JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58351
, ,
1Department of Microbial Infection and Immunity,The Ohio State University, 2Department of Microbiology,The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute,The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health,The Ohio State University

Summary

Her beskriver vi en høj overførselshastighed fluorescens-baseret analyse, der måler plasmamembran genforsegling effektivitet gennem fluorometriske og billedbehandling analyser i levende celler. Denne analyse kan anvendes til screening af narkotika eller target gener, der regulerer plasmamembran genlukning i pattedyrsceller.

Abstract

I deres fysiologiske miljø udsættes pattedyrceller ofte for mekaniske og biokemiske understreger, at resultere i plasma membran skader. Svar på disse skader reseal komplekse molekylære machineries hurtigt plasma membran for at genoprette sin barriere funktion og vedligeholde celle overlevelse. Trods 60 års forskning på dette område mangler vi stadig en grundig forståelse af cellen genforsegling maskiner. Med mål at identificere cellulære komponenter at kontrol plasmamembran genforsegling eller lægemidler, der kan forbedre lukning, har vi udviklet et fluorescens-baserede høj overførselshastighed assay, der måler plasmamembran genforsegling effektivitet i pattedyrceller kulturperler i mikroplader. Som en modelsystem for plasma membran skader, celler er udsat for bakteriel poreformede toksin listeriolysin O (LLO), der danner store 30-50 nm diameter proteinholdige porer i kolesterol-holdige membraner. Brug af en temperatur-kontrolleret multi-mode mikrotiterplade læser giver mulighed for hurtige og følsomme spectrofluorometric målinger i kombination med brightfield og Fluorescens mikroskopi billeddannelse af levende celler. Kinetic analyse af fluorescens-intensiteten udsendes af en membran impermeant nukleinsyre-bindende fluorokrom afspejler omfanget af membran sårede og lukning på befolkningsniveau celle, giver mulighed for beregning af cellen genforsegling effektivitet . Fluorescens mikroskopi imaging giver mulighed for tælling af celler, som constitutively udtrykker en fluorescerende chimera af nukleare protein Histon 2B, i hver brønd af mikrotiterplade for at tage højde for potentielle ændringer i deres antal og giver mulighed for eventuel identifikation af forskellige cellepopulationer. Denne høj overførselshastighed assay er et kraftfuldt værktøj forventes at udvide vores forståelse af membran reparation mekanismer via screening for værten gener eller eksogent tilføjet forbindelser at kontrol plasmamembran lukning.

Introduction

Mammale celler kan mekanisk, osmotisk og biokemiske stress, hvilket resulterer i tab af plasma membran integritet. Uden hurtig og effektiv lukning, ville beskadigede celler hurtigt bukke under for programmeret eller nekrotisk død. Siden 1960 ‘ erne, har bestræbelser på at forstå den plasma membran genforsegling proces været motiveret af de ødelæggende konsekvenser forbundet med dens dysfunktioner. Faktisk, sygdomme som lemmer-bælte muskelsvind, diabetes og Chediak-Higashi syndrom er blevet forbundet med mangelfuld plasmamembran reparation på grund af mutationer i genet kodning dysferlin, produktion af avanceret glykering slutprodukter og defekter i den lysosomale menneskehandel regulator CHS1, henholdsvis1,2,3,4,5,6. Men til dato, vores forståelse af membran genforsegling er stadig begrænset7. Indledende undersøgelser har vist, at membranen genforsegling initieres af tilstrømningen af ekstracellulære Ca2 + gennem beskadigede plasmamembran8,9,10. Siden da har flere ikke-gensidigt eksklusive Ca2 +-afhængige mekanismer er blevet foreslået til at forsegle celler. Patch hypotese foreslår, at i nærheden af såret, intracellulære vesikler fuse med hinanden og de beskadigede plasma membran til at fungere som en patch11,12,13,14. En anden model foreslår at calcium-afhængige exocytose af lysosomer på såret site frigiver lysosomale enzym syre sphingomyelinase, som konverterer sphingomyelin til ceramid i den ydre folder af plasmamembran. Denne pludselige ændring i lipid sammensætning resulterer i ceramid-drevet endocytose af beskadigede region15,16,17. Endelig, den tredje foreslåede ordning indebærer en rolle ved endosomal sortering komplekse kræves for transport (ESCRT) til at fremme dannelsen af vender udad blærer, der bud ud fra plasma membran18. Kun et begrænset sæt af proteiner var identificeret i disse modeller, og maskinerne skal blive yderligere belyst.

Her beskriver vi en høj overførselshastighed analyse, at foranstaltninger plasmamembran genforsegling effektivitet i vedhængende mammale celler udsat for skade medieret af rekombinante listeriolysin O (LLO)19. LLO er en poreformede toksin (PFT) udskilles af fakultativ intracellulære patogenet Listeria monocytogenes20,21,22 og tilhører MACPF/CDC (membran angreb kompleks, perforin, og kolesterol-afhængige cytolysin) superfamilien. MACPF er pattedyr poreformede proteiner involveret i immun forsvar, hvorimod CDCs er bakteriel toksiner primært produceret af Gram-positive patogener, der skader værtsceller til at fremme deres patogene livsstil23. CDCs er syntetiseres som vandopløselige monomerer eller dimerer, der binder til kolesterol i plasma membranen og oligomerize til en prepore kompleks med op til 50 underenheder. Prepore komplekse omarrangerer derefter for at indsætte β-tråde på tværs af lipid tolagede, danner en β-tønde pore, der strækker sig over 30-50 nm i diameter24,25,26,27.  Disse store porer tillade transport af ioner og små cellulære komponenter ind og ud af cellen. nogle undersøgelser har dog foreslået, at porerne i mindre størrelser er også dannet28,29,30. Blandt CDCs viser LLO unikke egenskaber herunder irreversibel pH – og temperatur-afhængige sammenlægning, som er befordrende for høj overførselshastighed analyser31,32. LLO kan føjes til cellekulturmedium på 4 ˚C, en eftergivende til sin binding til celler, men ikke til dannelsen af pore komplekse temperatur. Indledning af pore dannelse kan derefter synkroniseres ved at hæve temperaturen til 37 ˚C, giver mulighed for effektiv udbredelse af toksin molekyler i flyet af membran til form oligomerer og konformationelle remodeling involveret i pore generation. Derfor, efter parameteren i temperatur, den kinetiske af celleskader vil afhænge af mængden af toksin bundet til plasmamembran. Vigtigere, opløselige LLO (ikke bundet til plasmamembran) hurtigt og uigenkaldeligt aggregater når temperaturen når 37 ˚C, som letter behovet for at vaske væk ubundne toksin molekyler og begrænser omfanget af membran skader over tid. Endelig fordi LLO binder sig til kolesterol og danner porer i kolesterol-rige membraner, er denne analyse genstand for en bred vifte af pattedyrsceller. Det er vigtigt at huske på at LLO påvirker vært celle signalering primært via pore dannelse, med et par undtagelser i hvilke pore-uafhængig celle signalering kan forekomme33,34,35,36 ,37,38,39. Derfor kan det ikke være udelukket at LLO signalering aktiviteter kan påvirke processen med membran reparation.

Denne analyse vurderer direkte omfanget af celle såret ved at måle inkorporering af en celle impermeant fluorokrom (fx, propidium Iodid), passivt træder sårede celler og bliver stærkt fluorescerende når det associates med nukleinsyrer . Derfor, fluorokrom kan opretholdes i cellekulturmedium hele eksperimentet, giver mulighed for real-time analyser af celle såret. Fluorescens-intensiteten af nukleinsyre-bindende farvestof vil stige med koncentrationen af toksin og til en given koncentration af giftstof, vil stige over tid, indtil alle porer dannes, og cellerne er fuldt repareret eller mætning er nået. Tilstrømningen af ekstracellulære Ca2 + gennem membranen porer er en conditio sine qua non begivenhed for lukning. Derfor, den resealing effektivitet indirekte kan dokumenteres ved at sammenligne celle såret i dyrkningsmediet indeholdende Ca2 + (reparation eftergivende tilstand) til såret i en Ca2 +-gratis medium (reparation restriktivt forhold). Fordi fluorescens-intensiteten af nukleinsyre-bindende farvestof er direkte proportional med koncentrationen af celle i hver brønd, er det vigtigt at frø celler i de samme koncentration i alle brønde. Det er også vigtigt at optælle celler i hver brønd, før og efter analysen til at sikre, at cellen udstationering ikke forekommer, som flydende, aggregerede celler kan sløre fluorescens aflæsninger, hvilket kan komplicere data fortolkning. Hvis du vil optælle celler, blev celler, der udtrykker nukleare lokaliseret Histon 2B-normal god landbrugspraksis (H2B-NGL) brugt i denne analyse. Temperaturstyret, multi-mode, mikrotiterplade læsere kombinere hurtige, høj overførselshastighed målinger (ved hjælp af en 96 eller 384-godt plade format) af fluorescens intensiteter med mikroskopi billeddannelse af levende celler ved 37 ° C. Sidstnævnte kan bruges til at optælle celle nummer og observere den endelige dannelse af forskellige cellepopulationer.

I sidste ende, denne analyse giver brugerne mulighed for at udvide deres kendskab til kompleksiteten af membran reparation mekanismer ved screening for værten molekyler eller eksogent tilsat stoffer, der kan styre membran reparation. Følgende protokol beskriver de eksperimenterende trin til at måle resealing effektiviteten af celler udsat for LLO og evaluere virkningerne af et bestemt stof eller cellulære behandling på genforsegling effektivitet.

Protocol

1. forberedelse Celle PlatingBemærk: Menneskelige cervikal epitelceller, HeLa og HeLa udtrykker Histon 2B-normal god landbrugspraksis (H2B-NGL), blev brugt i denne protokol, men dette assay kan tilpasses til andre pattedyrceller19. Frigør vedhængende celler fra en 75 cm2 celle kultur kolben ved vask celler med 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Erstatte den anvendte trypsin med 2 mL frisk trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber celler på 37 ˚C i 5 min, indtil cellerne ha…

Representative Results

Celle tælle nøjagtighed: HeLa celler anvendes ofte som en model pattedyr cellelinie for at udforske membran reparations-mekanismer. Ved vurderingen af membran reparation på cellen befolkningsniveau, er det vigtigt at pladen celler i de samme koncentration i alle brønde for korrekte data fortolkning. Det er også vigtigt at kontrollere på tidspunktet for analysen, celle tal er tilsvarende på tværs af brønde. HeLa celler, der constitutively express Histon 2B smeltet til normal god l…

Discussion

Denne analyse måler effektiviteten af membran genforsegling på cellen befolkningsniveau med høj overførselshastighed kapacitet. Det kan bruges til at screene for cellulære komponenter eller narkotika biblioteker, der kan påvirke membran reparation. Beskrevet analysen anvendes en 96-brønd plade format, men det kan tilpasses til 384-godt plader for højere overførselshastighed. En fordel ved denne analyse er dens evne til at opnå fluorescens målinger af vedhængende levende celler i realtid uden brug af overdreve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) for venligst at lade os bruge hans multi-mode påvisning platform for nogle foreløbige eksperimenter. Forskning rapporteret i denne artikel blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme af National Institutes of Health under award nummer RO1AI107250 til Stephanie Seveau. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O’Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Plasma Membrane ResealingHigh-throughputHeLa Cells96-well PlateFluorescencePropidium IodideKinetic AssayPlate ReaderOptical ConfigurationRead ModeRead Type

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lam, J. G., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image