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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Abstract

Dans leur environnement physiologique, les cellules de mammifères souvent soumises à des contraintes mécaniques et biochimiques qui donnent lieu à des dommages de la membrane plasmique. En réponse à ces dommages-intérêts, les mécanismes moléculaires complexes refermer rapidement la membrane plasmique pour rétablir sa fonction de barrière et de maintenir la survie des cellules. Malgré les 60 ans de recherche dans ce domaine, il nous manque encore une compréhension approfondie de la cellule réapposition de sceau sur machines. Dans le but d’identifier les composants cellulaires que contrôle rescellement de membrane plasmique ou des médicaments qui peuvent améliorer la réapposition de sceau, nous avons développé un test haut débit basés sur la fluorescence qui mesure la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères cultivé en microplaques. Comme système modèle pour les dommages de la membrane plasmique, les cellules sont exposées à la listériolysine toxine bactérienne formant des pores O (LLO), qui forme la grande 30-50 nm de diamètre protéique pores en cholestérol contenant les membranes. L’utilisation d’un lecteur de microplaques de multimode thermorégulées permettant la spectrofluorométrie rapide et sensible des mesures en combinaison avec fond clair et imagerie de la microscopie de fluorescence des cellules vivantes. L’analyse cinétique de l’intensité de la fluorescence émise par un fluorochrome de l’acide nucléique-liaison imperméants membrane reflète l’étendue de la membrane blessant et refermer au niveau de la population des cellules, permettant le calcul de la cellule réapposition de sceau sur l’efficacité . Imagerie de la microscopie de fluorescence permet pour le dénombrement des cellules, qui constitutivement expriment une chimère fluorescente de la protéine nucléaire histone 2 b, dans chaque puits de la microplaque pour tenir compte des variations potentielles de leur nombre et permet éventuellement identification des populations cellulaires distincts. Ce test haut débit est un outil puissant devrait s’accroître notre compréhension des mécanismes de réparation de membrane par l’intermédiaire de dépistage des gènes hôtes ou exogène ajouté des rescellement de membrane plasmique ce contrôle.

Introduction

Les cellules de mammifères sont soumis à un stress mécanique, osmotique et biochimique, entraînant la perte d’intégrité de la membrane plasmique. Sans rescellement de rapide et efficace, les cellules endommagées succomberait rapidement à mort programmée ou nécrotique. Depuis les années 1960, les efforts pour comprendre la membrane plasmique rescellage processus ont été motivées par les conséquences dévastatrices, associés à ses dysfonctionnements. En effet, des maladies telles que la branche-Girdle Muscular Dystrophy, le diabète et le Syndrome de Chediak-Higashi ont été liés à déficient membrane plasmique réparation due à des mutations dans le gène codant dysferline, la production de produits de glycation avancée ainsi que les anomalies dans le régulateur de trafic lysosomal CHS1, respectivement1,2,3,4,5,6. Toutefois, à ce jour, notre compréhension de la membrane rescellage est encore limitée7. Les premières études ont démontré que la membrane rescellage est initiée par l’influx d’extracellulaire Ca2 + par le biais de la plasmalemme endommagés8,9,10. Depuis lors, plusieurs ne s’excluent Ca2 +-mécanismes dépendants ont été proposées pour refermer les cellules. L’hypothèse de patch propose que, à proximité de la plaie, vésicules intracellulaires fusionnent entre eux et la membrane plasmique endommagée d’agir comme un patch11,12,13,14. Un second modèle propose cette exocytose calcium-dépendante des lysosomes à la plaie site libère la Sphingomyélinase acide enzyme lysosomale, qui convertit la sphingomyéline en céramide dans le feuillet externe de la membrane plasmique. Ce changement soudain dans la composition lipidique entraîne axée sur le céramide endocytose de la région endommagée15,16,17. Enfin, le troisième mécanisme proposé implique un rôle pour l’endosomale tri complexes nécessaires au transport (ESCRT) promouvoir la formation de vésicules donnant sur l’extérieur qui bourgeonnent hors de la membrane plasmique18. Uniquement un ensemble limité de protéines a été identifié dans ces modèles, et leurs machines doit être davantage élucidé.

Nous décrivons ici un test haut débit qui la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères adhérentes soumise à endommager des mesures médiées par recombinaison listériolysine O (LLO)19. LLO est une toxine en formant des pores (PFT) sécrétée par le pathogène intracellulaire facultatif Listeria monocytogenes20,21,22 et appartient à la MACPF/CDC (complexe d’attaque membranaire, la perforine, et super-famille cytolysine cholestérol-dépendante). MACPF sont formant des pores mammifères protéines impliquées dans les défenses immunitaires, tandis que les CDC est des toxines bactériennes principalement produites par des agents pathogènes Gram-positifs qui endommagent les cellules de l’hôte pour promouvoir leurs modes de vie pathogènes23. CDCs sont synthétisées sous forme de monomères solubles dans l’eau ou les dimères qui se lient au cholestérol présent dans la membrane plasmique et oligomerize en un complexe prepore des sous-unités jusqu'à 50. Le complexe prepore réarrange ensuite pour insérer les brins β à travers la bicouche lipidique, formant un pore de β-canon qui s’étend sur 30-50 nm de diamètre24,25,26,27.  Ces grands pores permettent un flux d’ions et de petites composantes cellulaires dans et hors de la cellule ; Cependant, certaines études ont proposé que les pores de plus petites tailles sont également formé28,29,30. Entre les CDC, LLO affiche des propriétés uniques, y compris l’agrégation irréversible et température-dépendante du pH, qui est propice à des analyses de haut débit31,32. LLO peut être ajouté au milieu de culture cellulaire à 4 ° c, une température permissive à sa liaison à des cellules, mais pas à la formation du pore complexe. Ouverture de la formation de pores est synchronisable puis en augmentant la température à 37 ° c, permettant la diffusion efficace des molécules de la toxine dans le plan de la membrane d’oligomères de forme et pour le remodelage conformationnelle impliqués dans la génération de pore. C’est pourquoi, suite à l’interrupteur de température, la cinétique des dommages cellulaires dépendra de la quantité de toxine liée à la membrane plasmique. Ce qui est important, LLO soluble (non lié à la membrane plasmique) rapidement et irréversiblement agrégats lorsque la température atteint 37 ° c, ce qui diminue le besoin d’évacuer les molécules de la toxine non lié et limite l’étendue des dégâts de la membrane au fil du temps. Enfin, parce que LLO se lie au cholestérol et forme des pores dans les membranes riches en cholestérol, ce dosage est favorable à une large gamme de cellules de mammifères. Il est important de garder à l’esprit que LLO affecte la cellule hôte signalisation principalement via la formation de pores, à quelques exceptions près dans quelle cellule indépendante du pore de signalisation peut se produire33,34,35,36 ,37,38,,39. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que LLO activités peuvent influer sur le processus de réparation de membrane de signalisation.

Ce test évalue directement l’étendue de la cellule blessant en mesurant l’incorporation d’un fluorochrome imperméants cellulaire (p. ex., l’iodure de propidium) qui pénètre les cellules blessées passivement et qui devient très fluorescent une fois qu’il associe à des acides nucléiques . Par conséquent, le fluorochrome peut être maintenu dans le milieu de culture cellulaire pendant toute l’expérience, ce qui permet des analyses en temps réel des cellules blessant. L’intensité de la fluorescence du colorant acide nucléique-liaison augmente avec la concentration de la toxine et, pour une concentration donnée de toxine, augmentera au fil du temps jusqu'à ce que tous les pores sont formés, et les cellules sont entièrement réparés ou jusqu'à ce que la saturation est atteinte. L’afflux d’extracellulaire Ca2 + à travers les pores de la membrane est un événement de la condition sine qua non pour refermer. Par conséquent, l’efficacité de fermeture peut être indirectement attestée en comparant la cellule blessant dans le milieu de culture contenant du Ca2 + (condition permissive de réparation) à blessant d’un Ca2 +-milieu dépourvu (condition restrictive de réparation). Parce que l’intensité de la fluorescence de la teinture de liaison de l’acide nucléique est directement proportionnelle à la concentration cellulaire dans chaque puits, il est important de cellules des graines à la même concentration dans tous les puits. Il est également important d’énumérer des cellules dans chaque puits avant et après le test pour s’assurer que le détachement de cellules ne se produit pas, comme flottant, cellules agrégées peuvent masquer des lectures de fluorescence qui peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour énumérer des cellules, les cellules exprimant l’histone nucléaire localisé 2 b-GFP (H2B-GFP) ont été utilisées dans ce test. Température contrôlée, multimode, lecteurs de microplaques allient des mesures rapides et à haut débit (à l’aide d’un format de plaque 96 ou 384 puits) d’intensités de fluorescence avec imagerie microscopie des cellules vivantes à 37 ° C. Ce dernier peut être utilisé pour énumérer le nombre de cellules et observer la formation éventuelle de populations cellulaires distincts.

En fin de compte, ce test offre aux utilisateurs la possibilité d’approfondir leur connaissance de la complexité des mécanismes de réparation de membrane de dépistage pour les molécules de l’hôte ou réparer des composés exogène qui peuvent contrôler la membrane. Le protocole suivant décrit les étapes expérimentales afin de mesurer l’efficacité de fermeture des cellules exposées à la LLO et évaluer les effets d’un médicament ou un traitement cellulaire sur l’efficacité de fermeture.

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Protocol

1. préparation

  1. Placage de cellule
    Remarque : Donner naissance à des cellules épithéliales humaines du col utérin, HeLa et HeLa exprimant Histone 2 b-GFP (H2B-GFP), ont été utilisés dans le présent protocole, mais ce test peut être adapté aux autres cellules mammaliennes19.
    1. Détacher les cellules adhérentes d’un flacon de culture cellulaire 75 cm2 de laver les cellules avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacez la trypsine utilisée par 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA fraîches.
    2. Incuber les cellules à 37 ° c pendant 5 min jusqu'à ce que les cellules ont arrondi et détaché de la fiole.
    3. Remettre en suspension les cellules de 8 mL de milieu de culture (DMEM contenant 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine).
    4. Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et 10 µL de suspension cellulaire.
    5. Diluer les cellules dans un milieu de croissance à une concentration de 2, 5 x 105 cellules/mL.
    6. Versez la suspension cellulaire dans un bassin de pipette stérile et mélanger soigneusement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    7. À l’aide d’une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, distribuer les cellules HeLa (2,5 x 104 cellules/100 µL/puits) en trois exemplaires (ou quatre exemplaires) dans une plaque de culture de tissus traités en polystyrène fond plat de 96 puits, clair, noir.
      Remarque : Un arrangement de placage est présenté comme un exemple à la Figure 1.
    8. La culture des cellules pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire humidifiée à 37 ° c et 5 % de CO2.
  2. Préparation de la Solution mère
    1. Préparer 1 L d’un stock de 10 x de tampon M (utilisé pour préparer des M1 et M2) en ajoutant 95 g de Hanks Solution saline équilibrée, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) et g 23,83 de HEPES (100 mM) à 900 mL d’eau. Ajuster le pH à 7,4 et augmenter le volume à 1 L. filtre stériliser.
    2. Préparer 50 mL de 50 x (1,25 M) stock de glucose en ajoutant 11,26 g de D-(+)-Glucose à un total de 50 mL d’eau. Filtre de stériliser la solution.
    3. Préparer 50 mL d’un 100 x stock (120 mM) de calcium en ajoutant 0,666 g de CaCl2 pour un total de 50 mL d’eau. Filtre de stériliser la solution.
    4. Préparer 50 mL d’un 10 x stock (50 mM) de l’éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', acide tétraacétique (EGTA) en ajoutant 0,951 g de EGTA à 40 mL d’eau. Augmenter le pH à 8 à l’aide de NaOH pour dissoudre l’EGTA, puis augmentez le volume à 50 mL. Filtre de stériliser la solution.
    5. Pour une seule plaque 96 puits, préparer 50 mL de milieu 1 (M1, contient Ca2 +), 50 mL de milieu 2 (M2, Ca2 +-libre) et 15 mL de moyen 2 additionné de EGTA, en conséquence :
      1. Pour M1, ajouter 5 mL de 10 x M de tampon, 0,5 mL de 100 x CaCl2et 1 mL de glucose de x 50 à 43,5 mL d’eau.
      2. Pour M2, ajouter 5 mL de 10 x M de tampon et 1 mL de glucose x 50 à 44 mL d’eau.
      3. Pour M2/EGTA, ajouter 1,5 mL de 10 x M de tampon et 1,5 mL de 10 x EGTA à 12 mL d’eau.
        Remarque : Toutes les solutions contenant de l’iodure de propidium (PI) doivent être préparées directement avant de les ajouter aux cellules.
  3. Plaque Reader/imagerie cytomètre en paramètres
    Remarque : Utilisez un lecteur de plaque multimodes équipé de deux unités de détection : un spectrofluorimètre et un cytomètre en imagerie. Limiter l’exposition de fluorescence pour éviter le Photoblanchiment les fluorophores.
    1. Réchauffez le lecteur de plaque à 37 ° C avant d’effectuer le test.
    2. Définir les paramètres pour l’analyse de la cinétique en conséquence dans le mode de réglage :
      1. Choisir le monochromateur, FL (fluorescence)et cinétique pour la configuration optique, modes de lire et lire type, respectivement.
      2. Sous Paramètres de longueur d’onde, sélectionnez un 9 et 15 nm d’excitation et d’émission passe-bande, respectivement. Pour les tests à l’aide de l’iodure de propidium (PI), définissez la longueur d’onde d’excitation et d’émission à 535 et 617 nm, respectivement.
      3. Sous Type de plaque, sélectionnez 96 puits pour le format de la plaque et une configuration préréglée plaque correspondant à une plaque de fond clair noir-mur.
      4. Sous la Zone de lecture, mettez en surbrillance les puits qui seront analysés tout au long de la cinétique.
      5. PMT et optique, présélection les clignotements à la lecture à 6 et cochez la case lecture du fond.
      6. Sous calendrier, ajouter 00:30:00 dans la zone de Temps d’exécution Total pour un dosage de cinétique de 30 min et 00:05:00 pour l' intervalle.
        Attention : À chaque fois d’orienter et d’une longueur d’onde, le temps de lecture d’une plaque 96 puits complet est de 30 s.
      7. Confirmer les paramètres spécifiés dans les Paramètres d’informations vers la droite, puis sélectionnez OK. Appuyez sur lecture pour initier la cinétique exécuter.
    3. Définir les paramètres d’imagerie en conséquence dans le mode de réglage :
      1. Choisissez Minimax, d’imagerieet des manifestations pour la configuration optique, modes de lire et lire type, respectivement.
      2. En vertu de longueurs d’onde, sélectionnez diascopieet une ou les deux les cases de fluorescence correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 456/541 nm (GFP) et 625/713 nm (PI).
      3. Utilisez les mêmes options pour le Type de plaque et de la Zone de lecture tel que défini aux étapes 1.3.2.3 et 1.3.2.4.
      4. Sous Bien des paramètre de zone, sélectionnez le nombre de sites dans un puits à être photographié.
        Remarque : 12 sites correspondent à une image plein-puits.
      5. Avec les Réglages d’Acquisition Image, sélectionner les temps d’exposition par lumière transmise, 541 (GFP) et 713 (PI). Pour GFP, image de l’ensemble du bien avec un temps de pose de 20 ms/image. Pour transmettre lumière (TL) et la fluorescence de la PI, acquérir une image unique du centre de chaque puits avec des temps d’exposition de 8 à 20 ms, respectivement.
      6. Confirmer les paramètres spécifiés dans les informations de paramètres à droite, puis sélectionnez OK. Le temps d’acquisition des images de la totalité de la surface de chaque puits (12 images/puits) d’une plaque 96 puits et d’une longueur d’onde est environ 15 min. Appuyez sur lire pour initier l’imagerie.
        Remarque : Le temps d’acquisition d’un seul image/puits d’une plaque 96 puits nécessite ~2.5 min/plaque pour une longueur d’onde. Les paramètres décrits ci-dessus correspondent à l’équipement spécifique dans notre laboratoire. Spectrofluorométrie mesures : une lampe flash xénon affichant 1,0 nm incrément excitation longueurs d’onde (250 à 850 nm) avec un passe-bande réglable de nm 9 ou 15, un détecteur de tube photomultiplicateur avec un > 6 log gamme dynamique et une émission réglable à 15 ou 25 nm passe-bande. Cytomètre d’imagerie : une source de lumière éclairage capable de lumière blanche, 460 nm et 625 longueurs d’onde excitation nm avec un 20 nm passe-bande, filtres d’émission centrées à 541 nm (108 nm bandpass) et 713 nm (passe-bande de 123 nm), respectivement, et un objectif 4 X couplé à un 1,25 dispositif à couplage de charge 12-bit mégapixels.

2. Mode operatoire

Remarque : Au moment du test, les cellules doivent être confluente de 70 à 90 %. Au cours des étapes de lavage, le support doit être retiré et appliqué à la paroi latérale du puits (pas directement au-dessus des cellules). Maintenir la température de LLO à < 4 ° c pour empêcher son agrégation jusqu'à l’étape 3.1.5.

  1. Préparation d’un stock de 30 µM PI en M1 et un stock de 30 µM PI en M2 préchauffée à 37 ° c.
  2. Laver délicatement les cellules de la plaque 1 à une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, comme suit :
    1. Conditions de réparation-permissive, enlevez le milieu de croissance et laver que les cellules deux fois avec 200 µL/puits M1 préchauffées à 37 ° c. Remplacez le support par 100 µL/puits de M1 chaud contenant 30 µM PI.
    2. Pour réparer des conditions restrictives, enlevez le milieu de croissance et laver les cellules une fois avec 200 µL/puits chaud M2 contenant 5 mM EGTA de chélater Ca2 +, suivie d’un lavage avec 200 µL/puits M2. Remplacer le support avec 100 µL/puits chaud M2 contenant 30 µM PI.
    3. Après que le milieu de culture a été lavé et remplacé avec un milieu contenant de l’iodure de propidium, passer directement à l’étape 2.1.3.
  3. Plaque image 1 sous lumière transmise, GFP et PI comme indiqué sous 1.3.3 (pré cinétique). Cette étape prend 15-20 min.
  4. Pendant la période de 15 min à l’étape 2.1.3, préparer la plaque 2 à l’aide une micropipette multicanaux-12 et 200 µL conseils comme suit :
    1. Placer une microplaque en polypropylène fond rond 96 puits sur la glace. Configurer la plaque à l’aide d’un dispositif expérimental correspondant à la plaque 1 (Figure 1).
    2. Conditions de réparation-permissive, ajouter 100 µL/puits de M1 glacée contenant 60 µM PI, suivie de l’addition de 100 µL/puits de M1 glacée contenant 4 x LLO ou pas pour le contrôle.
    3. Pour des conditions restrictives pour réparation, ajouter 100 µL/puits de M2 glacée contenant 60 µM PI, suivie de l’addition de 100 µL/puits de M2 glacée contenant 4 x LLO ou pas pour le contrôle.
  5. Après immédiatement l’imagerie plaque 1 (étape 2.1.3), placez-le sur la glace, à l’aide de papier d’aluminium pour séparer la plaque de contact direct avec la glace. Laissez la plaque 1 se refroidir pendant 5 min.
  6. À l’aide d’une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, transférer 100 µL de chaque puits dans plaque 2 (étape 2.1.4) aux puits correspondants à la plaque 1. Afin de répartir correctement la toxine dans les médias de la plaque 1, insérer les pointes sous le ménisque et le volume d’éjection doucement sans introduire des bulles.
    Remarque : Ne pas pipeter haut et en bas, comme cela peut détacher par inadvertance les cellules.
  7. Laisser la plaque pour une 1 min supplémentaire permettre à la toxine de lier aux cellules et immédiatement transférer plaque 1 dans le lecteur de plaque pour le test cinétique utilisant le mode spectrofluorimètre (étape 1.3.2).
  8. À la fin de l’essai cinétique, immédiatement image plaque 1 (études cinétiques) à l’aide étape 1.3.3.

3. analyse : Numération des lymphocytes

  1. Déterminer le nombre d’éléments basé sur la fluorescence nucléaire en utilisant le logiciel d’énumération cellule microplaque.
    1. Dans paramètres, sélectionnez Re-analyseet sous la section de catégorie dans les Paramètres de l’analyse d’Image , sélectionnez L’analyse objet discret en utilisant 541 comme la longueur d’onde pour trouver des objets.
    2. Au sein de l’option de trouver des objets, en utilisant le s’inspirent d’Images recherche méthode, sélectionnez noyaux sous l’onglet paramètres, puis appuyez sur appliquer.
    3. Appuyez sur OK et lecture pour lancer la cellule algorithme de comptage.
  2. Si aucun de ce outils n’est disponible, utiliser un logiciel d’analyse image comme ImageJ pour énumérer les cellules.
    1. Dans ImageJ, ouvrez le fichier de l’image comme une pile.
    2. Convertir la pile d’images niveaux de gris 8 bits en cliquant sur Image dans la barre de menu, survolez de Type, puis sur 8 bits.
    3. Soustraire le fond : cliquez sur l' Image dans la barre de menu, survolez Adjustet sélectionnez Luminosité/contraste. Ajuster la valeur minimale pour supprimer le bruit de fond et sélectionnez appliquer.
    4. Seuil pour créer des images binaires : cliquez sur l' Image dans la barre de menu, survolez Adjust, puis sélectionnez le seuil. Sélectionnez arrière-plan sombre, ajuster les seuils minimum et maximum et cliquez sur appliquer.
    5. En cas de cumul des noyaux, un outil de bassin hydrographique peut servir aux noyaux de segment. Cliquez sur processus dans le menu, survolez binaire et sélectionnez des bassins versants.
      Remarque : Cela se détachera automatiquement connectés noyaux.
    6. Analyser les images masqués par l’application des critères spécifiés par l’utilisateur (taille et circularité) pour affiner l’identification des noyaux et exclure les débris cellulaires.
      1. Cliquez sur analyser dans le menu, puis sur analyser les particules. Définir la taille désirée (pixel ^ 2) et circularité (une valeur de 1 est un cercle parfait) cuisinières qui sont suffisantes pour inclure les cellules/noyaux individuels.
      2. Dans la zone de liste déroulante Afficher, sélectionnez les ou les options désirées, vérifier les résumeret cliquez sur OK pour obtenir le nombre de cellules.

4. analyse : Courbes cinétiques

  1. Transférer les données cinétiques du logiciel de lecteur de plaque à un logiciel d’analyse de données.
  2. Pour chaque condition expérimentale, en moyenne les intensités de fluorescence des répliques à chaque validant, ainsi que l’écart-type correspondant et l’écart-type de la moyenne pour chaque condition expérimentale.
  3. Pour chaque condition expérimentale, tracer la courbe cinétique correspondante : intensité de PI (axe y) par rapport au temps (axe des x).
  4. Pour calculer l’efficacité de fermeture d’une condition de traitement donnée, calculer l’aire sous la courbe (ASC) de la + LLO en M1 (AUC(M1)) et + LLO en M2 (AUC(M2)). Utiliser l’approche suggérée ci-dessous afin d’évaluer l’efficacité (E) d’étanchement :
    Equation
  5. Effectuez une comparaison entre contrôle et essai de traitement en déterminant le coefficient d’efficacité (REff) indiqués ci-après :
    Equation 2
    REFF = 1, test traitement n’a aucun effet sur la réparation
    REFF < 1, test traitement inhibe la réparation
    REFF > 1, test traitement améliore la réparation
  6. Calculer l’aire sous la courbe à l’aide de l’équation suivante :
    Equation 3, où k est le nombre total des suivis.

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Representative Results

Précision de comptage de cellules : les cellules HeLa sont fréquemment utilisés comme une ligne de cellules de mammifère modèle explorer les mécanismes de réparation de membrane. Lors de l’évaluation de réparation de la membrane au niveau de la population des cellules, il est important de cellules de la plaque à la même concentration dans tous les puits pour l’interprétation des données appropriées. Il est également important de vérifier au moment de l’essai que nombre de cellules est équivalent dans l’ensemble de puits. Des cellules HeLa exprimant constitutivement histone 2 b fusionnée à la GFP (H2B-GFP) ont été introduits dans ce dosage pour énumérer automatiquement les cellules basées sur la détection de leurs noyaux fluorescent. Pour établir l’exactitude dans la numération des lymphocytes, double dilutions en série des cellules HeLa H2B-GFP ont été cultivées en trois exemplaires dans une plaque à 96 puits et cultivées pendant 4 h. Ce laps de temps est suffisant pour la fixation des cellules et prévoit de limiter la division cellulaire. Pleins puits ont été imagées sous lumière transmise (TL) et illuminations de fluorescence GFP et du nombre de cellules ont été évalué basée sur GFP fluorescence en utilisant le logiciel d’analyse des lecteur de plaque (Figure 2 a et 2 b). Le chefs d’accusation ± écart type moyen de cellules a été comploté contre cell ensemencement des concentrations, et une ligne de régression indiquée un rapport de 1.08:1 du comte de cellule à cellule de semis, ce qui démontre l’exactitude de la comptabilisation (Figure 2). Tous les puits avant un test cinétique Imaging, elle peut être assurée que le nombre de cellules correspondent parmi tous les puits. En outre, par imagerie puits après le test cinétique, on peut établir si l’exposition à la toxine a causé détachement cellulaire.

Expression de la GFP n’interfère pas avec les mesures d’intensité de l’iodure (PI) propidium (IPI) : pour s’assurer que l’association nucléaire H2B-GFP n’interfère pas avec incorporation de PI ou PI fluorescence intensité mesure (IPI), j’aiPI a été comparée dans les cellules HeLa et HeLa H2B-GFP qui ont été exposés ou non, à 1 nM LLO (Figure 3). En l’absence de PI, il y avait un niveau de fluorescence de fond en HeLa et HeLa H2B-GFP, indiquant que GFP ne pas déteigne PI fluorescence d’émission filtres de même faible. En présence de PI, mais absence de LLO, il y avait une semblable émission de fluorescence basale PI en HeLa et HeLa H2B-GFP qui n’ont pas changé au fil du temps. Cela a confirmé qu’expression de GFP n’affecte pas la mesure de la fluorescence de la PI et indiqué que PI ne pénètre pas les cellules non endommagée durant la période de l’expérience. Ajout de LLO a entraîné une augmentation de fluorescence de la PI au fil du temps qui était similaire dans les deux HeLa et HeLa H2B-GFP. Cette augmentation est due à cellule blessant par LLO combiné avec association de PI avec les acides nucléiques. Ensemble, ces résultats établissent qu’expression d’histone-2 b-GFP n’affecte pas la constitution de PI ou de mesure de la fluorescence.

Fluorescence de PI n’interfère pas avec le comptage cellulaire basé sur GFP : réciproquement, il est important de vérifier qu’incorporation nucléaire PI dans les cellules blessées n’interfère pas avec le comptage cellulaire basé sur GFP. Images de fluorescence représentatif de HeLa et HeLa H2B-GFP exposés à 1 nM LLO en présence de PI a montré qu’il y avait une accumulation marquée de PI dans les cellules blessées post cinétique, comme prévu (Figure 4 a). L’imagerie a également révélé que PI pourrait saigner par le biais de la détection par fluorescence GFP (Figure 4 a et tableau 1). Ce multisegment de fluorescence a été mieux apprécié sur les images études cinétiques des cellules HeLa qui n’expriment pas de GFP, mais affichent toujours verts fluorescents noyaux (Figure 4 a). Cette liaison pourrait également résulter de la mesure de l’intensité de la fluorescence GFP (IGFP) dans les cellules HeLa H2B-GFP, qui a considérablement augmenté après cinétique par rapport à la cinétique (Figure 4 b). Ce qui est important, crossover de fluorescence PI n’affecte pas de comptage de cellules parce que le processus de segmentation impliqué dans l’énumération des noyaux n’est pas affecté par l’augmentation de la fluorescence GFP (Figure 4).

Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité de la mesure : dans cette section, nous présentons la méthodologie de base utilisée pour mesurer l’efficacité de la membrane réapposition de sceau. Pour preuve le processus de membrane réapposition de sceau, cellules HeLa H2B-GFP ont été exposés, ou non, à 1 nM LLO en présence (M1) ou absence (M2) d’extracellulaire Ca2 + (Figure 5). Comme prévu, en l’absence de LLO, j’aiPI est demeurée constante en M1 et M2. Ajout de LLO dans Ca2 +-contenant le support a entraîné une augmentation constante dans l’intensité de la fluorescence PI (IPI), alors qu’en l’absence d’extracellulaire Ca2 +, il y avait une augmentation significativement plus raide de fluorescence de la PI, ce qui reflète la absence de membrane réapposition de sceau. Pour évaluer l’efficacité de fermeture, qui est définie comme la capacité des cellules à réparer en M1 par rapport au M2 (étape 1.5.4.1), la zone située sous les courbes de M1 et M2 (AUC) ont été déterminées et l’efficacité de la réparation (E) a été évaluée à 0,287.

Une alternative à la PI : PI a été utilisé de façon ubiquitaire comme marqueur des dommages de la membrane plasmique. Cependant, il y a des autres colorants de liaison d’acide nucléique qui conviennent également pour ce dosage. Par exemple, une liaison de l’acide nucléique membrane carbocyanine imperméants teindre les expositions (CNABD) un spectre d’émission dans le rouge sombre et a une grande spécificité pour l’ADN bicaténaire. PI en revanche lie l’ADN et l’ARN de40,41. Contrairement à la PI, l’excitation et les spectres d’émission de CNABD ne se chevauchent pas avec ceux de GFP permettant une meilleure résolution spectrale entre les deux fluorochromes. En outre, le CNABD utilisé dans le présent protocole a un coefficient d’extinction presque deux fois celui du PI, ce qui signifie que pour leurs longueurs d’onde d’excitation respectifs, ce colorant est plus capable d’absorber l’énergie que PI, ce qui entraîne une plus forte émission de fluorescence. Analyse quantitative de fluorescence des images CNABD et GFP a montré que ce colorant présente une gamme dynamique de fluorescence grand, n’émet pas significativement dans les longueurs d’onde de fluorescence GFP et n’affecte pas le nombre de cellules (Figure 6 a-D). En effet, les cellules HeLa H2B-GFP incubés dans des milieux M1 ou M2, contenant CNABD et endommagé par 1 nM LLO montrent une 4 et 5.5 fois augmentation j’aiCNABD par rapport à des contrôles non endommagés, respectivement (Figure 7 a). À titre de comparaison, les cellules exposées à 1 nM LLO en présence de PI présentait une augmentation de 2,5 et 3 fois dans l’intensité de fluorescence de PI en M1 et M2, respectivement (Figure 5). Comme PI, CNABD expositions, augmentant l’intensité de fluorescence avec augmentation de la concentration de la LLO en M1 (Figure 7 a), et l’efficacité de réparation qui en résulte a été calculée comme indiqué au point 1.5.4.1 (Figure 7 b). Nous rapportent que la cellule rescellage efficacité diminue lorsque LLO concentration augmente. Ce phénomène tient au fait que les cellules diminuent leur capacité à se refermer lorsque les dommages-intérêts excessifs sont causés.

Évaluation de la qualité de l’essai de réparation de membrane : un aspect essentiel de toute analyse est sa robustesse ou la capacité de détecter et de résoudre les différences entre les contrôles positifs et négatifs. Signal de variation entre les contrôles positifs et négatifs doit afficher la reproductibilité et une gamme dynamique suffisante. Dans cet essai de réparation de membrane, les contrôles positifs et négatifs sont des cellules exposées à LLO en réparation-permissive (M1) et les conditions de réparation-restrictives (M2), respectivement. Deux approches ont été prises pour évaluer la robustesse de ce test d’analyse de haut-débit. Tout d’abord, le facteur Z, ou dépistage coefficient de fenêtre détermine si un ensemble donné de conditions fournit un grand assez dynamique, tout en tenant compte de la variabilité du signal. Z-facteurs dans la fourchette 0 < Z ≤ 0,5 et 0,5 < Z ≤ 1 correspondent à un dosage acceptable et très bons, respectivement42,43. Une limitation de l’utilisation du facteur Z pour l’évaluation de la qualité, c’est que les conditions testées présentent généralement des valeurs plus modérées par rapport aux contrôles positifs et négatifs extrêmes. Par conséquent, dans une seconde approche, nous avons calculé la différence moyenne strictement normalisée (SSMD, β), qui permet d’identifier les différences entre les conditions expérimentales qui seraient autrement considérées comme un résultat négatif, basé sur un facteur Z qualifié44 ,,45. Les valeurs SSMD peuvent être classés en force effet allant d’aucun effet (β = 0) à très fort (β ≥ 5). En utilisant les données de la Figure 7 a et AUC pour comparaison de M1 / M2 conditions, exposition à 0,25 et 0,5 nM LLO produit des valeurs de Z-facteur de 0.3100813 et de 0.137313 et β = 6.0672 et 4.803308, respectivement, ce qui indique qu’une fenêtre de concentrations de LLO est convient pour le dosage. Lorsque la concentration de LLO augmente au-delà de 1 nM, l’écart dans l’ICNABD courbes cinétiques entre M1 et M2 conditions ferme résultant en valeurs facteur Z et SSMD drastiquement réduites (Figure 7 b). Ces fortes concentrations de LLO correspondent aux conditions dans lesquelles le potentiel de réparation est compensé par des lésions et donc nie l’utilisation du test dans l’identification des facteurs intervenant dans la réparation de la membrane. C’est encore illustrée par la baisse d’efficacité de réparation (E) comme les augmentations de concentration de LLO (Figure 7 b). Toutes les données (facteur Z, SSMD et E) ont été générées avec 3 répétitions biologiques et techniques 3 répétitions par les conditions expérimentales pour la validation du test. Ensemble, ces résultats montrent que ce test a la robustesse attendue pour un dosage de haut débit avec des concentrations de LLO inférieures à 1 nM pour les cellules HeLa.

Preuve de principe : une fois que la robustesse de l’essai a été mis en place, nous avons effectué des expériences additionnelles comme une preuve du principe que ce test a la sensibilité et la résolution d’identifier un défaut dans le processus de réparation. En outre, nous avons considéré que les dosages de haut-débit sont utilisés comme un processus de sélection afin d’identifier les « hits » au sein de grands écrans, qui peuvent comporter le moins de 3 biologique réplique. Ainsi, il est pertinent que le protocole expérimental fournit la puissance de détection pour identifier les « hits » au sein d’un seul essai. Par conséquent, sous un écran de haut débit, la mise en page de test est réglable pour accueillir 4 répétitions techniques pour augmenter la puissance statistique dans une expérience simple. Les cellules ont été cultivées en quatre exemplaires et ont été traités au préalable 1 h avant le test avec de la désipramine, un inhibiteur pharmacologique de la Sphingomyélinase acide lysosomale protéine (ASM) qui joue un rôle dans la membrane plasmique réparation15,17 ,46. Ce qui est important, traitement avec de la désipramine n’affecte pas les globules tout au long de l’essai, ce qui permet une comparaison appropriée entre les cellules de désipramine traitées et non traitées (Figure 8 a). L’inhibition de l’ASM dans les cellules traitées désipramine a entraîné un vice de membrane rescellage d’efficacité lors de l’exposition à la LLO, comme en témoigne la diminution E et REff (Figure 8 b et 8c). À l’aide d’un modèle à effets mixtes, une comparaison de désipramine traités aux cellules non traitées exposées à 0,25 et 0,5 nM LLO en M1 a montré des p-valeurs de 0,0010 et 1 x 10-10, respectivement. Ensemble, les données indiquent que 0,25 et 0,5 nM LLO sont des concentrations appropriées pour identifier les défauts de réparation dans un cadre expérimental de haut débit, avec des analyses statistiques possibles d’une expérience unique, une fois les répétitions techniques sont portées à quatre . Notez que l’approche statistique du modèle des effets mixtes entre quatre exemplaires ne ne tient pas compte des variations possibles à travers de multiples répétitions biologiques. Toute constatation importante en utilisant un réplicat biologique doit être vérifiée en paramètres expérimentaux supplémentaires.

Figure 1
Figure 1 : modèle expérimental. Le diagramme de flux représente une conception de plaque représentant configurée pour vérifier l’effet de sept conditions d’essai par rapport aux cellules de témoins non traités. Il faudrait des contrôles supplémentaires le cas échéant, en ce qui concerne les véhicules de drogue exemple. Les cellules sont plaquées (1) 24h avant l’expérience de la plaque. Le jour de l’expérience, cellules en plaque 1 sont lavés avec un M1 ou M2 moyen préchauffé à 37 ° C, et la plaque est imagé (fluorescence TL, GFP et PI) des cinétiques. Durant les 15 min de réactifs d’imagerie, sont ajoutées sur la glace jusqu'à la tôle de 2. Après l’imagerie, plaque 1 est placé immédiatement sur la glace pendant 5 min et 100 μL/puits sont transférés de la plaque 2 à 1 sur plaque. Plaque 1 est placée dans le lecteur de plaque pour exécuter le test cinétique à 37 ° C pendant 30 min, suivie d’imagerie (fluorescence TL, GFP et PI). Les données sont ensuite analysées pour compter les cellules et d’évaluer l’efficacité de la réparation dans toutes les conditions expérimentales. Dans les grands ensembles de données, l’analyse peut être automatisée. En outre, le nombre de réplicats techniques peut être augmenté à 4 dans les écrans de haut débit. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : cellule comptage exactitude. Les cellules HeLa exprimant Histone GFP-étiquetée 2 b ont été ensemencées dans réanalysés à concentrations indiquées. (A) les cellules ont été photographiés à 37 ° C, sous lumière transmise (TL) et la fluorescence GFP (12 images/puits) et un algorithme de détection de cellules a été utilisé pour délimiter les noyaux individuels (en violet). Echelle = 1 mm. (B) un grossissement supérieur de TL, GFP et cellule detection (violet) images (avec zoom 2 X). Echelle = 100 μm. (C) Image logiciel d’analyse a été utilisé pour compter le nombre de cellules et la cellule comtes ont comploté contre la première cellule concentration semie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : mesure de fluorescence Propidium iodure n’est pas affectée par l’expression de 2 b-GFP Histone. Histone 2 b-GFP exprimant et non exprimant les cellules HeLa ont été exposés, ou non, à 1 nM LLO en présence (lignes pleines) ou absence (lignes pointillées) de 30 μM PI Ca2 +-contenant le support (M1). L’analyse cinétique a mesuré les intensités de fluorescence PI par spectrofluorométrie toutes les 5 min pendant 30 min à 37 ° C. Les données sont la moyenne PI intensité de fluorescence (IPI) exprimée en unités (RFU) de fluorescence relative ± SEM (n = 3 expériences indépendantes, chacune réalisées en géométrie). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : numération des cellules n’est pas affectée par la fluorescence PI. (A) préalables- et post-cinétiques images représentatives (TL, PI et GFP) des cellules exposées ou non, à 1 nM LLO dans M1. Echelle = 100 μm. (B) analyse de la microscopie de fluorescence quantitative (j’aiGFP± SEM) a révélé la mesure de fluorescence GFP accrue en raison de l’incorporation nucléaire PI sur cellule blessant de LLO (études cinétique). Numération des lymphocytes axée sur la GFP (C) n’est pas affectée par l’augmentation de l’intensité de la GFP. Nombre de cellules par puits a été exprimée en moyenne ± SEM. (en B et c : noire = données pré cinétiques ; barres rouges = données études cinétiques ; n = 3 expériences indépendantes, chacune jouée dans réanalysés ; un bilatéral test de Student t-a été utilisé pour l’analyse quantitative fluorescence intensité et cellule le nombre d’images acquises, ** p < 0,01). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité de la mesure. Cellules HeLa exprimant de histone 2 b-GFP ont été exposés, ou non, à 1 nM LLO de Ca2 +-contenant (M1) ou Ca2 +-milieu (M2) sans contenant 30 μM PI. Données cinétiques représentent l’intensité de la fluorescence PI (IPI) en fluorescence relative unités (RFU) ± SEM, mesurée pendant 30 min à 37 ° C. n = 3 expériences indépendantes, chacune réalisées en géométrie. La fermeture de l’efficacité a été mesurée comme il est indiqué à l’étape de protocole 1.5.4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : liaison colorant comme un colorant alternatif pour évaluer la membrane rescellage d’acide nucléique Carbocyanine. Les cellules HeLa H2B-GFP ont été exposés, ou non, à 0,5 nM LLO pendant 30 min à 37 ° C en présence de 1 μM CNABD de Ca2 +-contenant (M1) ou Ca2 +-un milieu sans (M2). (A) cellules Images de HeLa H2B-GFP ont été acquises en pré- et post-cinétique en M1 contenant le colorant. Echelle = 100 μm. Intensités de fluorescence CNABD intégré et GFP (B et C) ont été mesurées à l’aide de l’imagerie cytomètre et exprimée en unités de fluorescence relative (RFU) ± SEM. images de fluorescence GFP (D) ont été traitées pour énumérer HeLa H2B-GFP cellules (noire = barres de données préalablement cinétiques, rouge = données études cinétiques, n = 3 expériences indépendantes, chacune réalisées en géométrie). Un à deux points test de Student t-a été utilisé pour analyser l’intensité de la fluorescence quantitatives et d’images acquises, les numérations ** p < 0,01, *** p < 0,001) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : effet de la concentration de LLO sur rescellage SSMD efficacité et facteur Z. (A) HeLa H2B-GFP cellules incubées en M1 ou M2 contenant 1 μM CNABD ont été exposés à des concentrations croissantes de LLO et soumis à l’essai cinétique pendant 30 min à 37 ° C. Les données sont exprimées comme l’intensité de la CNABD (ICNABD) en fluorescence relative unités (RFU) ± SEM. (B), le facteur Z et la différence moyenne strictement normalisée (SSMD) ont été calculées comme une évaluation de la qualité pour la solidité de la réparation de la membrane dosage, en utilisant l’aire sous la courbe (AUC) comme une mesure pour les courbes cinétique42,43,44,45. Les efficacités de fermeture ont été calculées comme décrit dans les sections de protocole et les résultats (n = 3 expériences indépendantes, chacune réalisées en géométrie). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : exposition des lymphocytes à désipramine provoque des défauts dans rescellage. Les cellules HeLa H2B-GFP (plaqués en quatre exemplaires) ont été pré-traitées avec 30 désipramine μM (ou non) pendant 1 h à 37 ° C et ensuite exposé à 0,25 ou 0,5 nM LLO en présence de 1 μM CNABD de Ca2 +-contenant (M1) ou Ca2 +-un milieu sans (M2). Les cellules ont été imagées (pré- et post-cinétique) et soumis à l’essai cinétique à 37 ° C pour 30 min. (A) les cellules y sont énumérées ; les données sont exprimées comme moyen de cellules comtes ± SEM. (B) CNABD intensité de fluorescence (ICNABD) est exprimée dans la fluorescence relative efficacité de SEM. (C) rescellage ± unités (RFU) ont été calculées en présence et en absence de désipramine. Un modèle à effets mixtes a été employé dans des valeurs d’intensité log-transformées en supposant une interception au hasard pour chaque répétition technique. Pour capturer les deux un changement et le changement dans la forme des courbes cinétiques, le principal effet de la condition de traitement et de l’effet de l’interaction entre la condition de traitement et de temps a été testée conjointement une signification statistique. T-test de l’élève à deux queues a été utilisé pour analyser le nombre de cellules d’images acquises. La p-valeur a été calculée en utilisant le modèle à effets mixtes. (réplique de 4 techniques, une expérience). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Spécifications de l’imagerie cytomètre Emission canal
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Voie verte (ex / em ± passe-bande, nm) Couche rouge (ex / em ± passe-bande, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tableau 1 : GFP, PI et CNABD des pics d’excitation et d’émission et le vert et le rouge canal canaux d’excitation et d’émission pour le cytomètre en imagerie.

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Discussion

Ce test mesure l’efficacité de la membrane rescellage au niveau des populations de cellules avec une capacité de haut débit. Il peut être utilisé pour dépister les composants cellulaires ou des bibliothèques de drogues qui pourraient affecter la réparation de la membrane. Le test décrit utilisée un format de plaque à 96 puits, mais il peut être adapté pour les plaques 384 puits pour un débit plus élevé. Un avantage de ce test est sa capacité à obtenir des mesures de fluorescence des cellules vivantes adhérentes en temps réel sans la nécessité pour la cellule excessive évoluées telles que le détachement cellulaire, fixation ou fluorescence après fixation d’étiquetage. Les lecteurs de plaques multimode, comme celui utilisé dans le présent protocole, ont une sensibilité suffisante pour les mesures rapides spectrofluorométrie à intervalles de temps aussi faibles que 30 s pour une plaque à 96 puits. L’acquisition d’images de fluorescence fournit des informations supplémentaires, y compris la numération des lymphocytes, des éventuels changements dans la morphologie cellulaire et identification potentielle des populations cellulaires distincts. Le présent essai n’établit pas la cinétique de la membrane plasmique rescellage au niveau des cellules simples, mais identifie des conditions expérimentales (composés pharmacologiques ou composants cellulaires) qui peuvent affecter, positivement ou négativement, le processus de membrane rescellage au niveau des populations cellulaires.

Plusieurs autres approches expérimentales ont été développés afin d’évaluer la membrane réapposition de sceau sur des mécanismes. Par exemple, rupture mécanique de micro aiguille ponction, abrasion de la perle et ablation laser ont servi à modéliser des dommages mécaniques membranaires. La mesure de réparation/blessant a impliqué la fluorescence microscopie ou écoulement cytometry de quantifier l’entrée des sondes fluorescentes (FM 1-43, l’iodure de propidium, conjugué à la fluorescéine dextranes) ou protéine fluorescente chimères47 de suivi ,48,49,50. Chacune de ces approches a ses propres avantages ; Toutefois, ils ne sont pas susceptibles de criblage à haut débit dans les cellules vivantes tels que présentés dans cet essai.

Le test actuel a été optimisé afin d’analyser l’efficacité de fermeture des cellules blessées par la protéine formant des pores LLO, quelles formes gros pores qui permettent l’influx massif de Ca2 + comme provoquée par une rupture mécanique de la membrane plasmique. Bien que les toxines formant des pores représentent une forme de membrane plasmique dommages, réparation de toxine gros pores et blessures mécaniques ont été proposées pour partager commune Ca2 +-voies dépendantes17,,51. Il est important de noter que l’interaction avec des composants de la membrane cellulaire LLO, tels que le cholestérol peut affecter la signalisation de cellules et ainsi peut-être influer sur membrane réapposition de sceau sur des mécanismes comparativement aux blessures mécaniques. Nos connaissances sur la réparation de la membrane est encore limitée et d’autres études sont tenus d’établir si réapposition de sceau sur des blessures mécaniques diffère de refermer après la formation de pores de toxine. Il y a plusieurs avantages de l’utilisation de LLO. Tout d’abord, l’ouverture des dommages de la membrane peut être synchronisé en augmentant la température de 4 à 37 ° C. Deuxièmement, la forme soluble de la LLO (non lié à la membrane cellulaire) agrège irréversiblement à pH neutre et à 37 ° C, donc limiter les effets cytotoxiques et abrogeant qu’il fallait laver les cellules. Enfin, le degré de détérioration peut être ajusté en faisant varier la concentration de la toxine. Toutefois, une limitation de ce test est le commutateur de température entre 37 et 4 ° C, ce qui peut influer sur le mécanisme de réparation tels que le transport vésiculaire, endocytose et la fluidité membranaire, entre autres procédés, qui sont influencées par la température52, 53,54. Il est important de vérifier que tout inhibiteur pharmacologique inclus dans l’essai n’interfère pas avec la formation des pores de la LLO en effectuant un test d’hémolyse en présence (ou absence) de la drogue55. En raison de différences potentielles de lot dans l’activité LLO, il est important de préparer un stock de LLO qui est assez grand pour une totalité de l’écran haut débit55.

Nous avons inclus l’utilisation des cellules exprimant la chimère d’Histone-2 b-GFP nucléaire localisé comme un moyen pour énumérer les cellules avant et après que l’essai de réparation de membrane par imagerie microscopique suivie automatisé d’analyse d’images. Ce qui est important, les numérations équivalentes dans l’ensemble des conditions et immuable cellule compte avant et après le test cinétique sont cruciales comme PI ou intensités de fluorescence CNABD ne peut pas facilement être normalisé. En effet, une différence dans le nombre de cellules se traduira par des différences dans le degré de dommages par une concentration donnée de LLO, qui ne peut être corrigée pour via la normalisation de la fluorescence en raison des variations rescellage d’efficacité (Figure 7). Nous avons montré qu’expression Histone-2 b-GFP n’interfère pas avec émission d’incorporation ou de fluorescence PI ou CNABD. À l’inverse, incorporation de PI ou CNABD n’affecte pas la numération des lymphocytes axée sur la GFP. Si d’autres combinaisons de fluorophores doivent être utilisées, il serait nécessaire d’évaluer la possibilité de chevauchement spectrale entre fluorochromes, a été interprété dans ce travail. Bien que PI a été largement utilisé pour mesurer les dégâts de la membrane, nous montrons que le CNABD est un excellent substitut qui présente le plus haut rendement quantique de fluorescence, ce qui entraîne une plus grande portée dynamique adaptée pour caractériser la réapposition de sceau sur l’efficacité.

Facteur Z et SSMD a confirmé que ce test a la robustesse nécessaire pour effectuer des analyses de haut débit. Le calcul de l’efficacité de fermeture est un outil essentiel et fiable pour identifier les hits potentiels. En outre, le modèle à effets mixtes peut servir comme un outil statistique pour évaluer le succès au sein d’un seul essai. Le plan expérimental doit comporter un minimum de trois répétitions techniques si l’écran peut être répétée plusieurs fois. Quadruplicates doivent être utilisés si des outils statistiques, telles que le modèle à effets mixtes, doivent être inclus dans une expérience unique, si oui ou non il sera répété. Toutefois, il est conseillé d’exécuter l’écran plusieurs fois et de valider les résultats en effectuant des expériences complémentaires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le Dr Jesse Kwiek (The Ohio State University) pour bien vouloir ce qui nous permet d’utiliser sa plate-forme de détection multimode pour quelques expériences préliminaires. Recherche rapporté dans cet article a été financée par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous le numéro de prix RO1AI107250 à Stephanie Seveau. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

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Immunologie et Infection numéro 143 membrane plasmique réapposition de sceau réparation de la membrane la dystrophie musculaire l’iodure de propidium liant colorant les acides nucléiques carbocyanine toxines formant des pores la listériolysine O
Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères
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Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

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