Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

هنا يصف لنا تحليل القائم على الأسفار الفائق تدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة من خلال تحليلات فلوروميتريك والتصوير في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الفحص لفحص المخدرات أو الجينات المستهدفة التي تنظم إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات.

Abstract

في بيئتهم الفسيولوجية، كثيرا ما تتعرض خلايا الثدييات الإجهادات الميكانيكية والكيميائية الحيوية التي تؤدي إلى تلف غشاء البلازما. واستجابة لهذه الأضرار، ختم الأجهزة الجزيئية المعقدة سرعة غشاء البلازما لاستعادة وظيفتها الحاجز والمحافظة على بقاء الخلية. 60 عاماً بحوث في هذا الميدان، وعلى الرغم من أننا لا تزال تفتقر إلى فهم شامل للخلية إعادة ختم الجهاز. أن عنصر التحكم إعادة ختم غشاء البلازما أو الأدوية التي يمكن تحسين إعادة ختم، وقد وضعنا الفائق تحليل القائم على الأسفار أن التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات بهدف تحديد المكونات الخلوية مثقف في ميكروبلاتيس. كنظام نموذجي للضرر غشاء البلازما، تتعرض الخلايا إلى ليستيريوليسين السم البكتيري تشكيل المسام س (LLO)، الذي يشكل كبير 30-50 نانومتر القطر البروتينية المسام في المحتوية على نسبة الكولسترول في الدم الأغشية. يسمح استخدام قارئ الميكروسكوبية المتعدد وضع التحكم في درجة الحرارة لقياسات سبيكتروفلوروميتريك السريع والحساسة في تركيبة مع برايتفيلد والأسفار التصوير المجهري للخلايا الحية. التحليل الحركي لشدة الأسفار المنبعثة من فلوروتشرومي الحمض النووي ملزم إيمبيرمينت غشاء يعكس مدى الغشاء مما أدى إلى إصابة وإعادة ختم على مستوى السكان الخلية، مما يتيح لحساب الخلية إعادة ختم الكفاءة . تصوير مجهرية fluorescence يسمح لتعداد الخلايا، تعبر عن حلما فلورسنت من 2B هيستون البروتين النووي، في كل بئر الميكروسكوبية لمراعاة الاختلافات المحتملة في العدد من مؤثرا ويسمح في نهاية المطاف تحديد هوية السكان خلية متميزة. هذا التحليل الفائق هو أداة قوية يتوقع توسيع فهمنا لآليات إصلاح الغشاء عن طريق فحص الجينات المضيف أو مناشئ إضافة المركبات التي تحكم غشاء البلازما إعادة ختم.

Introduction

وتخضع خلايا الثدييات الإجهاد الميكانيكي وناضح والبيوكيميائية، أدى إلى فقدان سلامة غشاء البلازما. دون إعادة ختم سريعة وفعالة، أن تستسلم الخلايا التالفة بسرعة حتى الموت المبرمجة أو نخرية. منذ الستينات، وكان الدافع وراء الجهود الرامية إلى فهم غشاء البلازما إعادة ختم عملية بالعواقب المدمرة المرتبطة الخلل. في الواقع، قد تم ربط إصلاح غشاء البلازما ناقصة بسبب الطفرات في dysferlin ترميز الجينات، وإنتاج متقدمة glycation المنتجات النهائية، والعيوب في أمراض مثل ضمور العضلات أطرافهم-حزام، والسكري، ومتلازمة Higashi شيدياك منظم CHS1، على التوالي1،2،،من34،،من56الليزوزومية من الاتجار بالبشر. ومع ذلك، حتى الآن، أن فهمنا للغشاء إعادة ختم هو ما زالت محدودة7. وقد أثبتت الدراسات الأولية أن إعادة ختم الغشاء يتم تهيئتها بواسطة تدفق خارج الخلية Ca2 + من خلال غشاء البلازما التالفة8،،من910. ومنذ ذلك الحين، عدة غير التبادلية Ca2 +-تعتمد آليات قد اقترحت إعادة ختم الخلايا. وتقترح فرضية التصحيح أن حويصلات داخل الخلايا بالقرب من الجرح، تلتحم مع بعضها البعض وغشاء البلازما التالفة بمثابة تصحيح11،12،،من1314. نموذج ثاني يقترح أن الرقابة تعتمد على الكالسيوم من lysosomes في الجرح إصدارات موقع سفينجوميليناسي حمض الإنزيمات الليزوزومية، الذي يحول سفينجوميلين إلى السيراميد في النشرة الخارجي من غشاء البلازما. يؤدي هذا التغيير المفاجئ في تكوين الدهن يحركها السيراميد الالتقام المنطقة التالفة15،،من1617. وأخيراً، تنطوي الآلية المقترحة ثالث دور اندوسومال الفرز المعقدة اللازمة للنقل (اسكرت) لتشجيع تشكيل حويصلات المواجه للخارج أن برعم قبالة من غشاء البلازما18. حدد فقط مجموعة محدودة من البروتينات في هذه النماذج، ويجب كذلك توضيح آلياتها.

هنا يصف لنا مقايسة الفائق الذي توسط التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات ملتصقة تعرض للتلف المؤتلف ليستيريوليسين س (LLO)19. LLO السم تشكيل المسام (بفت) يفرزها الممرض داخل الخلايا اختياري الليستريه المستوحدة20،،من2122 وينتمي إلى مكف/مركز السيطرة على الأمراض (مجمع الهجوم غشاء، بيرفورين، و فوق عائلة سيتوليسين تعتمد على نسبة الكولسترول في الدم). ماكبف تشكيل المسام الثدييات التي تنتجها البروتينات المشاركة في الدفاعات المناعية، بينما المؤلفان السموم البكتيرية أساسا إيجابية العوامل الممرضة التي تضر بالخلايا المضيفة النهوض أنماط الحياة الممرضة23. يتم توليف المؤلفان مونومرات للذوبان في الماء أو dimers التي تربط الكولسترول الموجودة في غشاء البلازما، وأوليجوميريزي إلى مجمع بربري من وحدات فرعية تصل إلى 50. ثم يعيد ترتيب بربري المعقدة لإدراج β-خيوط عبر بلير الدهن، تشكيل مسام بيتا للبرميل الذي يمتد 30-50 نانومتر في قطرها24،25،،من2627.  هذه المسام كبيرة تسمح بتدفق الأيونات والمكونات الخلوية الصغيرة داخل وخارج الخلية؛ رغم ذلك، وقد اقترحت بعض الدراسات أن مسام أصغر حجماً هي أيضا شكلت28،،من2930. بين المؤلفان، يعرض LLO خصائص فريدة من نوعها، بما في ذلك التجميع تعتمد درجة الحموضة ودرجة الحرارة لا رجعة فيه، مما يفضي إلى تحليلات الفائق31،32. يمكن إضافة LLO إلى مستنبت الخلية في 4 ˚C، درجة حرارة متساهلة إلى ملزمة لها للخلايا، ولكن ليس إلى تشكيل المسام المعقدة. ثم يمكن أن تكون متزامنة الشروع في تشكيل المسام برفع درجة الحرارة إلى 37 ˚C، مما يسمح لنشر فعالة من الجزيئات السمية في طائرة الغشاء بشكل ليغومرات ويعيد البناء كونفورماشونال المشاركة في توليد المسام. ولذلك، يلي رمز التبديل في درجة الحرارة، والحركية لتلف الخلايا يعتمد على مقدار السمية منضمة إلى غشاء البلازما. الأهم من ذلك، LLO القابلة للذوبان (ليست ملزمة بغشاء البلازما) بسرعة وبلا رجعة المجاميع عند درجة حرارة تصل إلى 37 ˚C، مما يخفف من الحاجة إلى يغسل الجزيئات السمية غير منضم ويحد من مدى الضرر الغشاء على مر الزمن. وأخيراً، لأن LLO تربط بين الكوليسترول وأشكال المسام في الأغشية الغنية بالكولسترول، هذا التحليل قابلة لمجموعة واسعة من خلايا الثدييات. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن LLO يؤثر على الخلية المضيفة إشارات أساسا عن طريق تشكيل المسام، مع استثناءات قليلة في خلية مستقلة عن المسامية التي قد تحدث مما يشير إلى33،34،35،36 ،37،،من3839. ولذلك، فإنه لا يمكن استبعاد أن LLO مما يشير إلى أنشطة قد تؤثر على عملية إصلاح غشاء.

ويقيم هذا التحليل مباشرة مدى إصابة الخلية بقياس إدماج خلية إيمبيرمينت fluorochrome (مثلاً، يوديد propidium) الذي يدخل الخلايا الجرحى سلبية ويصبح الفلورية العالية بمجرد أنه يربط مع الأحماض النووية . ومن ثم، يمكن الحفاظ على فلوروتشرومي في مستنبت الخلية طوال هذه التجربة، السماح للتحليلات في الوقت الحقيقي للخلية مما أسفر عن إصابة. كثافة fluorescence صبغ الحمض النووي الملزمة سوف تزيد مع تركيز السمية، لتركيز معين من السمية، سوف تزيد مع مرور الوقت حتى تتشكل جميع المسام، وهي إصلاح الخلايا تماما أو حتى يتم التوصل إلى التشبع. تدفق خارج الخلية Ca2 + من خلال مسام الغشاء حدث شرط أساسي لإعادة ختم. ولذلك، يمكن أن يدل كفاءة ريسيلينج غير مباشر بمقارنة إصابة خلية في المتوسط الثقافة التي تحتوي على Ca2 + (حالة الإصلاح الدلالية) لإصابة في Ca2 +-المتوسطة الحرة (إصلاح الشرط التقييدي). نظراً لكثافة fluorescence صبغ الحمض النووي ملزم طرديا مع تركيز خلية في كل بئر، من المهم أن خلايا البذور في تركيز نفسها في جميع الآبار. من المهم أيضا أن تعداد الخلايا في كل بئر قبل وبعد الفحص لضمان أن الخلية المفرزة لم تحدث، كعائم، الخلايا المجمعة يمكن أن تحجب fluorescence القراءات التي قد تؤدي إلى تعقيد تفسير البيانات. تعداد الخلايا، والخلايا معربا عن هيستون النووية مترجمة 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل) استخدمت في هذا التحليل. التحكم في درجة الحرارة، وضع متعددة، والقراء الميكروسكوبية الجمع بين القياسات السريعة، الفائق (باستخدام تنسيق لوحة 96 أو 384-جيدا) من شدة الأسفار مع التصوير المجهري للخلايا الحية في 37 درجة مئوية. يمكن استخدام هذا الأخير لعد عدد الخلايا ومراقبة تشكيل خلية متميزة السكان في نهاية المطاف.

في نهاية المطاف، هذا الفحص يوفر للمستخدمين القدرة على توسيع معرفتهم بتعقيد آليات إصلاح الغشاء بالكشف عن الجزيئات المضيف أو إصلاح المركبات مناشئ المضافة التي يمكن التحكم في الغشاء. البروتوكول التالية توضح الخطوات التجريبية لقياس كفاءة الخلايا المعرضة ل LLO ريسيلينج وتقييم آثار المخدرات معين أو العلاج الخلوي في كفاءة إعادة ختم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد

  1. طلاء الخلية
    ملاحظة: الإنسان الخلايا الظهارية عنق الرحم، هيلا وهيلا معربا عن هيستون 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل)، واستخدمت في هذا البروتوكول، ولكن هذا الفحص يمكن تكييفها ل خلايا الثدييات الأخرى19.
    1. فصل الخلايا ملتصقة من 75 سم2 خلية ثقافة قارورة غسل الخلايا مع 2 مل يدتا التربسين 0.25%. استبدال التربسين المستخدمة مع 2 مل من يدتا التربسين الطازجة 0.25%.
    2. احتضان الخلايا في ˚C 37 لمدة 5 دقائق حتى يكون تقريب الخلايا وبعيدة عن قارورة.
    3. ريسوسبيند الخلايا في 8 مل من النمو المتوسطة (التي تحتوي على إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين دميم).
    4. تحديد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير و 10 ميليلتر من تعليق خلية.
    5. تمييع الخلايا في النمو المتوسط لتركيز 2.5 × 105 خلايا/مل.
    6. من أجل تعليق خلية في حوض ماصة معقمة ومزيج دقيق تعليق استخدام ماصة مصلية من 10 مل.
    7. استخدام ميكروبيبيتي 12-القنوات المتعددة و 200 ميليلتر نصائح، توزيع خلايا هيلا (2.5 × 104 خلايا/100 ميليلتر/بئر) في ثلاث نسخ (أو البيلوروسية) في لوحة المعالجة بزراعة الأنسجة البوليستيرين أسفل شقة 96، حسنا، واضحة، أسود.
      ملاحظة: يرد ترتيب طلاء على سبيل مثال في الشكل 1.
    8. ثقافة الخلايا ح 24 في حاضنة ثقافة خلية هوميديفيد في 37 ˚C و 5% CO2.
  2. إعداد حل الأسهم
    1. تحضير 1 لتر مخزون العاشر 10 من المخزن المؤقت م (المستخدمة في إعداد M1 و M2) عن طريق إضافة 95 ز هانكس متوازنة الحل الملح، ز 0.476 مجكل2 (5 ملم)، و 23.83 ز حبيس (100 مم) إلى 900 مل من الماء. ضبط ال pH إلى 7.4 ورفع الحجم إلى 1 تعقيم تصفية ل.
    2. إعداد 50 مل 50 × (1.25 م) مخزون الجلوكوز عن طريق إضافة 11.26 ز د-(+)-الجلوكوز لما مجموعة 50 مل الماء. فلتر تعقيم الحل.
    3. إعداد 50 مل 100 × (120 مم) مخزون من الكالسيوم بإضافة ز 0.666 كاكل2 لما مجموعة 50 مل الماء. فلتر تعقيم الحل.
    4. إعداد 50 مل 10 × الأسهم (50 ملم) من جليكول-bis(2-aminoethylether)-N، N، N '، ن'، حمض tetraacetic (عطا) عن طريق إضافة 0.951 ز لعطا إلى 40 مل من الماء. زيادة درجة الحموضة إلى 8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم إلى حل عطا، ثم رفع الحجم إلى 50 مل. فلتر تعقيم الحل.
    5. للوحة واحدة 96-جيدا، وإعداد 50 مل من متوسطة 1 (M1، يتضمن Ca2 +)، 50 مل من متوسطة 2 (M2، Ca2 +-الحرة)، و 15 مل من 2 المتوسطة وتستكمل مع عطا، وبناء على ذلك:
      1. ل M1، إضافة 5 مل 10 س "م المخزن المؤقت" و 0.5 مل من 100 x CaCl21 مل 50 س الجلوكوز إلى 43.5 مل من الماء.
      2. ل M2، إضافة 5 مل 10 س "م المخزن المؤقت" و 1 مل من الجلوكوز 50 x إلى 44 مل من الماء.
      3. M2/عطا، إضافة 1.5 مل 10 س "م المخزن المؤقت" و 1.5 مل من 10 x EGTA إلى 12 مل الماء.
        ملاحظة: ينبغي أن تعد جميع الحلول التي تتضمن يوديد propidium (PI) مباشرة قبل إضافة إلى الخلايا.
  3. لوحة إعدادات Cytometer القارئ/التصوير
    ملاحظة: استخدم قارئ لوحة وضع المتعدد مزودة بوحدات الكشف عن اثنين: سبيكتروفلوروميتير وسيتوميتير تصوير. الحد من تعرض الأسفار لتجنب فوتوبليتشينج فلوروفوريس.
    1. قبل الحارة للقارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية قبل القيام الفحص.
    2. قم بإعداد المعلمات للمقايسة الحركية تبعاً لذلك ضمن وضع الإعدادات :
      1. اختر مونوتشروماتورو فلوريدا (الأسفار)و الحركية للتكوين البصري وقراءة وسائط، وقراءة نوع، على التوالي.
      2. تحت إعدادات الطول الموجي، حدد من 9 إلى 15 نانومتر الإثارة والانبعاثات ممر الموجه، على التوالي. لفحوصات باستخدام يوديد propidium (PI)، تعيين موجات الإثارة والانبعاثات إلى 535 و 617 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.
      3. ضمن نوع اللوحة، حدد الآبار 96 لشكل اللوحة وتكوين لوحة محددة مسبقاً المقابلة للجدار الأسود واضح أسفل لوحة.
      4. في إطار مجال القراءة، تسليط الضوء على الآبار التي سيتم تحليلها في جميع أنحاء الحركية.
      5. تحت PMT والبصريات، مسبقاً ومضات كل قراءة إلى 6 وحدد المربع الاختيار القراءة من أسفل.
      6. تحت التوقيت، إدراج 00:30:00 في المربع إجمالي وقت تشغيل مقايسة حركية 30 دقيقة، وإدراج 00:05:00 الفاصل الزمني.
        ملاحظة: في كل مرة نقطة وطول موجي واحد، وقت قراءة لوحة كاملة 96-جيدا هو 30 ثانية.
      7. تأكيد الإعدادات المحددة في إعدادات المعلومات إلى اليمين، ثم اختر موافق. تشغيل الصحافة القراءة للشروع الحركية.
    3. قم بإعداد المعلمات التصوير تبعاً لذلك ضمن وضع الإعدادات:
      1. اختر مينيماكسو التصوير، و نقطة النهاية للتكوين البصري وقراءة وسائط، وقراءة نوع، على التوالي.
      2. تحت الأطوال الموجية، حدد أحال الضوء، وأما أو كلا المربعين fluorescence المقابلة لموجات الإثارة والانبعاثات من 456/541 نانومتر (بروتينات فلورية خضراء) و 625/713 نانومتر (PI).
      3. استخدم نفس خيارات نوع اللوحة و مجال القراءة كما هو معرف في الخطوات 1.3.2.3 و 1.3.2.4.
      4. تحت أيضا مجال الإعداد، حدد العدد من المواقع داخل بئر تصويرها.
        ملاحظة: 12 موقعا لتتوافق بصورة كاملة، حسنا.
      5. تحت إعدادات اقتناء الصورة، حدد أوقات التعرض للضوء، أحال 541 (التجارة والنقل)، و 713 (PI). للتجارة والنقل، الصورة كلها جيدا مع وقت تعرض من 20 مللي/الصورة. لأحال الضوء (TL) والأسفار PI، الحصول على صورة واحدة للمركز من كل بئر مع أوقات التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 8 و 20، على التوالي.
      6. تأكيد الإعدادات المحدد في معلومات الإعدادات إلى اليمين، ثم اختر موافق. شراء الوقت لتصوير كامل سطح لكل بئر (12 صور في بئر) من لوحة 96-جيدا وطول موجي واحد ~ 15 دقيقة الصحافة القراءة لبدء التصوير.
        ملاحظة: يتطلب وقت اكتساب صورة/بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا ~2.5 مين/لوحة لطول موجي واحد. تتوافق مع المعلمات المذكورة أعلاه إلى معدات محددة في المختبر. قياسات سبيكتروفلوروميتريك: مصباح زينون فلاش عرض 1.0 شمال البحر الأبيض المتوسط زيادة الإثارة الأطوال الموجية (250-850 nm) مع قابل لتعديل 9 أو 15 نانومتر ممر الموجه، كاشف ضوئي أنبوب مع > 6 تسجيل النطاق الديناميكي وانبعاثات شمال البحر الأبيض المتوسط 15 أو 25 قابل لتعديل ممر الموجه. التصوير سيتوميتير: مصدر إضاءة خفيفة قادرة على الضوء الأبيض، 460 نانومتر، وموجات الإثارة نانومتر 625 مع 20 ممر الموجه nm، عوامل الانبعاثات تركزت في 541 نانومتر (108 من ممر الموجه nm) و 713 نانومتر (ممر الموجه nm 123)، على التوالي، وهدفا 4 X بالإضافة 1.25 12-بت جهاز ميغابيكسل.

2-التحليل

ملاحظة: وقت الفحص، يجب أن تكون الخلايا روافد 70-90%. خلال خطوات الغسيل، وينبغي إزالتها من على المديين المتوسط والمطبقة على الجدار الجانبي للبئر (غير مباشرة فوق الخلايا). الحفاظ على درجة حرارة LLO ˚C < 4 لمنع التجميع بها حتى الخطوة 3.1.5.

  1. إعداد مخزون من 30 ميكرومتر PI في M1 ومخزون من 30 ميكرومتر PI في M2 استعد مسبقاً في 37 ˚C.
  2. تغسل بلطف الخلايا الموجودة في لوحة 1 استخدام ميكروبيبيتي 12-القنوات المتعددة و 200 ميليلتر نصائح، على النحو التالي:
    1. لشروط إصلاح المتساهلة، إزالة المتوسطة النمو وغسل الخلايا مرتين مع 200 ميليلتر/بئر M1 استعد مسبقاً في 37 ˚C. يستعاض في المتوسط 100 ميليلتر/بئر M1 الحارة التي تحتوي على 30 ميكرومتر PI...
    2. لإصلاح شروط تقييدية، وإزالة المتوسطة النمو وتغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 M2 ميليلتر/بئر الحارة التي تحتوي على 5 مم عطا يخلب Ca2 +، تليها غسل واحد مع 200 ميليلتر/بئر M2. استبدال المتوسطة مع 100 M2 ميليلتر/بئر الحارة التي تحتوي على 30 ميكرومتر PI.
    3. تم غسلها بعد النمو متوسطة واستبدالها مع يوديد propidium تحتوي على المتوسط، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 2.1.3.
  3. صورة لوحة 1 تحت الضوء المنقولة والتجارة والنقل، وبي مفصلة تحت 1.3.3 (الحركية مسبقاً). هذه الخطوة تستغرق 15-20 دقيقة.
  4. خلال فترة 15 دقيقة في خطوة 2.1.3، إعداد لوحة 2 استخدام ميكروبيبيتي 12-القنوات المتعددة و 200 ميليلتر نصائح على النحو التالي:
    1. 96-فضلا عن مكان الجولة الميكروسكوبية البوليبروبيلين السفلي على الجليد. تكوين لوحة باستخدام تصميم تجريبي المقابلة للوحة 1 (الشكل 1).
    2. لشروط إصلاح المتساهلة، إضافة 100 ميليلتر/بئر M1 المثلج التي تحتوي على 60 ميكرومتر PI، تليها إضافة 100 ميليلتر/جيدا M1 المثلج يحتوي على 4 × LLO أو ليس لعنصر التحكم.
    3. الشروط المقيدة لإصلاح، إضافة 100 ميليلتر/بئر M2 المثلج التي تحتوي على 60 ميكرومتر PI، تليها إضافة 100 ميليلتر/جيدا من المثلج M2 يحتوي على 4 × LLO أو ليس لعنصر التحكم.
  5. وبعد التصوير لوحة 1 (الخطوة 2.1.3)، ضعه مباشرة في الجليد، واستخدام رقائق الألومنيوم لفصل اللوحة من الاتصال المباشر مع الجليد. تسمح لوحة 1 ليبرد لمدة 5 دقائق.
  6. باستخدام ميكروبيبيتي 12-متعدد الأقنية و 200 ميليلتر نصائح، نقل 100 ميليلتر من كل بئر في لوحة 2 (الخطوة 2.1.4) إلى الآبار المقابلة في لوحة 1. توزيع السم في وسائط الإعلام في لوحة 1 بشكل صحيح، إدراج النصائح أدناه غضروف ولطف إخراج وحدة التخزين دون إدخال الفقاعات.
    ملاحظة: لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، كما عن غير قصد وهذا قد فصل الخلايا.
  7. اترك لوحة 1 دقيقة إضافية للسماح بالسم ربط الخلايا ونقل مباشرة لوحة 1 للقارئ لوحة للتحليل الحركي باستخدام أسلوب سبيكتروفلوروميتير (الخطوة 1.3.2).
  8. في نهاية التحليل الحركي، فورا صورة لوحة 1 (الحركية فيما بعد) باستخدام الخطوة 1.3.3.

3-التحليل: خلية التعداد

  1. تحديد عدد الخلايا استناداً إلى الأسفار النووية باستخدام البرمجيات تعداد خلية ميكروسكوبية.
    1. ضمن إعدادات، حدد تحليل جديد، ومن ضمن المقطع فئة ضمن إعدادات تحليل الصورة حدد حصيف كائن تحليل استخدام 541 كالطول الموجي للبحث عن الكائنات.
    2. ضمن الخيار "البحث عن كائنات"، تستخدم في رسم الصور العثور على الأسلوب، حدد الأنوية ضمن علامة التبويب إعدادات، ثم اضغط تطبيق.
    3. اضغط موافق و القراءة الشروع في الخلية الفرز الخوارزمية.
  2. بدلاً من ذلك، إذا كان متوفراً لا أداة من هذا القبيل، استخدام برنامج تحليل صورة مثل إيماجيج تعداد الخلايا.
    1. في إيماجيج، قم بفتح ملف الصورة مكدس.
    2. تحويل المكدس إلى صور 8-بت اللون الرمادي بواسطة النقر فوق الصورة في شريط القوائم، تحوم فوق نوع، وحدد 8 بت.
    3. طرح الخلفية: انقر فوق الصورة في شريط القوائم، تحوم فوق ضبط، وحدد السطوع/. قم بضبط قيمة الحد الأدنى إزالة الضوضاء الخلفية وحدد تطبيق.
    4. عتبة لإنشاء صور ثنائية: انقر فوق الصورة في شريط القوائم، تحوم فوق ضبطوتحديد العتبة. حدد خلفية داكنةوضبط قيم الحد الأدنى والحد الأقصى، وانقر فوق تطبيق.
    5. في حالة تداخل النوى، يمكن استخدام أداة مستجمعات المياه إلى نوى قطعة. انقر فوق العملية في القائمة، قم بالمرور فوق ثنائي وحدد مستجمعات المياه.
      ملاحظة: هذا سوف تلقائياً فصل الأنوية متصلة.
    6. تحليل الصور ملثمين بتطبيق المعايير المحددة من قبل المستخدم (الحجم والتدوير) لتحسين تحديد الأنوية واستبعاد الحطام خلية.
      1. انقر على تحليل في القائمة ومن ثم تحليل الجزيئات. تعيين الحجم المطلوب (بكسل ^ 2) ونطاقات التدوير (قيمة 1 دائرة كاملة) التي تعتبر كافية لتضمين الخلايا الفردية/نوى.
      2. في مربع القائمة المنسدلة إظهار، حدد الخيار المطلوب والتحقق من تلخيص، وانقر فوق "موافق" للحصول على عدد خلايا.

4-التحليل: منحنيات الحركية

  1. نقل البيانات الحركية من برنامج قارئ لوحة لبرنامج بيانات تحليلية.
  2. لكل حالة تجريبية، ومتوسط كثافة الأسفار من replicates في كل تيميبوينت، جنبا إلى جنب مع الانحراف المعياري المطابقة والخطأ المعياري للوسط لكل حالة تجريبية.
  3. لكل حالة تجريبية، تتبع المنحنى الحركية المقابلة: كثافة PI (المحور الصادي) مقابل الوقت (س).
  4. لحساب كفاءة شرط معاملة ريسيلينج، حساب المساحة تحت المنحنى (AUC) من + LLO في M1 (AUC(M1)) و + LLO في M2 (AUC(M2)). استخدام النهج المقترح أدناه لتقييم الكفاءة (ه) إعادة ختم:
    Equation
  5. إجراء مقارنة بين العلاج التحكم والاختبار بتحديد نسبة كفاءة (REff) المشار إليها أدناه:
    Equation 2
    REFF = 1، اختبار العلاج ليس له أي تأثير على إصلاح
    REFF < 1، اختبار العلاج يمنع إصلاح
    Rالمؤسسة > 1، اختبار العلاج يحسن إصلاح
  6. حساب المساحة تحت المنحنى باستخدام المعادلة التالية:
    Equation 3، حيث ك هو العدد الإجمالي لعمليات المتابعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلية عد الدقة: خلايا هيلا كثيرا ما تستخدم كخط خلية الثديية نموذجي لاستكشاف آليات إصلاح الغشاء. عند تقييم إصلاح الغشاء على مستوى السكان الخلية، من المهم أن خلايا لوحة في تركيز نفسها في جميع الآبار لتفسير البيانات المناسبة. من المهم أيضا التحقق من وقت الفحص أن أرقام الخلية ما يعادل عبر الآبار. وأدخلت خلايا هيلا مؤثرا تعبر عن 2B هيستون تنصهر للتجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل) في هذا التحليل تلقائياً تعداد الخلايا استناداً إلى الكشف عن نويات الفلورسنت. إنشاء الدقة في تعداد الخلية، كانت مطلية بتخفيف التسلسلية ذات شقين لخلايا هيلا H2B-التجارة والنقل في ثلاث في صفيحة 96-جيدا ومثقف ح 4. هذا القدر من الوقت كافية لمرفق الخلية ويوفر انقسام الخلية محدودة. آبار الكامل تم تصويرها تحت الضوء المنقولة (TL) واضاءات fluorescence بروتينات فلورية خضراء وعدد خلايا تم تقييم يستند إلى الأسفار التجارة والنقل باستخدام برنامج تحليل قارئ لوحة (الشكل 2 ألف و 2 باء). خلية متوسط التهم ± الانحراف المعياري كان تآمروا ضد خلية البذر تركيزات، وخط الاحتواء الأفضل أشارت إلى نسبة 1.08:1 من عدد الخلايا خلية زرع البذور، مما يدل على دقة عملية عد الأصوات (الشكل 2). بتصوير جميع الآبار قبل مقايسة حركية، يمكن ضمان أن أرقام الخلية متسقة بين جميع الآبار. أيضا، بتصوير الآبار بعد الفحص الحركية، واحدة يمكن إنشاء إذا تسبب التعرض للسموم مفرزة الخلية.

التعبير عن التجارة والنقل لا تتداخل مع قياسات كثافة يوديد (PI) بروبيديوم (طPI): لضمان أن الرابطة النووية H2B-التجارة والنقل لا تتداخل مع إدماج PI أو PI fluorescence كثافة القياس (طPI)، أناPI تمت مقارنة في خلايا هيلا وهيلا H2B-التجارة والنقل التي يتعرض لها، أو لا، 1 نانومتر LLO (الشكل 3). نظراً لغياب PI، كان هناك مستوى منخفض وبالمثل من الأسفار الخلفية في الحلة والحلة H2B-التجارة والنقل، مشيراً إلى أن التجارة والنقل لا يتم تجاوز الهوامش من خلال عوامل الانبعاثات fluorescence PI. حضور بي، ولكن عدم وجود LLO، كان هناك مماثلة القاعدية PI fluorescence انبعاثات في الحلة والحلة H2B-التجارة والنقل التي لم تتغير على مر الزمن. هذا وأكد أن التعبير عن التجارة والنقل لا يؤثر على قياس PI fluorescence وأشارت إلى أن PI تخترق الخلايا غير التالفة على الإطار الزمني للتجربة. إضافة LLO أسفرت عن زيادة في الأسفار PI مع مرور الوقت أن كان مماثلاً في الحلة والحلة H2B-التجارة والنقل على حد سواء. هذه الزيادة نتيجة لإصابة الخلية قبل LLO جنبا إلى جنب مع جمعية PI مع الأحماض النووية. معا، تثبت هذه النتائج أن التعبير عن هيستون-2-التجارة والنقل لا يؤثر على إدماج PI أو قياس الأسفار.

الأسفار بي لا تتداخل مع عد الخلايا القائم على التجارة والنقل: المقابل، من المهم التحقق من أن إدماج PI النووي في الخلايا من الجرحى لا تتداخل مع عد الخلايا القائم على التجارة والنقل. الأسفار الممثل الصور الحلة والحلة H2B-بروتينات فلورية خضراء يتعرض إلى 1 نانومتر LLO حضور PI أظهرت أن هناك إلى تراكم ملحوظ من PI في إصابة خلايا حركية المنصب، كالمتوقع (الشكل 4 أ). تصوير كشف أيضا عن أن PI يمكن أن تنزف من خلال كشف fluorescence التجارة والنقل (الشكل 4A و الجدول 1). كان أفضل تقدير هذه الأسفار كروس على الصور الحركية بعد هيلا الخلايا التي لا تعبر عن التجارة والنقل، ولكن لا يزال عرض نويات الفلورية الخضراء (الشكل 4 أ). يمكن أيضا أن يدل على هذا التقاطع بقياس كثافة fluorescence التجارة والنقل (طالتجارة والنقل) في خلايا هيلا H2B-التجارة والنقل، التي زادت زيادة كبيرة بعد الحركية قبل الحركية (الشكل 4 باء) بالمقارنة. الأهم من ذلك، لا يؤثر بي الأسفار كروس خلية العد لأن عملية تقسيم المشاركين في التعداد نويات لا تتأثر بحدوث زيادة في التجارة والنقل الفلورية (الشكل 4).

قياس غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة: نقدم في هذا القسم، أن المنهجية الأساسية التي تستخدم لقياس مدى كفاءة إعادة ختم غشاء. أدلة العملية لإعادة ختم غشاء خلايا هيلا H2B-بروتينات فلورية خضراء يتعرض لها، أو لا، إلى 1 نانومتر LLO في وجود (M1) أو غياب (M2) Ca خارج الخلية2 + (الشكل 5). كما هو متوقع، في غياب LLO، أنابي ظل ثابتاً في M1 و M2. إضافة LLO في كاليفورنيا2 +-تحتوي على المتوسط أدت إلى زيادة مطردة في كثافة fluorescence PI (طPI)، بينما في غياب Ca خارج الخلية2 +، كانت هناك زيادة انحدارا كبيرا في الأسفار PI، مما يعكس عدم إعادة ختم غشاء. لتقييم كفاءة ريسيلينج، التي تعرف بأنها قدرة الخلايا على إصلاح في M1 بالنسبة إلى M2 (الخطوة 1.5.4.1)، تم تحديد المنطقة تحت المنحنيات M1 و M2 (AUC) وتم حساب كفاءة إصلاح (ه) أن يكون 0.287.

بديل إلى PI: PI قد استخدمت أوبيكويتوسلي كعلامة للضرر غشاء البلازما. ومع ذلك، هناك غيرها الحمض النووي ملزم الأصباغ التي أيضا مناسبة لهذا التحليل. على سبيل المثال، ربط حمض النووي كاربوسيانيني إيمبيرمينت غشاء صبغ المعارض (كنابد) طيف انبعاث التوصل إلى الأحمر الآن وقد خصوصية عالية لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. من ناحية أخرى تربط بي40،الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي41. على عكس PI، بالإثارة وأطياف الانبعاث من كنابد لا تتداخل مع تلك التجارة والنقل مما يسمح الاستبانة الطيفية أفضل بين فلوروتشروميس اثنين. وعلاوة على ذلك، قد كنابد المستخدمة في هذا البروتوكول معامل انقراض تقريبا مرتين من PI، مما يعني أن لهذه الإثارة كل الأطوال الموجية، هذه الصبغة أكثر قادرة على امتصاص الطاقة من PI نتج انبعاثات fluorescence أقوى. الأسفار الكمية تحليل الصور كنابد والتجارة والنقل وأظهرت أن هذه الصبغة المعارض مجموعة ديناميكية الأسفار كبيرة، لا تنبعث منها إلى حد كبير في الأطوال موجية الأسفار التجارة والنقل، ولا يؤثر على عدد الخلايا (الشكل 6A-د). في الواقع، المحتضنة في وسائل الإعلام M1 أو M2 يتضمن كنابد خلايا هيلا H2B-التجارة والنقل وتضررت من 1 نانومتر LLO معارضها 4 و 5.5 إضعاف زيادة فيكنابد أنا بالنسبة إلى عناصر التحكم غير معطوبة، على التوالي (الشكل 7 أ). للمقارنة، تعرض الخلايا إلى 1 نانومتر LLO حضور PI معارضها بزيادة 2.5 و 3 إضعاف في كثافة fluorescence PI في M1 و M2، على التوالي (الشكل 5). مثل PI، المعارض كنابد زيادة كثافة الأسفار مع زيادة تركيز LLO في M1 (الشكل 7 أ)، وتم حساب كفاءة إصلاح الناتجة كما هو موضح في الخطوة 1.5.4.1 (الشكل 7). ونحن التقرير أن الخلية إعادة ختم نقصان الكفاءة كما يزيد من تركيز LLO. وتعكس هذه الظاهرة حقيقة أن الخلايا تنخفض قدرتها على إعادة ختم عند الأضرار المفرطة هي سبب.

تقييم جودة مقايسة إصلاح الغشاء: هو أحد جوانب البالغة الأهمية لأي فحص متانة أو القدرة على كشف وحل الخلافات بين عناصر سلبية وإيجابية. يجب عرض إشارة التباين بين عناصر إيجابية وسلبية كافية النطاق الديناميكي وإمكانية تكرار نتائج. في هذا التحليل إصلاح الغشاء، هي عناصر إيجابية وسلبية الخلايا المعرضة ل LLO في إصلاح المتساهلة (M1) والمقيدة لإصلاح الأوضاع (M2)، على التوالي. واتخذت نهجين لتقييم مدى متانة هذا التحليل لتحليل الفائق. أولاً، Z-عامل، أو فحص معامل نافذة، ويحدد ما إذا كانت مجموعة معينة من الظروف يوفر كبيرة كافية النطاق الديناميكي، بينما المحاسبة لتقلب إشارة. ض-العوامل ضمن النطاقات 0 < Z ≤ 0.5 و 0.5 < Z ≤ 1 تناظر مقايسة مقبولة وجيدة جداً، على التوالي42،43. حد من استخدام Z-العامل لتقييم الجودة أن شروط اختبار عادة ما يحمل قيم أكثر اعتدالا مقارنة بالضوابط الإيجابية والسلبية المتطرفة. ولذلك، ونهج ثاني، قمنا بحساب الفرق يعني دقة موحدة (صمد، β)، الذي يمكن تحديد الفروق بين الظروف التجريبية التي خلاف ذلك أن تصنف على أنها نتيجة سلبية استناداً إلى مؤهلات Z-عامل44 ،45. ويمكن تصنيف القيم سمد في قوة تأثير تتراوح من أي تأثير (β = 0) إلى قوي للغاية (≥ بيتا 5). باستخدام البيانات من الشكل 7 ألف و/أوك/للمقارنة بين M1 مقابل شروط M2، التعرض إلى 0.25 و 0.5 نانومتر LLO إنتاج قيم Z-عامل من 0.3100813 و 0.137313، وبيتا = 6.0672 و 4.803308، على التوالي، مشيراً إلى أن نافذة تركيزات LLO مناسبة للمقايسة. كما يزداد تركيز LLO تتجاوز 1 نانومتر، والفجوة في الأولكنابد يغلق منحنيات الحركية بين ظروف M1 و M2 نتج عنه انخفاض جذري قيم Z-عامل وصمد (الشكل 7). هذه التركيزات العالية من LLO تتوافق مع الظروف التي هي أقوى بكثير من الأضرار إمكانية إصلاح ومما ينفي استخدام التحليل في تحديد العوامل التي ينطوي عليها إصلاح الغشاء. ويتضح كذلك الانخفاض في كفاءة إصلاح (ه) كما يزيد من تركيز LLO (الشكل 7). كافة البيانات (Z-عامل وصمد ه) تم إنشاؤها مع replicates البيولوجية 3 و 3 التقنية يتطابق كل حالة تجريبية للتحقق من صحة التحليل. وتوضح هذه البيانات معا، أن هذا الفحص قد متانة المتوقعة مقايسة الفائق مع LLO تركيزات أقل من 1 نانومتر لخلايا هيلا.

إثبات المبدأ: متى أنشئت متانة المقايسة، أجرينا تجارب إضافية كدليل على مبدأ أن يكون هذا التحليل من حساسية والقرار للتعرف على وجود خلل في عملية الإصلاح. أيضا، نحن نعتبر أن فحوصات الفائق المستخدمة أثناء عملية فرز لتحديد عدد "الزيارات" داخل الشاشات الكبيرة، التي قد تنطوي على أقل من 3 البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. وهكذا، تجدر الإشارة إلى أن تصميم تجريبي يوفر قوة الكشف لتحديد عدد "الزيارات" داخل مقايسة واحدة. ولذلك، تحت شاشة الفائق، يمكن تعديل تخطيط المقايسة لاستيعاب 4 replicates التقنية لزيادة القدرة الإحصائية في تجربة واحدة. خلايا تم مطلي في البيلوروسية وكانت ح 1 ما قبل المعالجة قبل الفحص مع desipramine، مثبط دوائية لتعويض البروتين حمض سفينجوميليناسي (ASM) التي تلعب دوراً في غشاء البلازما إصلاح15،17 ،46. الأهم من ذلك، المعاملة مع ديسيبراميني لم يؤثر على عدد خلايا في جميع أنحاء المقايسة، مما يسمح للمقارنة المناسبة بين الخلايا desipramine المعالجة وغير المعالجة (الشكل 8 أ). تثبيط ASM في الخلايا المعالجة desipramine أسفرت عن وجود عيب في غشاء إعادة ختم الكفاءة عند التعرض إلى LLO، كما يتبين من الانخفاض في ه وارالمؤسسة (8B الشكل و 8 ج). باستخدام نموذج آثار مختلطة، مقارنة بين desipramine-يعامل الخلايا غير المعالجة يتعرض إلى 0.25 و 0.5 نانومتر LLO في M1 أظهرت القيم ف 0.0010 و 1 x 10-10، على التوالي. معا، تشير البيانات إلى أن 0.25 و 0.5 نانومتر LLO التركيزات المناسبة لتحديد العيوب في إصلاح في وضع تجريبي الفائق، مع التحليلات الإحصائية الممكنة من تجربة واحدة مرة واحدة هي زيادة replicates التقنية إلى أربع . علما بأن النهج الإحصائي لنموذج آثار مختلطة بين البيلوروسية وسوف لا تراعي الاختلافات المحتملة عبر البيولوجية متعددة وإنشاء نسخ متماثلة. وينبغي التحقق من أي نتائج هامة باستخدام تكرار البيولوجية واحدة في إعدادات تجريبية إضافية.

Figure 1
رقم 1: التصميم التجريبي- الرسم التخطيطي لتدفق يصور تصميم لوحة تمثيلية تكوين لاختبار تأثير سبعة شروط الاختبار بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة بالتحكم. ينبغي إدراج عناصر تحكم إضافية إذا اقتضى الأمر، أما بالنسبة للمثال المخدرات المركبات. يتم مطلي بالخلايا (لوحة 1) 24 ساعة قبل التجربة. في يوم التجربة، تغسل الخلايا في لوحة 1 مع المتوسط M1 أو M2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية، وهو اللوحة المصورة (ليرة تركية، والتجارة والنقل، وبي الأسفار) قبل الحركية. وخلال 15 دقيقة الكواشف التصوير، تتم إضافة على الجليد إلى لوحة 2. بعد التصوير، لوحة 1 يوضع فورا على الجليد لمدة 5 دقائق، ويتم نقل 100 ميكروليتر/جيدا من لوحة 2 لوحة 1. يتم وضع لوحة 1 في قارئ لوحة تشغيل الفحص الحركي عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، تليها التصوير (الأسفار ليرة تركية، والتجارة والنقل، وبي). ثم يتم تحليل البيانات لحساب عدد الخلايا وتقييم كفاءة إصلاح في جميع الظروف التجريبية. في مجموعات كبيرة من البيانات، يمكن أن يكون آليا التحليل. أيضا، يمكن زيادة عدد replicates التقنية إلى 4 في الشاشات الفائق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: خلية عد دقة. كانت تبذر خلايا هيلا معربا عن 2B هستون بروتينات فلورية خضراء معلم في تريبليكاتيس في تركيزات المشار إليه. الخلايا (A) تم تصويرها في 37 درجة مئوية تحت الضوء المنقولة (TL) والأسفار التجارة والنقل (12 صور في البئر) وخوارزميه الكشف عن خلية كانت تستخدم لتحدد النوى الفردية (في الأرجواني). مقياس بار = 1-(ب) أعلى التكبير TL والتجارة والنقل، والخلية الكشف (أرجواني) الصور (2 X التكبير). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) الصورة واستخدمت برامج التحليل حساب عدد الخلايا والخلية التي تم رسمها التهم ضد الأولى الخلية تركيز البذر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: قياس fluorescence يوديد Propidium لا يتأثر بالتعبير 2-بروتينات فلورية خضراء هيستون. هيستون معربا عن 2B-التجارة والنقل وغير التعبير عن خلايا هيلا تعرضت، أم لا، إلى 1 نانومتر LLO في وجود (خطوط صلبة) أو غياب (خطوط متقطعة) من 30 ميكرو PI في Ca2 +-تتضمن المتوسطة (M1). والرزن الحركية PI fluorescence كثافات تقاس سبيكتروفلوروميتري كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. البيانات هي متوسط PI fluorescence كثافة (طPI) أعربت في الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3 تجارب مستقلة، يؤديها كل منهما في تريبليكاتيس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تعداد الخلايا لا تتأثر بالأسفار بي. (أ) ممثل ما قبل وما بعد الحركية الصور (TL وبي، والتجارة والنقل) خلايا مكشوف أو لا، 1 نانومتر LLO في M1. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) التحليل المجهري الفلورية الكمية (أنابروتينات فلورية خضراء± SEM) كشفت عن زيادة بروتينات فلورية خضراء fluorescence القياس بسبب إدراج PI النووية عند إصابة الخلية قبل LLO (الحركية فيما بعد). تعداد الخلية على أساس التجارة والنقل (ج) لم تتأثر بالزيادة في كثافة التجارة والنقل. وأعرب عد الخلية الواحدة وكذلك كمتوسط ± sem. (في ب وج: أشرطة سوداء = البيانات قبل الحركية؛ أشرطة حمراء = البيانات الحركية بعد؛ ن = 3 تجارب مستقلة، كل إجراء في تريبليكاتيس؛ واستخدم اختبار t ثنائي الطرف الطالب لتحليل كمي الأسفار حساب كثافة وخلية من الصور المكتسبة، * * ف < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: قياس غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة. هيستون 2B-التجارة والنقل وإذ تعرب عن خلايا هيلا تعرضت، أم لا، إلى 1 نانومتر LLO في كاليفورنيا2 +-التي تحتوي على (M1) أو Ca2 +-الحرة المتوسطة (M2) التي تحتوي على 30 ميكرو PI. وتمثل البيانات الحركية كثافة fluorescence PI (طPI) في الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± SEM، قياس مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. n = 3 تجارب مستقلة، يؤديها كل منهما في تريبليكاتيس. وتم قياس كفاءة ريسيلينج كما ورد في البروتوكول خطوة 1.5.4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: الحمض النووي كاربوسيانيني ملزمة صبغ صبغة بديلة لتقييم إعادة ختم غشاء. تعرض خلايا هيلا H2B-التجارة والنقل، أم لا، ل 0.5 نانومتر LLO لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حضور 1 ميكرومتر كنابد في كاليفورنيا2 +-التي تحتوي على (M1) أو Ca2 +-الحرة (M2) متوسطة. (أ) تم اقتناء الصور من هيلا H2B-بروتينات فلورية خضراء الخلايا ما قبل وما بعد الحركية في M1 التي تحتوي على الصبغة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. كثافات fluorescence كنابد المتكاملة والتجارة والنقل (ب وج) كانت تقاس باستخدام سيتوميتير التصوير والتعبير عنها بوحدات fluorescence النسبي (رفو) ± sem. تم تجهيز الصور الفلورية (د) التجارة والنقل لتعداد هيلا H2B-التجارة والنقل الخلايا (أسود أشرطة = أشرطة البيانات قبل الحركية، أحمر = البيانات بعد الحركية، n = 3 تجارب مستقلة، يؤديها كل منهما في تريبليكاتيس). -التائي الاختبار t كانت تستخدم لتحليل كثافة fluorescence الكمية وحساب الخلية من الصور المكتسبة، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: تأثير تركيز LLO على إعادة ختم Z-عامل والكفاءة وصمد. (أ) هيلا H2B-بروتينات فلورية خضراء الخلايا المحتضنة في M1 أو M2 يتضمن ميكرومترات 1 كنابد كانت تتعرض لزيادة تركيزات LLO وتخضع للتحليل الحركي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يتم التعبير عن البيانات كما حسبت كثافة كنابد (طكنابد) في الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± sem. (ب) Z-عامل والموزون دقة موحدة (سمد) كتقييم جودة للمتانة لإصلاح الغشاء المقايسة، باستخدام المنطقة تحت المنحنى (AUC) كمقياس للمنحنيات الحركية42،43،،من4445. وحسبت الكفاءة ريسيلينج كما هو موضح في المقاطع البروتوكول والنتائج (n = 3 تجارب مستقلة، يؤديها كل منهما في تريبليكاتيس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: تعرض الخلية إلى desipramine أسباب العيوب في إعادة ختم. خلايا هيلا H2B-التجارة والنقل (مطلي في البيلوروسية) تعامل مع 30 ميكرو desipramine مسبقاً (أو لا) ح 1 في 37 درجة مئوية وثم يتعرض إلى 0.25 أو 0.5 نانومتر LLO حضور 1 ميكرومتر كنابد في Ca2 +-تحتوي على (M1) أو Ca2 +-الحرة (M2) متوسطة. خلايا تم تصويرها (قبل وبعد الحركية) وإخضاعها للتحليل الحركي في 37 درجة مئوية لكان تعداد الخلايا 30 دقيقة (A)؛ يتم التعبير عن البيانات خلية متوسط التهم ± sem. (ب) كنابد fluorescence كثافة (طكنابد) هو المعرب عنها في الأسفار النسبي حسبت الوحدات (رفو) ± sem. (ج) ريسيلينج الكفاءة في حضور وغياب desipramine. استخدم نموذج آثار مختلطة في قيم الكثافة تحويل سجل على افتراض اعتراض عشوائي لكل تكرار التقنية. لالتقاط كل تحول وتغيير في شكل منحنيات الحركية، الاشتراك تم اختبار التأثير الرئيسي لشرط المعاملة وأثر التفاعل بين شرط المعاملة والوقت لدلالة إحصائية. -التائي الاختبار t استخدمت لتحليل عدد خلايا من الصور المكتسبة. ف--القيمة التي حسبت باستخدام نموذج الآثار المختلطة. (4 التقنية يتطابق، تجربة واحدة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مواصفات تصوير Cytometer الانبعاثات القناة
فلوروفوري فلوروفوري ت/م (nm) قناة الأخضر (ex/م ± ممر الموجه، وشمال البحر الأبيض المتوسط) القناة الحمراء (ex/م ± ممر الموجه، وشمال البحر الأبيض المتوسط)
بروتينات فلورية خضراء 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
كنابد 642/661

الجدول 1: التجارة والنقل وبي كنابد قمم الإثارة والانبعاثات والأخضر والأحمر قناة باندباسيس الإثارة وانبعاث سيتوميتير التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا التحليل تدابير كفاءة الغشاء إعادة ختم على مستوى السكان الخلية مع القدرات الإنتاجية العالية. ويمكن استخدامه للكشف عن المكونات الخلوية أو مكتبات المخدرات التي يمكن أن تؤثر على تصليح غشاء. استخدمت مقايسة وصف شكل لوحة 96-جيدا، ولكن فإنه يمكن تكييفها مع لوحات 384-جيدا لأعلى من الناتج. ميزة لهذا التحليل هو قدرته على الحصول على قياسات fluorescence الخلايا الحية ملتصقة في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى الخلية المفرط تجهيز مثل الخلية المفرزة أو التثبيت أو الأسفار العلامات بعد انتهاء التثبيت. القراء لوحة المتعدد، مثل تلك المستخدمة في هذا البروتوكول، يكون حساسية كافية لقياسات سبيكتروفلوروميتريك السريع في فترات زمنية منخفضة تصل إلى 30 ثانية للوحة 96-جيدا. الحصول على الصور fluorescence يوفر معلومات إضافية بما في ذلك تعداد الخلية، وتغييرات في نهاية المطاف في مورفولوجيا الخلايا، وإمكانية تحديد هوية السكان خلية متميزة. التحليل الحالي لا ينشئ الحركية لإعادة ختم غشاء البلازما على مستوى الخلية الواحدة، ولكن يحدد الشروط التجريبية (المركبات الدوائية أو المكونات الخلوية) التي يمكن أن تؤثر، سلبا أو إيجاباً، في عملية غشاء إعادة ختم على مستوى السكان الخلية.

وضعت عدة نهج تجريبية أخرى لتقييم الغشاء إعادة ختم الآليات. على سبيل المثال، تعطل الميكانيكية microneedle الثقب والكشط حبة التذرية الليزر قد استخدمت لنموذج الضرر الغشاء الميكانيكية. قياس إصابة/إصلاح قد تشارك fluorescence مجهرية أو التدفق الخلوي بالتحديد الكمي لدخول الفلورسنت المسابر (إف أم 1-43، يوديد propidium، مترافق فلوريسسين ديكسترانس) أو تتبع البروتين الفلورسنت التركيبات47 ،48،،من4950. كل واحد من هذه النهج مزاياه الخاصة؛ ومع ذلك، فليست قابلة للفرز الفائق في الخلايا الحية كما عرضت في هذا التحليل.

التحليل الحالي الأمثل لتحليل كفاءة الخلايا أصيب بالبروتين تشكيل المسام LLO، فيها المسام الكبيرة أشكال تسمح Ca2 + التدفق الضخم كما أدى إلى تمزق الميكانيكية من غشاء البلازما ريسيلينج. على الرغم من أن تشكيل المسام السموم تمثل شكلاً من أشكال الضرر غشاء البلازما، إصلاح المسام السمية الكبيرة والجروح الميكانيكية واقترح على تبادل المرجع المصدق المشترك2 +-مسارات تعتمد17،51. من المهم ملاحظة أن LLO التفاعل مع مكونات غشاء الخلية مثل نسبة الكولسترول في الدم يمكن أن تؤثر على إشارات الخلية ومما قد يؤثر على غشاء إعادة ختم آليات عند مقارنتها بالجروح الميكانيكية. معارفنا حول إصلاح الغشاء لا يزال محدودا ودراسات إضافية مطلوبة لإقامة إذا كان إعادة ختم الجروح الميكانيكية تختلف عن إعادة ختم عقب تشكيل المسام السمية. وهناك العديد من المزايا لاستخدام LLO. أولاً، يمكن أن تكون متزامنة الشروع في الضرر الغشاء برفع درجة الحرارة من 4 إلى 37 درجة مئوية. الثانية، وشكل LLO (ليست ملزمة بغشاء الخلية) القابلة للذوبان المجاميع لا رجعة فيه في الأس الهيدروجيني المحايدة و 37 درجة مئوية، وبالتالي الحد من الآثار السامة للخلايا ويلغي الحاجة إلى غسل الخلايا. وأخيراً، يمكن تعديل درجة الضرر باختلاف تركيز السم. ومع ذلك، حد من هذا التحليل هو تبديل درجة الحرارة بين 4 و 37 درجة مئوية، مما قد يؤثر على إليه إصلاح مثل النقل حويصلية والالتقام وسيولة الغشاء، بين العمليات الأخرى، التي تتأثر بدرجة الحرارة52، 53،54. من المهم التحقق من أن أية المانع الدوائية المدرجة في المقايسة لا تتداخل مع تشكيل المسام LLO عن طريق إجراء فحص انحلال الدم وجود المخدرات55(مقابل غياب). بسبب الاختلافات دفعة المحتملة في النشاط LLO، من المهم إعداد مخزون LLO التي كبيرة بما يكفي ل شاشة الفائق بأكملها55.

قمنا بتضمين استخدام الخلايا معربا عن الوهم هيستون-2-التجارة والنقل النووية المترجمة كوسيلة لتعداد الخلايا قبل وبعد مقايسة إصلاح الغشاء عن طريق التصوير المجهري تليها الآلي تحليل الصور. الأهم من ذلك، خلية ما يعادل التهم عبر شروط ولا تتغير الخلية التهم قبل وبعد المقايسة حركية بالغة الأهمية ك PI أو كثافات fluorescence كنابد لا يمكن بسهولة أن تطبيع. في الواقع، سيؤدي إلى اختلاف في عدد خلايا الاختلافات في درجة الضرر بتركيز معين من LLO، الذي لا يمكن تصحيحه لطريق التطبيع الأسفار بسبب الاختلافات في إعادة ختم الكفاءة (الشكل 7). لقد أظهرنا أن التعبير هيستون-2-بروتينات فلورية خضراء لا تتداخل مع الانبعاثات PI أو كنابد التأسيس أو الأسفار. على العكس من ذلك، لا تؤثر على إدماج PI أو كنابد تعداد الخلية على أساس التجارة والنقل. إذا كانت مجموعات أخرى من فلوروفوريس لاستخدامها، سيكون من اللازم لتقييم التداخل الطيفي المحتملة بين فلوروتشروميس، كما أنجز في هذا العمل. على الرغم من أن بي قد استخدمت على نطاق واسع لقياس الضرر الغشاء، نحن تبين أن كنابد بديلاً ممتاز الذي يسلك أعلى غلة الكم الأسفار، أسفر عن أكبر مجموعة ديناميكية مناسبة لوصف إعادة ختم الكفاءة.

Z-عامل وسمد أكد أن هذا التحليل على متانة اللازمة لإجراء التحليلات الفائق. حساب كفاءة ريسيلينج أداة حاسمة ويمكن الاعتماد عليها لتحديد عدد الزيارات المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نموذج الآثار المختلطة كأداة إحصائية لتقييم الزيارات داخل مقايسة واحدة. يجب أن تتضمن الخطة التجريبية replicates التقنية ثلاثة على الأقل إذا كانت الشاشة يمكن تكرارها عدة مرات. ينبغي أن تستخدم قوادروبليكاتيس إذا كانت الأدوات الإحصائية، مثل نموذج التأثيرات المختلطة، التي سيتم تضمينها في تجربة واحدة، أم لا سوف تتكرر. ينصح بذلك لأداء الشاشة عدة مرات، والتحقق من صحة النتائج عن طريق إجراء تجارب مكملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نقر الدكتور جيسي كوك (جامعة ولاية أوهايو) يرجى السماح لنا باستخدام برنامجه الكشف عن وضع متعددة لبعض التجارب الأولية. البحث عنها في هذه المقالة أيده بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة RO1AI107250 إلى سيبو ستيفاني. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 143، غشاء البلازما إعادة ختم، إصلاح الغشاء، ضمور العضلات، يوديد propidium، كاربوسيانيني الحمض النووي ملزم صبغ، تشكيل المسام السمية، ليستيريوليسين س
قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter