Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Abstract

Fizyolojik çalışma ortamlarında memeli hücreleri kez plazma zarı zarar görmesine neden mekanik ve biyokimyasal gerilmeler tabi. Bu zarardan karşılık olarak, karmaşık moleküler makineleri hızla bariyer fonksiyonu geri yüklemek ve hücre yaşam sürdürmek için plazma zarı yeniden mühürleyin. Bu alanda araştırma, 60 yaşında olmasına rağmen hala makine yeniden mühürlemeden hücre kapsamlı bir anlayış eksikliği. Hücresel bileşenleri belirlenmesi amacı ile bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme veya yeniden mühürleme, artırabilir uyuşturucu biz verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer floresans tabanlı yüksek üretilen iş tahlil geliştirdik Mikroplaka içinde kültürlü. Plazma zarı zarar için bir model sistem olarak bakteriyel gözenek oluşturan toksin listeriolysin O (LLO), büyük 30-50 nm çapında proteinaceous gözenekleri kolesterol içeren formlar hücreleri maruz membranlar. Isı kontrollü çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanımı hızlı ve hassas spectrofluorometric ölçümleri, aydınlık alan ve floresan mikroskopi görüntüleme yaşayan hücrelerin birlikte sağlar. Bir membran impermeant nükleik asit bağlama fluorochrome tarafından yayılan floresan yoğunluğu kinetik Analizi yaralama ve verimliliği yeniden mühürlemeden hücre hesaplama için izin hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden membran kapsamını yansıtır . Yapısal nükleer protein histon 2B, mikroplaka hesap numarasına olası değişimler için her şey bir floresan chimera hızlı ve için nihai sağlayan hücreleri numaralandırma için floresans mikroskobu görüntüleme sağlar farklı hücre popülasyonlarının tanımlaması. Bu yüksek üretilen iş tahlil ana bilgisayar genler için tarama yoluyla membran tamir mekanizmaları anlayışımızı genişletmek için beklenen veya exogenously eklendi güçlü bir araç bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme bileşikleri olduğunu.

Introduction

Memeli hücre mekanik, ozmotik ve biyokimyasal stres plazma membran bütünlüğü kaybı sonuçlanan, tabidir. Hızlı ve verimli yeniden mühürlemeden olmadan, hasarlı hücreleri hızlı bir şekilde programlanmış veya nekrotik ölüme yenik. 1960'lardan beri çabaları işlem yeniden mühürlemeden plazma zarı anlamak için onun işlev bozuklukları ile ilişkili yıkıcı sonuçları tarafından motive edilmiş. Nitekim, bacak-korse kas distrofisi, diyabet ve Chediak-Higashi sendromu gibi hastalıkların mutasyonlar gen kodlama dysferlin, gelişmiş glikasyondan son ürünleri imalatı ve kusurları nedeniyle eksik plazma zarı onarım için bağlantılı olmuştur lizozomal ticareti düzenleyici CHS1, sırasıyla1,2,3,4,5,6. Ancak, bugüne kadar membran anlayışımızı yeniden mühürlemeden hala sınırlı7var. İlk çalışmalar membran yeniden mühürlemeden ekstraselüler Ca2 + ile hasarlı plazma zarı8,9,10akını tarafından başlatılır gösterdi. O zamandan beri birkaç ayrı ayrı Ca2 +-hücreleri yeniden mühürlemek için önerilen bağımlı mekanizmaları. Yama hipotez yara yakınlık içinde birbirleriyle ve bir yama11,12,13,14davranmaya hasarlı plazma zarı ile hücre içi veziküller sigorta öneriyor. İkinci bir model o kalsiyum-bağımlı ekzositozu öneriyor organellerin yara adlı bir site sphingomyelin plazma zarı dış kitapcıktaki ceramide dönüştürür lizozomal enzim asit sphingomyelinase bültenleri. Bu ani değişiklik lipid bileşiminde hasarlı bölge15,16,17endositoz ceramide tahrik sonuçlanır. Son olarak, üçüncü önerilen mekanizma endosomal kapalı18plazma zarı bud dışa dönük vezikül oluşumu tanıtmak taşıma (ESCRT) için gerekli karmaşık sıralama için bir rol içerir. Proteinler, sadece sınırlı sayıda bu modelleri tespit edildi ve onların makine daha fazla aydınlatılmamıştır gerekir.

Burada biz verimliliği yapisan memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı zarar tabi önlemler rekombinant listeriolysin O (LLO)19aracılı bir yüksek-den geçerek tahlil tanımlamak. LLO fakültatif intraselüler patojen Listeria Monositogenez20,21,22 tarafından salgılanan gözenek oluşturan bir toksin (SFT) ve MACPF/CDC aittir (membran atak kompleksi, perforin, ve kolesterol bağımlı cytolysin) süper. MACPF çoğu memeli gözenek oluşturan proteinleri ise KGK özellikle bakteriyel toksinler bağışıklık savunma dahil kendi patojenik yaşam23tanıtmak için ana bilgisayar hücrelerine de zarar gram-pozitif patojenler tarafından üretilen. KGK suda çözünen monomer sentez veya kolesterol için bağlama dimer plazma zarı sunmak ve en fazla 50 alt birimleri prepore bir kompleks oligomerize. Karmaşık prepore sonra 30-50 nm çapı24,25,26,27' deki yayılan bir β-varil gözenek oluşturan lipid bilayer genelinde β-iplikçikleri eklemek için yeniden düzenler.  Bu iri gözenekli hücre içinde ve dışında Cerayanlar iyonları ve küçük hücresel bileşenleri izin; Yine de, bazı çalışmalar daha küçük boyutları gözeneklerin de kurulan28,29,30olduğunu önerdi. KGK arasında LLO yüksek üretilen iş analizleri31,32için elverişli geri dönüşü olmayan pH ve sıcaklık bağımlı toplama dahil benzersiz özelliklerini görüntüler. LLO 4 ˚C, onun bağlayıcı hücreleri, ancak karmaşık gözenek oluşumu için izin veren bir sıcaklık hücre kültür orta eklenebilir. Gözenek oluşumu inisiyasyon sonra toksin moleküllerin membran için formu reaksiyonlar, düzlemde verimli difüzyon ve konformasyon remodeling gözenek üretimi dahil izin 37 ˚C sıcaklığa yükselterek eşitlenebilir. Bu nedenle, sıcaklık, hücre hasarı kinetik anahtarı izleyen plazma zarı bağlı toksin miktarına bağlıdır. Önemlisi, çözünür LLO (plazma zarı bağlı değildir) sıcaklık ilişkisiz toksin molekülleri silsin gereğini azaltır ve zaman içinde membran hasar ölçüde sınırlar 37 ˚C ulaştığında hızla ve geri dönüşümsüz toplar. LLO kolesterol için bağlar ve gözenekleri kolesterol açısından zengin membranlar oluşturur, son olarak, bu tahlil memeli hücreleri geniş bir mükellef olduğundan. LLO esas olarak gözenek oluşumu ile sinyal konak hücre etkiler akılda tutmak önemlidir birkaç istisna dışında hangi gözenek bağımsız hücre sinyallemesi33,34,35,36 oluşabilir ,37,38,39. Bu nedenle, olamaz faaliyetleri membran onarım sürecini etkileyebilir sinyal o LLO hariç.

Bu tahlil doğrudan hücre pasif yaralı hücreleri girer ve nükleik asitler ile ilişkilendiren bir kez son derece floresan olur bir hücre impermeant fluorochrome (Örneğin, propidium iyodür) birleşme ölçerek yaralama ölçüde değerlendiriyor . Bu nedenle, fluorochrome hücre yaralama, gerçek zamanlı analiz izin deney boyunca hücre kültür ortamında muhafaza edilebilir. Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu toksin konsantrasyon ile artacak ve toksin verilen konsantrasyona kadar tüm gözenekleri kurulur ve hücreleri tamamen tamir veya doygunluk ulaşılıncaya kadar zamanla artacaktır. Hücre dışı Ca2 + membran gözenekler yoluyla akını yeniden mühürleme için olmazsa olmaz bir olaydır. Bu nedenle, resealing verimliliği dolaylı olarak hücre kültür Ca2 + (onarım izin veren koşul) içeren bir Ca2 +' yaralama için orta yaralama karşılaştırarak kanıtı-ücretsiz Orta (onarım kısıtlayıcı durumu). Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu hücre konsantrasyonu her iyi doğru orantılı olduğundan, aynı toplama bütün Wells, tohum hücrelere önemlidir. Her şey hücrelerde önce ve sonra hücre dekolmanı, yüzen olarak, toplanan hücre veri yorumu karmaşık hale floresans okuma belirsiz oluşmaz emin olmak için tahlil numaralandırmak önemlidir. Hücreleri numaralandırmak için lokalize nükleer histon 2B-GFP (H2B-GFP) ifade hücreleri bu tahlil kullanılmıştır. Isı kontrollü, çok modlu, 37 ° C'de yaşam hücrelerinin mikroskopisi görüntüleme (96 veya 384-şey plaka biçimini kullanarak) hızlı, yüksek üretilen iş ölçümler floresans yoğunluklarını Mikroplaka Okuyucular birleştirmek İkinci hücre sayı saymak ve farklı hücre popülasyonlarının nihai oluşumu gözlemlemek için kullanılabilir.

Sonuçta, bu tahlil kullanıcılar tarafından tarama için ana bilgisayar molekülleri onların bilgi membran tamir mekanizmaları karmaşıklığı genişletme yeteneğini sağlar veya membran denetleyebilen exogenously eklenen bileşikler onarın. Aşağıdaki protokol için LLO maruz hücreleri resealing verimliliğini ölçmek için deneysel adımları açıklar ve verilen ilaç ya da yeniden mühürlemeden verimliliği hücresel tedavi etkilerini değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlık

  1. Hücre kaplama
    Not: İnsan servikal epitel hücreleri, HeLa ve histon 2B-GFP (H2B-GFP), ifade HeLa Bu protokol için kullanılan, ancak bu tahlil için diğer memeli hücreleri19adapte edilebilir.
    1. Yapisan bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 0.25 tripsin-EDTA 2 mL hücrelerle yıkayarak bağlantısını kesin. Kullanılan tripsin taze tripsin-EDTA %0.25 2 mL ile değiştirin.
    2. Hücreleri yuvarlak ve balonun müstakil kadar 5 min için 37 ˚C hücreleri kuluçkaya.
    3. 8 mL büyüme orta (DMEM % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin içeren) hücrelerde resuspend.
    4. Bir hemasitometre ve hücre süspansiyon 10 µL kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.
    5. 2. 5 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon büyüme ortamına hücrelerde sulandırmak.
    6. Hücre süspansiyon steril pipet Havzası dökün ve bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süspansiyon iyice karıştırın.
    7. 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, HeLa hücreleri (2. 5 x 104 hücreleri/100 µL/iyi) nüsha (veya quadruplicate) bir 96-şey düz, açık alt, siyah polistren doku kültürü tedavi tabağına dağıtın.
      Not: Bir kaplama düzenleme Şekil 1' deki bir örnek olarak sunulur.
    8. Hücreleri oksijen hücre kültür kuluçka 37 ˚C ve % 5 CO224 h için kültür.
  2. Hisse senedi eriyik hazırlığı
    1. Hanks dengeli tuz solüsyonu, 0.476 g MgCl2 (5 mM), 95 gr ekleyerek 10 x stok arabelleği (M1 ve M2 hazırlamak için kullanılır) M 1 L hazırlamak ve HEPES (100 mM) 23.83 g 900 mL su için. 1 L. filtre sterilize birime yükseltmek ve pH 7.4 için ayarlayın.
    2. 50 mL 50 (1.25 M) stok glikoz x 11,26 g D-(+) ekleyerek hazırlamak-glikoz toplam 50 mL su için. Filtre çözümü sterilize.
    3. Bir 100 (120 mM) stok kalsiyum x 50 mL 50 mL su için toplam CaCl2 0.666 g ekleyerek hazırlayın. Filtre çözümü sterilize.
    4. 10 (50 mM) stok etilen glikol-bis(2-aminoethylether)-N, N, n x 50 mL hazırlamak ', N', EGTA, 0.951 g 40 mL su ekleyerek tetraacetic asit (EGTA). PH 8 EGTA çözülmeye NaOH kullanarak artırmak, sonra 50 mL birime yükseltmek. Filtre çözümü sterilize.
    5. Tek bir 96-şey plaka için orta 1 50 mL hazırlamak (M1, içeren Ca2 +), Orta 2 50 mL (M2, Ca2 +-özgür) ve orta EGTA ile buna göre takıma 2 15 mL:
      1. M1 için 10 x arabellek M, 100 x CaCl20.5 mL ve 50 x glikoz 1 mL 5 mL 43,5 mL su ekleyin.
      2. M2 için 10 arabellek M x 5 mL ve 1 mL 50 x glikoz 44 mL su ekleyin.
      3. M2/EGTA için 10 x arabellek M ve 10 1,5 mL 1,5 mL ekleyin x EGTA 12 mL su için.
        Not: tüm çözümler propidium iyodür (PI) içeren hücrelere doğrudan eklemeden önce hazırlanmalıdır.
  3. Plaka okuyucu/görüntüleme sitometresi ayarları
    Not: iki algılama birimleri ile donatılmış bir Multi-Mode plaka okuyucu kullanın: bir spectrofluorometer ve bir görüntüleme sitometresi. Photobleaching fluorophores önlemek için floresans maruz kalma sınırı.
    1. 37 ° c plaka okuyucu tahlil yapmadan önce önceden ısıtmak.
    2. Buna göre kinetik tahlil için parametreleri ayarlamak içinde ayarları modu:
      1. Monokromatör, FL (floresan)ve kinetik için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okuyun.
      2. Dalga boyu ayarları' nın altında bir 9 ve 15 nm uyarma ve emisyon bant, seçmenizi sağlar. Propidium iyodür (PI) kullanarak deneyleri için uyarma ve emisyon dalga boylarında sırasıyla 535 ve 617 nm için ayarlayın.
      3. Plaka türü' nün altında 96 Wells için plaka formatı ve siyah-duvar açık alt plaka için karşılık gelen önceden ayarlanmış plaka konfigürasyonu seçin.
      4. Okuma alanıaltında kinetik incelenecek wells vurgulayın.
      5. Devresel_ödeme ve optikaltında belgili tanımlık birden parlamak 6 okuma başına önceden ve alttan okumaiçin kutuyu işaretleyin.
      6. Zamanlamaaltında 00:30:00 30 dk kinetik tahlil için Toplam çalışma süresi kutusuna ekleyin ve 00:05:00 aralığıiçin ekleyin.
        Not: her zaman için gelin ve bir dalga boyu, okuma, bir tam 96-şey plaka zamanı 30 s.
      7. Sağdaki Ayar bilgileri belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam' ý seçin. Kinetik başlatmak için basın okuma çalıştırın.
    3. Buna göre görüntüleme parametreleri ayarlama içinde ayarları modu:
      1. Minimax, görüntülemeve son nokta için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okumak.
      2. Dalga boylarındaaltında ışık iletilenve ya da her ikisi 456/541 uyarma ve emisyon boyları için karşılık gelen floresans kutularını seçin nm (GFP) ve 625/713 nm (PI).
      3. Aynı seçenekleri 1.3.2.3 ve 1.3.2.4 adımlarda tanımlanan Plaka tipi ve Okuma alanı için kullanın.
      4. De alan ayarıaltında yansıması için bir kuyu içinde sitelerin sayısı seçin.
        Not: 12 siteleri tam iyi resim karşılık gelir.
      5. Görüntü alma ayarlarıaltında ışık, 541 (GFP) ve 713 (PI) aktarılan pozlama süreleri seçin. GFP için iyi bir pozlama süresi 20 ms/görüntü ile tüm görüntü. İçin iletilen ışık (TL) ve PI floresan, sırasıyla her şey Merkezi'yle pozlama süreleri 8 ile 20 ms, tek bir görüntü elde etmek.
      6. Sağdaki ayarları bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam' ý seçin. Satın alma için her şey (12 resimler/de) bir 96-şey plaka tüm yüzey düşsel ve bir dalga boyu için ~ 15 dk. görüntüleme başlatmak için basın okuma zamanı.
        Not: Bir tek görüntü/iyi bir 96-şey plaka satın alma saati için bir dalga boyu ~2.5 min/plaka gerektirir. Yukarıda açıklanan parametreleri belirli ekipmanları bizim laboratuvar ile karşılık gelir. Spectrofluorometric ölçümler: 1.0 nm artış uyarma dalga boylarında (250-850 nm) ayarlanabilir bir 9-15 nm bant ile görüntüleme bir xenon flaş lamba bir photomultiplier tüp bulmak > 6 ile oturum dinamik alan ve ayarlanabilir 15 veya 25 nm salma bant. Sitometresi görüntüleme: bir aydınlatma ışık kaynağı beyaz ışık, 460 yetenekli nm ve 625 nm uyarma boyları 20 nm bant, 541 merkezli emisyon filtreleri ile nm (108 nm bant) ve 713 nm (123 nm bant), sırasıyla, bir 4 X amaç birleştiğinde bir 1,25 megapixel 12-bit şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi.

2. tahlil

Not: tahlil zaman hücrelerin % 70-90 birleşmesi olması gerekir. Yıkama adımları sırasında Orta kaldırıldı ve oldukça (doğrudan üzerinde hücreler) yan duvarına uygulanan gerekir. LLO sıcaklıkta onun toplama kadar adım 3.1.5 önlemek için < 4 ˚C korumak.

  1. 30 µM PI M1 stokunun hazırlamak ve 30 µM PI m2 hisse senedi 37 ˚C önceden ısıttı.
  2. Plaka 1 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları, aşağıdaki gibi kullanarak hücreleri nazikçe yıkayın:
    1. Onarım keyfi koşulları için hücreleri 200 µL/iyi M1 ile iki kez önceden 37 ˚C ısındı büyüme orta ve yıkama kaldırın. Orta 100 µL/30 µM PI içeren kuyu ile sıcak M1 değiştirin.
    2. İçin kısıtlayıcı koşullar onarmak, büyüme orta kaldırmak ve 5 mM 200 µL/iyi M2 ile bir yıkama ardından Ca2 +, şelasyon yapın EGTA içeren hücreleri 200 µL/iyi sıcak M2 ile yıkayın. 30 µM PI içeren orta 100 µL/iyi sıcak M2 ile değiştirin.
    3. Büyüme orta yıkanmış ve propidium iyodür içeren orta yerine sonra doğrudan 2.1.3 adım taşıyın.
  3. Görüntü plaka 1 iletilen ışık, GFP ve PI altında 1.3.3 (önceden kinetik) altında ayrıntılı olarak. Bu adım 15-20 dakika sürer.
  4. 2.1.3. adımda 15dk döneminde plaka 2 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları aşağıdaki gibi kullanarak hazırlayın:
    1. 96-şey yuvarlak alt Polipropilen Mikroplaka buza koyun. 1 (Şekil 1) plaka için karşılık gelen bir deneysel tasarım kullanarak plaka yapılandırın.
    2. Onarım keyfi koşulları için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren kuyusu buz gibi M1 eklemek µL/4 x LLO veya denetim için içeren kuyusu buz gibi M1.
    3. Onarım kısıtlayıcı koşullar için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren iyi buz gibi m2 eklemek µL/iyi buz gibi m2 4 x LLO veya denetim için içeren.
  5. Hemen plaka 1 (2.1.3. adım) görüntüleme sonra buz, buz ile doğrudan temas plaka ayırmak için alüminyum folyo kullanarak yerleştirin. Plaka 1 5 dakika soğumasını sağlar.
  6. 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, 100 µL plaka 2 (adım 2.1.4) karşılık gelen kuyu 1 plaka içine her kuyudan transfer. Düzgün toksin plaka 1 medya dağıtmak için menisküs aşağıdaki ipuçlarını yerleştirin ve nazikçe kabarcıklar tanıtımı olmadan ses çıkarma.
    Not: Bu yanlışlıkla hücreleri ayırmak gibi yukarı ve aşağı, pipet değil.
  7. Toksin hücrelere bağlamak ve hemen spectrofluorometer modu (adım 1.3.2) kullanılarak kinetik tahlil için plaka okuyucu için plaka 1 aktarmak izin vermek ek bir 1 dk plaka bırakın.
  8. Kinetik tahlil sonunda görüntü plaka 1 (sonrası kinetik) kullanarak hemen adım 1.3.3.

3. analiz: Hücre numaralandırma

  1. Mikroplaka hücre numaralandırma yazılımını kullanarak nükleer floresans üzerinde temel hücre sayısını belirler.
    1. Ayarları, içinde Re-analizseçin ve Görüntü analiz ayarları içinde Kategori bölümünde Gizli nesne çözümleme 541 nesneleri bulmak için dalga boyu kullanarak seçin.
    2. Yöntem, bulgu görüntülerde çizmek kullanarak nesneleri bul seçeneği içinde çekirdek ayarları sekmesinde seçin ve Uygulatuşuna basın.
    3. Tamam ve okuma algoritması sayma hücre başlatmak için tuşuna basın.
  2. Alternatif olarak, böyle bir aracı kullanılabilir durumdaysa, hücreleri numaralandırmak için ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanın.
    1. ImageJ içinde bir yığın görüntü dosyasını açın.
    2. Yığın görüntü menü çubuğu, türü, üzerine getirin'ı tıklatarak 8 bit gri tonlamalı görüntülere dönüştürmek ve 8-bitseçin.
    3. Arka plan çıkarmak: tıklayın görüntü menü çubuğunda hover üzerinde ayarlamave Parlaklık/kontrastseçin. Arka plan gürültü çıkarmak ve Uygulaseçmek için en düşük değer ayarlayın.
    4. İkili görüntüler oluşturmak için eşik: menü çubuğunda tıklayın görüntü üzerinde ayarlamaüzerinde ve eşikseçin. Koyu arka planseçin, minimum ve maksimum eşik değerlerini ayarlayın ve Uygula' yı tıklatın.
    5. Çekirdeklerin üst üste söz konusu olduğunda, bir dönüm noktası aracı segment çekirdekler için kullanılabilir. Menüde, ikili üzerine getirin işlemi ' ı tıklatın ve dönüm noktasıseçin.
      Not: Bu otomatik olarak bağlı çekirdeği ayıracak.
    6. Kullanıcı tarafından belirtilen ölçütü (boyut ve döngü) çekirdeği tanımlaması rafine ve hücre artıkları dışlamak için uygulama tarafından maskeli görüntüleri analiz.
      1. Analiz üzerinde menü ve ardından Çözümle parçacıklar' yi tıklatın. İstediğiniz boyuta ayarla (piksel ^ 2) ve (1 değeri olan tam bir daire) Döngüsellik aralıkları tek tek hücreler/çekirdek dahil etmek yeterlidir.
      2. Göster açılır liste kutusunda, istediğiniz seçenekleri seçin, özetlemekontrol ve hücre sayısı elde etmek için Tamam ' ı tıklatın.

4. analiz: Kinetik eğrileri

  1. Kinetik plaka okuyucu yazılımı bir analitik veri yazılım baðlamanýz gerekebilir.
  2. Deneysel her koşul için çoğaltır karşılık gelen standart sapma ve deneysel her koşul için Ortalama, standart hata ile birlikte her timepoint, floresans yoğunluklarda ortalama.
  3. Deneysel her koşul için karşılık gelen kinetik eğrisi izleme: PI yoğunluğu (y ekseni) zaman (x ekseni) karşı.
  4. Verilen tedavi durumu resealing verimliliğini hesaplamak için (AUC) eğri altındaki alan hesaplamak + LLO M1 (AUC(M1)) ve + LLO m2 (AUC(M2)). Yeniden mühürlemeden verimliliğini (E) değerlendirmek için aşağıda önerilen yaklaşım kullanın:
    Equation
  5. Verimlilik oranı (REff) aşağıda belirtilen malzemelerini kontrol ve test tedavi arasında bir karşılaştırma gerçekleştirir:
    Equation 2
    REFF = 1, test tedavi onarım üzerinde hiçbir etkiye sahip
    REFF < 1, test tedavi engeller onarım
    REFF > 1, test tedavi artırır onarım
  6. Aşağıdaki denklemi kullanarak eğri altındaki alan hesaplar:
    Equation 3, nerede k takipler toplam sayısı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doğruluk sayma hücre: HeLa hücreleri sık sık bir modeli memeli hücre satır olarak membran tamir mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. Membran onarım hücre nüfus düzeyinde değerlendirirken, aynı toplama için uygun verileri yorumlama bütün Wells, plaka hücrelere önemlidir. Tahlil zamanda cep numaraları kuyular arasında eşdeğer olduğunu doğrulamak önemlidir. Yapısal GFP (H2B-GFP) erimiş histon 2B hızlı HeLa hücreleri floresan onların çekirdekleri tespiti dayalı hücreleri otomatik olarak numaralandırmak için bu tahlil duyurdu. Doğruluğu hücre numaralandırmasında kurmak için iki kat seri dilutions HeLa H2B-GFP hücre onaylatılacak bir 96-şey plaka ve kültürlü 4 h için kaplama. Bu kadar süre hücre eki için yeterlidir ve sınırlı hücre bölünmesini sağlar. Tam wells (TL) iletilen ışık altında yansıma ve GFP floresan aydınlatma ve hücre sayımları GFP floresans plaka okuyucu analiz yazılımı (Şekil 2A ve 2B) kullanarak dayalı değerlendirildi. Ortalama hücre sayımları ± standart sapma konsantrasyonları tohum hücre karşı çizildi ve en uygun bir çizgi tohum, (Şekil 2C) sayma doğruluğunu gösteren hücre için hücre sayısı 1.08:1 oranında belirtti. Tüm kinetik bir tahlil önce Wells Imaging tarafından bu hücre sayıları arasında bütün wells tutarlı sağlanmış olur. Ayrıca, sonra kinetik tahlil wells Imaging tarafından bir zehir maruz hücre dekolmanı neden olmadığını kurabilirsiniz.

GFP ifade propidium iyodür (PI) yoğunluk ölçümleri ile (ıPI) karışmaması: H2B GFP nükleer Derneği PI birleşme veya PI floresan yoğunluğu ölçümü (ıPI), benPI ile müdahale değil emin olmak için sinin HeLa ve HeLa H2B-GFP hücrelere veya değil, 1 karşılaştırıldığında nM LLO (Şekil 3). PI yokluğunda, arka plan floresans HeLa ve HeLa H2B GFP GFP PI floresans emisyon filtrelerden akmaz gösteren, benzer şekilde düşük düzeyde vardı. PI, ama LLO yokluğu, huzurunda bir benzer bazal PI floresans emisyon HeLa ve zaman içinde değişmedi HeLa H2B GFP oldu. Bu GFP ifade PI floresans ölçümü etkilemez doğruladı ve PI deneme zaman dilimi içinde sigara hasarlı hücreleri nüfuz etmez belirtti. LLO ilavesi PI floresans HeLa ve HeLa H2B-GFP benzer zaman içinde artış sonuçlandı. Nükleik asitler ile PI Derneği ile birlikte LLO tarafından hücre yaralama nedeniyle artmasıdır. Birlikte, bu sonuçlar histon-2B-GFP ifade PI birleşme veya onun floresans ölçümü etkilemez kurmak.

PI floresans GFP tabanlı hücre sayımı ile karışmaması: karşılıklı, PI nükleer birleşme yaralı hücrelerdeki GFP tabanlı hücre sayımı ile müdahale değil doğrulamak önemliydi. HeLa ve HeLa H2B-GFP temsilcisi floresans görüntülerini maruz için 1 nM LLO PI huzurunda beklenen (4A rakam) olarak yazı kinetik PI yaralı hücrelerdeki işaretli bir birikimi olduğunu gösterdi. Görüntüleme Ayrıca PI GFP floresans algılama (4A şekil ve Tablo 1) kan kaybından saptandı. Bu floresan crossover GFP ifade değil, ama hala yeşil flüoresan çekirdeği (Şekil 4A) görüntülenen HeLa hücreleri sonrası kinetik görüntülerde en iyi takdir edilmiştir. Bu crossover Ayrıca GFP floresan yoğunluğu (ıGFP) ölçüm tarafından önemli ölçüde sonrası kinetik önceden kinetik (Şekil 4Biçin) karşılaştırıldığında artış HeLa H2B-GFP hücrelerdeki kanıtı. Önemlisi, PI floresans crossover segmentasyon işlem çekirdeği sabit listesinde yer alan bir artış GFP Floresan (Şekil 4 c) tarafından etkilenmez çünkü hücre sayımı etkilemez.

Plazma zarı verimliliği yeniden mühürlemeden ölçme: Bu bölümde, biz temel metodoloji membran yeniden mühürlemeden verimliliğini ölçmek için kullanılan mevcut. Membran yeniden mühürleme işlemi kanıt, HeLa H2B-GFP hücreleri, ya da değil, 1'e sinin nM LLO (M1) varlığı veya yokluğu (M2) hücre dışı Ca2 + (Şekil 5). , LLO, yokluğunda beklendiği gibi benPI M1 ve M2 sabit kaldı. LLO ek olarak Ca2 +-orta içeren sabit bir artış, hücre dışı Ca2 +yokluğunda vardı oysa PI floresan, önemli ölçüde dik bir artış kadar PI floresan yoğunluğu (ıPI), sonuçlandı yansıtan membran yeniden mühürlemeden olmadığında. M1 M2 göre onarmak için kapasite hücre olarak tanımlanan resealing etkinliğini değerlendirmek için (adım 1.5.4.1), M1 ve M2 eğrileri (AUC) altındaki alan tespit ve onarım (E) verimliliğini 0.287 olmak hesaplanmıştır.

PI alternatif: PI ubiquitously kullanılan plazma zarı hasar avans olarak. Ancak, aynı zamanda bu tahlil için uygun olan diğer nükleik asit bağlama boyalar vardır. Örneğin, bir membran impermeant carbocyanine nükleik asit bağlama (CNABD) sergiler bir emisyon spektrum kadar kırmızı ulaşan boya ve bir yüksek özgüllüğü çift iplikçikli DNA örneği almak için vardır. PI öte yandan DNA ve RNA40,41bağlar. PI, uyarma ve CNABD emisyon spectra değil üst üste iki fluorochromes arasında daha iyi spektral çözünürlüğü için izin GFP olanla. Ayrıca, bu protokol için kullanılan CNABD bir tükenme katsayısı neredeyse iki kez bu onların anılan sıraya göre uyarma boyları için bu boya PI daha enerji emici daha yetenekli bir daha güçlü floresans emisyon kaynaklanan demektir Pi vardır. Bu boya bir büyük floresans Dinamik Aralık, sergiler gösterdi CNABD ve GFP görüntülerin kantitatif floresan Analizi önemli ölçüde GFP floresans dalga boylarında yayarlar değil ve hücre sayısı (Şekil 6A-D) etkilemez. Nitekim, HeLa H2B-GFP hücreleri içeren CNABD M1 veya M2 ortamda inkübe ve 1 tarafından zarar görmüş nM LLO sergilenen bir 4 ve 5.5 kat artış benCNABD hasar olmayan denetimleri göre sırasıyla (Şekil 7A). Karşılaştırma için hücreleri maruz için 1 nM LLO PI huzurunda sergilenen bir 2.5 ve 3 kat artış M1 ve M2, PI floresan yoğunluğu içinde sırasıyla (Şekil 5). PI, M1 LLO konsantrasyon artan ile floresan yoğunluğu artan CNABD sergiler gibi (Şekil 7A), ve elde edilen onarım verimliliği 1.5.4.1 (Şekil 7B) adımda anlatıldığı gibi hesaplanmıştır. Bunu LLO konsantrasyonu arttıkça verimliliği azaltır yeniden mühürlemeden hücre rapor. Bu olay hücre aşırı hasar neden olduğu zaman yeniden mühürlemek için kapasitelerini azaltmak gerçeği yansıtır.

Membran onarım testin kalite değerlendirmesi: onun sağlamlık veya algılayıp negatif ve pozitif denetimleri arasındaki farklılıkları için yetenek önemli bir özelliği, herhangi bir tahlil olduğunu. Pozitif ve negatif denetimler arasındaki sinyal varyasyon yeterli dinamik alan ve tekrarlanabilirlik görüntülemeniz gerekir. Bu membran onarım yöntemi, pozitif ve negatif denetimleri LLO onarım keyfi (M1) ve onarım kısıtlayıcı (M2) koşullarında, sırasıyla maruz hücrelerdir. İki yaklaşım bu tahlil yüksek üretilen iş analizi için sağlamlık değerlendirmeye alınmıştır. Belirli bir koşullar kümesi bir büyük sağlayıp sağlamayacağını Z-faktör veya pencere katsayısı, eleme önce belirler muhasebe sinyal değişkenliği için süre yeterli dinamik aralığı. Z-faktörler aralığı 0 içinde < Z ≤ 0,5 ve 0,5 < Z ≤ 1 karşılık gelen bir kabul edilebilir ve çok iyi tahlil için sırasıyla42,43. Kalite değerlendirmesi için Z-faktör kullanımının bir test koşulları genellikle aşırı pozitif ve negatif kontrollere göre daha ılımlı değerlerini sergilemek kısıtlamadır. Bu nedenle, ikinci bir yaklaşım olarak Aksi takdirde bir nitelikli Z-faktör44 dayalı negatif sonuç olarak kategorize deneysel koşullar arasındaki farklılıkları tanımlamak kesinlikle standart ortalama fark (SSMD, β), hesaplanan ,45. SSMD değerleri etkisi gücü hiçbir etkisi değişen içine kategorize (β = 0) için son derece güçlü (β ≥ 5). M1 M2 koşullara karşı karşılaştırma için Şekil 7A ve AUC verileri kullanarak, 0,25 ve 0.5 nM LLO maruz üretilen Z-faktörü değerleri 0.3100813 ve 0.137313 ve β = 6.0672 ve 4.803308, sırasıyla, LLO konsantrasyonları bir pencere olduğunu belirten tahlil için uygundur. LLO konsantrasyonu 1 arttıkça nM, gap ıCNABD M1 ve M2 koşullar arasında kinetik eğrileri kapatır büyük ölçüde azaltılmış Z-faktör ve SSMD değerleri (Şekil 7B) kaynaklanan. LLO böyle yüksek konsantrasyonda onarım potansiyel hasar tarafından outweighed ve böylece tahlil faktörler membran tamirde katılan belirlenmesinde kullanımı olumsuzlar koşullarına karşılık gelir. Bu daha fazla onarım verimliliği (E) LLO konsantrasyonu arttıkça (Şekil 7B) düşüş gösterilmiştir. Tüm verileri (Z-faktör, SSMD ve E) 3 biyolojik çoğaltır ile oluşturulan ve tahlil doğrulama için deneysel koşul başına 3 Teknik çoğaltır. Birlikte, bu tahlil LLO konsantrasyonları 1 olarak aşağı ile yüksek-den geçerek tahlil için beklenen sağlamlık vardır bu verileri göstermek için HeLa hücreleri nM.

İlke kanıtı: bir kez tahlil sağlamlık kuruldu, biz ek deneyler bu tahlil duyarlılık ve onarma işleminin bir üründe tanımlamak için çözünürlüğü vardır ilkeli bir kanıtı olarak gerçekleştirilen. Ayrıca, "sayısı" 3'den az biyolojik içerebilir büyük ekran içinde tanımlamak için bir tarama süreci çoğaltır gibi yüksek üretilen iş deneyleri kullanılır kabul. Böylece, ilgili deneysel tasarım içinde tek bir tahlil "sayısı" tanımlamak için algılama gücü sağlar. Bu nedenle, yüksek üretilen iş ekran altında tahlil düzeni tek bir deneyde istatistiksel gücünü artırmak için 4 Teknik çoğaltır karşılamak için ayarlanabilir. Hücrelerin içinde quadruplicate kaplama ve önceden tedavi 1 h önce desipramin, plazma zarı tamir15,17 ' bir rol oynayan lizozomal proteini asit sphingomyelinase (ASM) bir farmakolojik inhibitörü ile tahlil edildi ,46. Önemlisi, desipramin tedaviyle hücre sayımları bırakmak desipramin tedavi ve tedavi hücreleri (8A rakam) arasında uygun karşılaştırma için tahlil boyunca etkilemedi. ASM desipramin tedavi hücrelerdeki inhibisyonu verimliliği üzerine LLO, maruz E ve REff (Şekil 8B ve 8 C) düşüş gösterildiği gibi yeniden mühürlemeden membran bir üründe sonuçlandı. Karışık etkileri modeli kullanarak, bir karşılaştırma desipramin-0,25 ve 0.5 nM LLO M1, 0.0010 ve 1 x 10-10, p-değerleri sırasıyla gösterdi maruz olmayan tedavi hücreleri tedavi. Birlikte, verileri belirtmek 0,25 ve 0.5 nM LLO olan bir yüksek-den geçerek Deneysel ortamda onarım hataları tanımlamak için uygun konsantrasyonlarda, bir kez tek bir deneme mümkün istatistiksel analizleri ile teknik çoğaltır dört artmış bulunmaktadır . Karışık etkileri modeli istatistiksel bir yaklaşım quadruplicate arasında olası varyasyon birden çok biyolojik çoğaltır hesap olacaktır değil olduğunu unutmayın. Bir biyolojik çoğaltma kullanarak herhangi bir önemli bulgular ek deneysel ayarlarında doğrulanması gerekir.

Figure 1
Şekil 1: deneysel tasarım. Akış diyagramı yedi test koşulları ile karşılaştırıldığında kontrol hücreleri olmayan tedavi etkisini test etmek için yapılandırılmış bir temsilcisi plaka tasarım gösteriyor. Ek denetimler uygunsa örnek uyuşturucu araçlar dahil edilmelidir. Hücrelerin kaplama (1) 24 h deneme önce plaka. Deneme günü, Plaka 1 hücrelerde 37 ° C'de önceden ısınmış M1 veya M2 orta ile yıkanır ve görüntülü (TL, GFP ve PI floresan) plakadır önceden kinetik. Görüntüleme, reaktifler sırasında 15dk buza plaka 2 eklenir. Görüntüleme sonra plaka 1 hemen buz 5 min için yerleştirilir ve 100 μL/iyi plaka 2 1 plaka aktarılır. Plaka 1 30 dk (TL, GFP ve PI floresan) görüntüleme tarafından takip için 37 ° C'de kinetik tahlil çalıştırmak için plaka okuyucu yerleştirilir. Veri sonra hücreleri saymak ve onarım verimliliği tüm deneysel koşullarda değerlendirmek için analiz edilir. Büyük veri kümeleri içinde analiz otomatik hale getirilebilir. Ayrıca, 4 yüksek üretilen iş ekranlarda teknik çoğaltır sayısı artırılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: hücre doğruluk sayım. HeLa hücreleri GFP öğesini histon 2B ifade belirtilen konsantrasyonlarda triplicates numaralı seribaşı. (A)hücreleri iletilen ışık (TL) altında 37 ° C'de görüntüsü ve GFP Floresan (12 resimler/de) ve bir hücre algılama algoritması (mor içinde) bireysel çekirdeği betimlemek için kullanıldı. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) daha yüksek büyütme TL, GFP ve hücre algılama (mor) görüntüleri (yakınlaştırılmış 2 X) =. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (C) görüntü analiz yazılımı hücreleri ve hücre sayımları ilk karşı çizildi saymak için kullanılan tohum toplama hücre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Propidium iyodür floresans ölçüm histon 2B-GFP deyim tarafından etkilenen değil. Histon 2B-GFP ifade ve HeLa hücreleri olmayan ifade maruz, ya da değil, 1'e nM LLO varlığı (düz çizgiler) veya Ca2 +30 mikron PI (kesikli çizgiler) yokluğu-Orta (M1) içeren. Kinetik tahlil PI floresans yoğunluklarını spectrofluorometry 37 ° C'de 30 dk için her 5 dk tarafından ölçülen Veri çoğu ifade göreli floresans birimleri (RFU) ± SEM ortalama PI floresan yoğunluğu (ıPI) (n = 3 bağımsız deneyler, her triplicates içinde gerçekleştirilen). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: hücre numaralandırma PI floresans tarafından etkilenmemiş. (A)temsilcisi öncesi ve sonrası kinetik görüntüler (TL, PI ve GFP) maruz hücre veya değil, 1 nM LLO M1 içinde. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) kantitatif floresan mikroskopi analiz (benGFP± SEM) artan GFP floresans ölçüm hücre LLO (sonrası kinetik) yaralama üzerine PI nükleer birleşme nedeniyle ortaya çıkar. (C) hücre GFP tabanlı numaralandırma GFP yoğunluk artış etkilenmedi. Hücre sayısı iyi başına ortalama ± SEM ifade edilen (ın B ve C: siyah çubukları önceden kinetik veri; = kırmızı çubuklar sonrası kinetik veri =; n = 3 bağımsız deneyler, her triplicates içinde gerçekleştirilen; iki kuyruklu öğrenci t-testi kantitatif floresan çözümlemeye alınan görüntüleri, yoğunluk ve hücre sayımları ** p < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: plazma zarı verimliliği yeniden mühürlemeden ölçme. Histon 2B-GFP ifade HeLa hücreleri maruz, ya da değil, 1'e nM LLO Ca2 +-(M1) içeren veya Ca2 +-30 mikron PI içeren ücretsiz (M2) orta. PI floresan yoğunluğu (ıPI) kinetik verileri göstermek içinde göreli floresans birimleri (RFU) ± SEM, 37 ° C'de 30 dk için ölçülen n = 3 bağımsız deneyler, her triplicates içinde gerçekleştirilen. Resealing verimliliği 1.5.4 Protokolü adımda gösterildiği gibi ölçüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Carbocyanine nükleik asit membran yeniden mühürlemeden değerlendirmek için alternatif bir boya boya bağlama. HeLa H2B-GFP hücreleri maruz, ya da değil, 0,5 nM LLO Ca2 +1 mikron CNABD huzurunda 37 ° C'de 30 dk-(M1) içeren veya Ca2 +-ücretsiz (M2) orta. (A)görüntüleri, HeLa H2B-GFP hücreleri satın öncesi ve sonrası M1 kinetik boya içeren. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (B ve C) entegre CNABD ve GFP floresans yoğunluklarını görüntüleme sitometresi kullanılarak ölçüldü ve göreli floresans birimlerle ifade edilir (RFU) ± SEM (D) GFP floresans görüntüleri HeLa H2B-GFP numaralandırmak için işlenen hücreleri (siyah çubukları önceden kinetik veri, kırmızı çubukları = sonrası kinetik veri, n = 3 bağımsız deneyler, her triplicates içinde gerçekleştirilen =). İki kuyruklu öğrenci t-testi kantitatif floresan yoğunluğu çözümlemeye ve hücre sayar alınan görüntülerden ** p < 0,01, *** p < 0.001) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: verimlilik, Z-faktör ve SSMD yeniden mühürleme LLO konsantrasyon etkisi. (A)HeLa H2B-GFP M1 veya M2 içeren 1 mikron içinde CNABD inkübe hücreleri LLO konsantrasyonları artan maruz ve kinetik tahlil için 37 ° C'de 30 dk tabi Veri kalite değerlendirmesi membran onarım sağlamlık için hesaplanan göreli floresans birimleri (RFU) ± SEM (B) Z-faktör CNABD şiddeti (ICNABD) ve kesinlikle standart ortalama fark (SSMD) olarak ifade edilir tahlil, (AUC) eğri altındaki alan bir ölçü olarak için kinetik eğrileri42,43,44,45kullanarak. Resealing verimliliği Protokolü ve sonuçları bölümlerinde açıklandığı gibi hesaplanmıştır (n = 3 bağımsız deneyler, her triplicates içinde gerçekleştirilen). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: desipramin maruz hücre yeniden mühürleme içinde hataları neden olur. HeLa H2B-GFP hücreleri (quadruplicate içinde kaplama)-önceden tedavi ile 30 mikron desipramin (veya değil) için 1 h 37 ° C'de ve 0.25 veya 0.5 nM LLO Ca2 +1 mikron CNABD huzurunda maruz-(M1) içeren veya Ca2 +-ücretsiz (M2) orta. Hücreleri görüntüsü (öncesi ve sonrası kinetik) ve 30 dk.(a)hücreleri numaralandırılan için; 37 ° C'de kinetik tahlil tabi Ortalama hücre sayımları ± SEM (B) CNABD floresan yoğunluğu (ICNABD) göreli floresans birimleri (RFU) ± SEM (C) Resealing verimliliği varlığı ve yokluğu hesaplanan ifade edildiği şekilde veri ifade edilir desipramin. Bir karışık etkileri model teknik her çoğaltma için rasgele bir kesme noktası varsayarak günlük dönüştürülmüş yoğunluk değerleri üzerinde kullanıldı. Her iki üst karakter yakalamak ve kinetik eğrilerinin şekli değiştirmek için tedavi koşulu temel etkisi ve tedavi durumu ve saat arasındaki etkileşim etkisi ortaklaşa test edildi istatistiksel anlamlılık için. İki kuyruklu öğrenci t-testi hücre sayımları alınan görüntülerden analiz etmek için kullanıldı. P-değeri karışık etkileri modeli kullanılarak hesaplanır. (4 Teknik çoğaltır, bir deneme). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Görüntüleme sitometresi emisyon kanal özellikleri
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Yeşil kanal (ex / em ± bant, İstanbul) Kırmızı kanalı (ex / em ± bant, İstanbul)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tablo 1: Uyarma ve emisyon bandpasses için görüntüleme sitometresi GFP, PI ve CNABD uyarma ve emisyon tepeler ve yeşil ve kırmızı kanal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu tahlil membran hücre nüfus düzeyinde yüksek üretilen iş kapasitesi ile yeniden mühürlemeden etkinliğini ölçer. O-ebilmek var kullanılmış için hücresel bileşenleri veya membran onarım etkileyebilecek uyuşturucu kitaplıkları ekran. 96-şey plaka açıklanan tahlil kullanılan ama 384-şey plakalar için daha yüksek üretilen iş için uyarlanabilir. Floresans ölçümleri yapisan canlı hücreler aşırı hücre hücre dekolmanı, fiksasyon veya sonrası fiksasyon etiketleme floresans gibi işleme gerek kalmadan gerçek zamanlı olarak elde etmek için onun yetenek bu testin bir avantajdır. Multimod plaka okuyucu, bu protokol için kullanılan bir gibi zaman aralıklarında 30 düşük hızlı spectrofluorometric ölçümler için yeterli hassasiyeti var s 96-şey tabağı. Floresans görüntüleri edinimi hücre numaralandırma, nihai değişiklikler hücre morfolojisi ve farklı hücre popülasyonlarının potansiyel kimliği de dahil olmak üzere ek bilgi sağlar. Mevcut tahlil plazma zarı tek hücre düzeyinde yeniden mühürlemeden kinetik kurmak değil ama, olumlu veya olumsuz yönde, süreci etkileyebilir deneysel koşullar (farmakolojik bileşikleri veya hücresel bileşenleri) tanımlar membran hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden.

Birkaç diğer deneysel yaklaşımlar mekanizmaları yeniden mühürlemeden membran değerlendirmek için geliştirilmiştir. Örneğin, mekanik membran hasar modeli için mekanik bozulma microneedle ponksiyon, boncuk aşınma ve lazer ablasyon tarafından kullanılmıştır. Yaralama/onarım ölçümü floresan mikroskopi veya akış sitometresi floresan problar (FM 1-43, propidium iyodür, floresein Birleşik dextrans) giriş miktarının veya floresan protein chimeras47 izleme dahil olan ,48,49,50. Her bu yaklaşımların kendi avantajları vardır; Ancak, onlar bu tahlil sunulan canlı hücreler yüksek üretilen iş taraması mükellef değildir.

Mevcut tahlil hücreler plazma zarı mekanik yırtığı tarafından tahrik gibi büyük Ca2 + akını izin hangi formları iri gözenekli gözenek oluşturan protein tarafından LLO, yaralı resealing verimliliğini analiz etmek için optimize edildi. Her ne kadar gözenek oluşturan toksinler temsil eden bir form plazma zarı hasar, büyük toksin gözenekleri tamiri ve mekanik yaralar ortak Ca2 +paylaşmak için evlenme teklif-bağımlı yolları17,51. Kolesterol hücre sinyallemesi etkileyebilir ve böylece mekanik yaraları karşılaştırıldığında mekanizmaları yeniden mühürlemeden membran etkileyebilir gibi hücre zarı bileşenleri ile bu LLO etkileşim unutmamak gerekir. Bizim bilgi membran onarma hakkında hala sınırlıdır ve daha fazla çalışmaları mekanik yaraların yeniden mühürlemeden toksin gözenekleri oluşumu takip yeniden mühürlemeden farklıysa kurmak için gereklidir. LLO kullanmanın bir çok avantajı vardır. 4 sıcaklık 37 ° C'ye yükselterek membran hasarı inisiyasyon ilk olarak eşitlenmesi İkinci, LLO (hücre zarı bağlı değildir) çözünür şeklinde geri dönüşümsüz nötr pH ve 37 ° C, böylece sitotoksik efekt sınırlama ve hücreleri yıkama gerek abrogating toplar. Son olarak, hasar ölçüde toksin konsantrasyonu değişen tarafından ayarlanabilir. Ancak, bir bu tahlil sıcaklık şalter arada 37 ve 4 ° C, veziküler aktarımı, endositoz ve sıcaklık52tarafındanetkilenmiştir diğer işlemler arasında membran akışkanlık gibi tamir mekanizması etkileyebilecek kısıtlamasıdır, 53,54. Tahlil dahil herhangi bir farmakolojik inhibitörü LLO gözenekleri oluşumu ile uyuşturucu55(karşı devamsızlık) huzurunda hemoliz tahlil gerçekleştirerek engel yok olduğunu doğrulamak önemlidir. Potansiyel toplu farklılıkları nedeniyle LLO etkinlik, LLO kadar tüm yüksek üretilen iş ekran55için büyük bir hisse senedi hazırlamak önemlidir.

Biz önce ve sonra membran onarım tahlil mikroskobik görüntüleme ardından üzerinden görüntü analizi otomatik hücreleri numaralandırmak için bir araç olarak lokalize nükleer histon-2B-GFP chimera ifade hücreleri kullanımı dahil. Önemlisi, eşdeğer hücre koşullar arasında sayar ve değişmeyen hücre önce sayar ve kinetik tahlil PI çok önemli veya CNABD floresan yoğunluklarda kolayca cant sonra normalleştirilmiş. Gerçekten de, hücre sayısı bir fark zarar derecesini farklılıkları floresans normalleştirme verimliliği (Şekil 7) yeniden mühürleme içinde varyasyonlar nedeniyle üzerinden için düzeltilemez LLO verilen bir konsantrasyon tarafından neden olur. Histon-2B-GFP ifade PI veya CNABD birleşme veya floresan emisyon ile müdahale değil gösterdi. Diğer taraftan, PI veya CNABD birleşme GFP tabanlı cep numaralandırma etkilemez. Diğer fluorophores kullanılmak üzere oluşur, bu çalışmada gerçekleştirilen gibi fluorochromes arasında potansiyel spektral örtüşme değerlendirmek için gerekli olur. PI yoğun membran hasarı ölçmek için yolculuklarında uygulanmış olsa CNABD daha geniş bir dinamik aralığı verimliliği yeniden mühürlemeden karakterize için uygun sonuçlanan daha yüksek floresans kuantum verim, sergileyen bir mükemmel yerine olduğunu gösteriyor.

Z-faktör ve SSMD bu tahlil yüksek üretilen iş çözümlemesi için gereken sağlamlık sahip olduğunu doğruladı. Resealing verimlilik hesaplanması potansiyel sayısı tanımlamak için güvenilir ve kritik bir araçtır. Ayrıca, karışık etkileri modeli istatistiksel bir araç sayısı tek bir tahlil içinde değerlendirmek için kullanılabilir. Ekran birkaç kez yinelenebilen deneysel planı en az üç teknik çoğaltır içermesi gerekir. Bu tekrar olsun veya olmasın karışık etkileri modeli gibi istatistiksel araçlar tek bir deneyde, dahil edileceğini quadruplicates kullanılmalıdır. Bu ancak tavsiye edilir ekran birkaç kez gerçekleştirmek için ve tamamlayıcı deneyler yaparak sonuçları doğrulamak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Lütfen bazı ön deneyler için onun çok modlu algılama platformu kullanmak izin verdiğiniz için Dr Jesse Kwiek (Ohio Devlet Üniversitesi) anıyoruz. Bu makalesinde bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Stephanie Seveau için ödül numarası RO1AI107250 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 143 plazma zarı yeniden mühürleme membran onarım muskuler distrofi propidium iyodür carbocyanine nükleik asit boya bağlama gözenek oluşturan toksin listeriolysin O
Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter