наши знания о мембраны ремонта по-прежнему ограничен, и установить если запечатывания механические раны отличаются от запечатывания после формирования токсинов поры необходимы дополнительные исследования. Существует несколько преимуществ использования земли. Во-первых начало мембраны повреждения могут быть синхронизированы с повышения температуры от 4 до 37 ° C. Во-вторых, растворимой формы лло (не привязан к клеточной мембраны) необратимо агрегатов на нейтральном pH и 37 ° C, таким образом ограничивая цитотоксических эффектов и отмены необходимость мыть клетки. Наконец степень повреждения может быть отрегулирован меняя концентрацию токсина. Однако этот assay ограничены переключатель температуры между 37 и 4 ° C, которые могут повлиять на ремонт механизма например везикулярный транспорт, эндоцитоза и текучесть мембран, среди других процессов, которые находятся под влиянием температуры52, 53,54. Важно, чтобы убедиться, что любой фармакологической ингибитор, включены в assay не вмешиваться с образованием LLO поры, выполнив пробирного гемолиз в наличие (или отсутствие) препарат55. Из-за потенциального пакета различия в LLO активности важно подготовить запас LLO, достаточно большой для весь экран высок объём55.

Мы включали использование клеток, выражая Химера гистон 2B-GFP-локализованных как средство для перечисления ячейки до и после пробирного ремонт мембраны через микроскопических изображений, следуют автоматизированный анализ изображений. Главное эквивалентные клетки подсчитывает через условия и неизменный клетки подсчитывает до и после кинетического анализа имеют решающее значение как PI или интенсивностью флюоресценции CNABD не могут легко быть нормализован. Действительно разница в клеток приведет к различия в степени повреждения данной концентрации земли, которые не могут быть исправлены для через флуоресценции нормализации из-за различий в запечатывания эффективности (рис. 7). Мы показали, что гистон 2B-GFP выражение не вмешиваться с PI или CNABD включения или флуоресценции выбросов. И наоборот PI или CNABD включения не влияет на перечисления на основе GFP клеток. Если использовать другие комбинации флуорофоров, было бы необходимо оценить потенциальные спектральных дублирования между флуорохромов, как была выполнена в этой работе. Хотя PI широко использовалась для оценки повреждения мембраны, мы покажем, что CNABD является отличной заменой, обладающая высокой доходности квантовой флуоресценции, результате большего динамического диапазона, подходит для характеризующие запечатывания эффективности.

Z-фактор и SSMD подтвердил, что этот assay имеет надежность, необходимые для выполнения анализов высокой пропускной способности. Расчет эффективности закрытия является критической и надежный инструмент для выявления потенциальных хитов. Кроме того модель смешанных эффектов может использоваться как статистический инструмент для оценки хитов в течение одного анализа. Экспериментальный план должен включать как минимум трех технических реплицирует если экран может повторяться несколько раз. Quadruplicates следует использовать, если статистические инструменты, такие как смешанные эффекты модели, должны быть включены в одном эксперименте, ли или нет он будет повторяться. Однако рекомендуется выполнять на экране несколько раз и проверить результаты, выполняя дополнительные эксперименты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы признаем доктора Jesse Kwiek (Университет штата Огайо) за любезно предоставленную нам возможность использовать его платформы мульти-режим обнаружения для некоторых предварительных экспериментов. Исследования в этой статье была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний национальных институтов здоровья под номером RO1AI107250 награду для Стефани Seveau. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 143 плазматической мембраны запечатывания ремонт мембраны мышечная дистрофия пропидий йодидом карбоцианиновыми нуклеиновой кислоты привязки краситель образующих поры токсин листериолизин O
Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter